專利名稱：利用重組鈍齒棒桿菌以葡萄糖為底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法
利用重組鈍齒棒桿菌以葡萄糖為底物一步法合成Y-氨基丁酸的方法技術領域
利用基因工程技術，構建安全高效的鈍齒棒桿菌工程菌。該菌以葡萄糖為底物一步法合成Y -氨基丁酸的方法，屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及基因工程重組鈍齒棒桿菌生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法。技術背景
Y-氨基丁酸是天然存在于某些生物體內的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質，具有抗焦慮、降血壓、鎮(zhèn)定安神、增強記憶、調節(jié)激素分泌、促進生殖、利尿，鎮(zhèn)痛等重要生理功能。在食品、飼料、醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用。2009年，衛(wèi)生部批準Y-氨基丁酸為新資源食品，這意味著Y-氨基丁酸在國內市場跨入了一個薪新時代。
目前，Y-氨基丁酸的制備主要通過化學合成法和微生物法，化學合成法反應條件劇烈，污染嚴重；微生物發(fā)酵法 條件溫和、安全、成本較低。在微生物發(fā)酵法中，最受關注的是通過谷氨酸脫羧酶(EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧來生產(chǎn)Y-氨基丁酸。在已報道的方法中，Y-氨基丁酸生產(chǎn)均需要添加外源谷氨酸作為底物，而谷氨酸是由糖質為原料經(jīng)微生物發(fā)酵，采用等電點提取，離子交換樹脂分離等方法制備獲得。因而添加外源谷氨酸在一定程度上增加了 Y-氨基丁酸的制備成本。
本實驗室篩選得到的一株高產(chǎn)精氨酸突變菌株鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum SYP,保藏編號CCTCC NO:M208133)，經(jīng)傳代5次后，獲得菌株SYPA5-5，其生長特性等與母體菌SYP基本一致。將SYPA5-5中的argB基因敲除后，獲得基因工程菌鈍齒棒桿菌E01。該工程菌缺少Y-氨基丁酸合成途徑，但能高效轉化葡萄糖為谷氨酸。另外，本研究室前期經(jīng)誘變篩選獲得一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GBO1-21 (中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏號:CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途徑，但具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，能高效催化Y -氨基丁酸的合成。
基于研究室前期研究基礎，本發(fā)明首先將精氨酸高產(chǎn)菌株鈍齒棒桿菌SYPA5-5精氨酸合成途徑的關鍵酶基因argB敲除，獲得一株能高效轉化葡萄糖為谷氨酸的工程菌鈍齒棒桿菌EOl。由于鈍齒棒桿菌缺少GABA合成途徑，本發(fā)明將植物乳桿菌GB01-21的谷氨酸脫羧酶基因克隆，于鈍齒棒桿菌EOl中進行表達，獲得了一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸合成Y-氨基丁酸的高效重組鈍齒棒桿菌。實現(xiàn)了無需添加外源的谷氨酸，直接經(jīng)葡萄糖一步法發(fā)酵合成Y-氨基丁酸，大大節(jié)約了 Y-氨基丁酸的制備成本。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于:敲除鈍齒棒桿菌SYPA5-5精氨酸合成途徑關鍵酶基因argB，獲得谷氨酸積累菌株鈍齒棒桿菌E01，將植物乳桿菌GB01-21的Y-氨基丁酸合成關鍵酶基因——谷氨酸脫羧酶基因進行克隆，于谷氨酸生產(chǎn)菌株鈍齒棒桿菌EOl中異源表達，獲得一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸高效合成Y-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌。該重組菌實現(xiàn)葡萄糖到Y-氨基丁酸的一步法生產(chǎn)。該發(fā)明為成功整合氨基酸代謝中優(yōu)質酶的生物功能，簡化Y-氨基丁酸的制備途徑，降低其合成成本提供了一條嶄新的思路。本發(fā)明的技術方案:以基因工程為手段，構建了一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸合成Y-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌。(I) 一株能以葡萄糖為底物，高效轉化Y-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌，其分類命名為 C.crenatum EOl/pGAD。(2)所述重組菌的構建方法，利用攜帶抗生素抗性與條件致死型標記sacB雙標記的新型整合型載體pK18mobsacB,通過兩次同源重組敲除鈍齒棒桿菌SYPA5-5精氨酸合成途徑關鍵酶基因argB，獲得工程菌鈍齒棒桿菌E01，再將Ipgad基因插入到載體pJC-tac，構建得重組質粒PGAD，電擊轉化鈍齒棒桿菌EOl，通過含有30 μ g/mL的卡那霉素抗性篩選，獲得目的重組菌株C.crenatum EOl/pGAD ；①鈍齒棒桿菌SYPA5-5argB基因的敲除根據(jù)GenBank中C.glutamicum ATCC13032 argB基因序列設計argB基因上下游以及中間引物，引物序列如下:PargBF:5，-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAGATTTPargBR:5，-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTGΡΔ argBR: 5，-CCCATCCACTAAACTTAAACACGGTTTAGCATCTCAΡΔ argBF: 5，-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGACTTGATTCCGGCATGA以鈍齒棒桿菌SYPA5-5基因組為模板，分別以PargBF和P Λ argBR、P Δ argBF和PargBR為引物PCR，獲得含21bp互補粘性末端的PCR產(chǎn)物，再以上述PCR產(chǎn)物為模板，以PargBF、PargBR為引物PCR，獲得基因內部缺失約500bp的缺失型基因Λ argB。Λ argB克隆后與線性化pK18mobsacB整合型載體相連構建重組質粒pK18mobsacB_ Δ argB。將驗證正確的質粒pK18mobsacB- Δ argB電擊轉化鈍齒棒桿菌SYPA5-5，經(jīng)LBG+Km固體培養(yǎng)基篩選，獲得第一次同源重組轉化子。再分別將目標轉化子在含蔗糖的培養(yǎng)基中進行脅迫二次重組篩選，最終在LBG平板上進行劃線分離并挑取多個轉化子。對發(fā)生第二次同源重組的菌株進行回復野生型/基因缺失型的鑒定。提取轉化子染色體，以目標基因argB的上下游引物進行PCR鑒定。鑒定正確的轉化子命名為鈍齒棒桿菌EOI。②植物乳桿菌GB01-21谷氨酸脫羧酶基因Ipgad的獲取根據(jù)NCBI 中植物乳桿菌 Lactobacillus pi ant arum subsp.plantarumST-1II (G1:308044682)全基因組核酸序列3254376bp中的谷氨酸脫羧酶基因序列，設計正反向引物 lpgad F SalI 和 lpgad R BamHI 以 L.plantarum GB01-21 染色體為模板，IpgadF、lpgad R為引物進行PCR擴增反應，獲得Ipgad基因，其全長1400bp。lpgad F Sail:5/ -CGCGTCGACATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3'lpgad R BamHI:5/ -GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3;PCR 采用 50 μ L 體系:10 X ExTaq Buffer5 μ L，dNTP4 μ L，模板 DNAl μ L，上下游引物各0.5 μ L，ExTaq酶0 .5 μ L，ddH20補齊至總體積50 μ LoPCR反應條件:94°C預變性5min ；94°C變性 50s，56°C退火 45s，72°C延伸 90s，35 個循環(huán)；72°C終延伸 lOmin，15°C IOmin0 獲得lpgad基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA。③重組表達載體pGAD的構建將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，反應體系如下:質粒pMD18_T0.5 μ L，目的基因5μ L，Ligation Solution5 μ L，混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接12_16h。轉化大腸桿菌JM109，提取質粒pMD18-T-lpgad，酶切驗證并測序。提取質粒pMD18-T-lpgad和表達載體pJC-tac，二者同時用Sal I/ BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物通過粘性末端連接，獲得重組質粒pGAD。④重組鈍齒棒桿菌的獲得重組質粒pGAD轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，使用30 μ g/mL卡那霉素抗性平板篩選陽性轉化子，重組質粒經(jīng)Sal I/BamH I雙酶切驗證，提取重組質粒pGAD。采用電擊轉化法，將重組質粒pGAD轉化鈍齒棒桿菌EOl，涂布含有30 μ g/mL卡那霉素的固體LBG平板于30°C培養(yǎng)36h，從平板上篩選陽性菌落，接種于含30 μ g/mL卡那霉素的液體LBG培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜，提取質粒，以lpgad F、lpgad R為引物對質粒進行PCR驗證，以及用Sal I和BamH I進行酶切驗證。獲得重組菌C.crenatum EOl/pGAD。(3)重組菌 C.crenatum EOl/pGAD 發(fā)酵產(chǎn) Y _ 氨基丁酸挑取單菌落接種至液體種子培養(yǎng)基(加入卡那霉素)，30°C，220r/min往復式搖床培養(yǎng)12h。以10%接種量將種子培養(yǎng)液轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，220r/min往復式搖床培養(yǎng)，根據(jù)菌體生長情況適時用IPTG進行誘導，繼續(xù)進行發(fā)酵。發(fā)酵過程中待谷氨酸合成量基本達到最高值時停止NH4+的供給，繼續(xù)發(fā)酵合成Y-氨基丁酸。實時檢測發(fā)酵過程中谷氨酸、葡萄糖殘留量以及菌體量等參數(shù)。(5)底物與產(chǎn)物的定性與定量分析以及菌體生長情況的監(jiān)測發(fā)酵液中葡萄糖和谷氨酸的實時檢測通過SBA-40B生物傳感分析儀測定。Y -氨基丁酸通過氨基酸測定儀測定。利用氨基酸測定儀分別測定標準樣品Y-氨基丁酸和轉化液各自的出峰時間和峰面積，即可以對轉化液中Y-氨基丁酸進行定性與定量檢測。菌液濃度測定:吸取樣品菌液，用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，以蒸餾水作為空白對照，采用分光光度計于Icm光程測定OD562nm。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過克隆L.plantarum GB01-21 Y -氨基丁酸代謝途徑中的谷氨酸脫羧酶基因，于谷氨酸生產(chǎn)菌株C.crenatum EOl中成功進行表達，獲得了一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸合成Y -氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌，實現(xiàn)葡萄糖到Y-氨基丁酸的一步法生產(chǎn)，簡化了制備步驟，大大降低了 Y-氨基丁酸的生產(chǎn)成本。同時，鈍齒棒桿菌為食品安全菌株，提高了安全性，打破了以往大腸桿菌生產(chǎn)Y-氨基丁酸的普遍模式。


圖1 二次重組菌株argB基因缺失型和回復野生型的PCR鑒定泳道說明M:DL2000Marker ；1:回復突變型argB ；2~5:基因缺失型Λ argB圖2谷氨酸脫羧酶在E.coli JM109中的表達M泳道為蛋白質分子量標準Marker ；
I號泳道為對照組E.coli JM109/pJC-tac的胞內蛋白表達；2號泳道為對照組誘導前E.coli JM109/pJC-tac的胞內蛋白表達；3號泳道為實驗組誘導后E.coli JM109/pGAD的胞內蛋白表達；圖3重組質粒pGAD酶切驗證I 泳道為 DL2000Maker2 泳道為 pGAD BamH 1、Sal I 雙酶切3泳道為pGAD BamHI單酶切4 泳道為 λ -Hind III Maker圖4鈍齒棒桿菌EOl發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酸過程曲線圖5重組菌C.crenatum EOl/pGAD發(fā)酵液氨基酸測定結果具體實施方法實施例1:鈍齒棒桿菌argB基因的敲除驗證對發(fā)生第二次同源重組的菌株進行回復野生型/基因缺失型的鑒定。提取轉化子染色體，以目標基因argB的上下游引物進行PCR鑒定。PCR鑒定結果如圖1所示。實施例2:谷氨酸脫羧酶在E.coli JM109中的表達重組質粒p GAD轉入E.coli JM109，在卡那霉素抗性LB平板上挑取陽性轉化子至液體LB，IPTG誘導后收集菌體經(jīng)超聲波破碎后，上清液SDS-PAGE，檢測到一條分子量約53kDa的特異性條帶(圖2)，與報道的目標蛋白大小一致，而對照菌株E.coli JM109/pJC-tac以及未經(jīng)誘導的E.coli JM109/pGAD均無此條帶。說明重組質粒pGAD在大腸桿菌中正確表達，因此可將構建好的重組質粒PGAD轉入鈍齒棒桿菌檢測能否有效表達谷氨酸脫羧酶。實施例3:重組菌C.crenatum EOl/pGAD的鑒定重組質粒pGAD電擊轉化C.crenatum E01，待轉化子長出后轉接至含有卡那霉素的LBG液體培養(yǎng)基，取菌液提取質粒進行PCR驗證以及酶切驗證，PCR產(chǎn)物均顯示一條1410bp大小的目的條帶,經(jīng)Sal I/BamH I酶切驗證后結果如圖3,說明重組菌C.crenatumEOl/pGAD構建成功。實施例4:重組菌C.crenatum EOl/pGAD的谷氨酸脫羧酶活力測定取凍管保藏的菌種接種至含卡那霉素(終濃度為50 μ g/mL)的活化培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉接活化培養(yǎng)基中，IPTG誘導表達，超聲波破碎法制備粗酶液。粗酶液采用比色法進行酶活測定。首先配制底物溶液Macllvaine緩沖體系(0.2mol/L，pH4.8，含0.1mmoI/LPLP, 0.4mol/L底物L-谷氨酸鈉)，取200 μ L底物溶液和100 μ L酶液在30°C反應一定時間，置于冰浴中，加入200 μ L0.2mol/L硼酸緩沖液(pH9.0)終止反應；再加入1.0mL6%苯酚和400 μ L次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應lOmin，迅速在冰浴中冷卻顯色，一個酶活力單位(U)定義為在測定條件下每分鐘產(chǎn)生Iymol Y-氨基丁酸所需的酶量。經(jīng)測定，重組鈍齒棒桿菌谷氨酸脫羧酶活力為0.81U/mL。實施例5:鈍齒棒桿菌EOl發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酸培養(yǎng)基:①種子培養(yǎng)基:葡萄糖30，玉米漿25，KH2PO4.3H201.5，MgSO4.7H200.4，尿素6(分消)，pH7.0-7.2，115°C滅菌15min ;②發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖140，玉米漿3，尿素(分消)，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7H2008, MnSO4.H2O0.02，F(xiàn)eSO4.7Η200.02，生物素8X10—5，L-組氨酸5Χ10Λ ρΗ7.0-7.2，115°C滅菌15min。發(fā)酵過程中添加尿素提供NH4+源。將上述經(jīng)酶活驗證的重組菌鈍齒棒桿菌C.crenatum EOl進行搖瓶發(fā)酵實驗，從新鮮活化的斜面培養(yǎng)基中挑取一滿環(huán)鈍齒棒桿菌(對照菌及重組菌)于種子培養(yǎng)基中(25mL/250mL)，30°C，220r/min往復式搖床培養(yǎng)12h，以10%接種量，定時添加NH4+源，發(fā)酵96h，分時間區(qū)段測定谷氨酸及L-精氨酸產(chǎn)量，結果與對照菌株鈍齒棒桿菌SYPA5-5相比，重組菌不再合成精氨酸，而到36h時谷氨酸可顯著積累到34g/L左右。谷氨酸合成曲線如圖4所示。實施例6:重組菌C.crenatum EOl/pGAD發(fā)酵產(chǎn)Y _氨基丁酸培養(yǎng)基:①活化培養(yǎng)基:LBG:蛋白胨1，酵母膏0.5，NaClI，葡萄糖0.5，115°C滅菌15min ;②種子培養(yǎng)基:葡萄糖30，玉米漿25，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7Η200.4，尿素6(分消)，pH7.0-7.2，115 V滅菌15min ;③發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖140，玉米漿3，尿素5.5 (分消)，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7Η200.8，MnSO4.H2O0.02，F(xiàn)eSO4.7Η200.02，生物素 8Χ 10_5，L-組氨酸5Χ 10_4，pH7.0-7.2，115°C滅菌15min。發(fā)酵過程中添加尿素提供NH4+源。挑取C.glutamicum EOl/pGAD單菌落接種至液體種子培養(yǎng)基(加入終濃度50 μ g/mL的卡那霉素)，30°C，220r/min往復式搖床培養(yǎng)12h。以10%接種量將種子培養(yǎng)液轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，220r/min，培養(yǎng)至8h時開始添加尿素作為NH4+源來合成谷氨酸。培養(yǎng)12h時加入終濃度為I μ mol/mL的IPTG進行誘導，30°C，220r/min往復式搖床繼續(xù)培養(yǎng)。36h時停止NH4+的供給，即終止谷氨酸的合成，繼續(xù)發(fā)酵至72h來合成Y-氨基丁酸。實時檢測發(fā)酵過程中谷氨酸、葡萄糖殘留量以及菌體量等參數(shù)。結果顯示，36h時谷氨酸濃度達到最高，約在40h谷氨酸濃度開始下降。發(fā)酵72h后谷氨酸濃度基本穩(wěn)定，說明Y-氨基丁酸不再合成，此時停止發(fā)酵。經(jīng)氨基酸測定儀檢測Y-氨基丁酸含量，最終發(fā)酵液Y-氨基丁酸濃度為13.98g/L。氨基酸測定結果如圖5所示，出峰時間為2.559min的物質為L-谷氨酸，對應的出峰時間10.085min 的物質為Y-氨基丁酸。
權利要求
1.一株能以葡萄糖為底物，高效轉化葡萄糖為谷氨酸的基因工程菌鈍齒棒桿菌EOl。
2.權利要求1中基因工程菌鈍齒棒桿菌EOl的構建思路，其特征是利用一株高產(chǎn)精氨酸突變菌株純齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum SYP,保藏編號 CCTCC NO:M208133),經(jīng)傳代5次后，敲除argB基因，獲得基因工程菌鈍齒棒桿菌E01，該工程菌缺少Y -氨基丁酸合成途徑，但能高效催化葡萄糖轉化為谷氨酸。
3.一株能以葡萄糖為底物，高效轉化Y-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌，其分類命名為C.crenatum E01/pGADo
4.權利要求書3中的重組菌C.crenatum EOl/pGAD的構建思路,其特征是根據(jù)植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GBO1-21 (中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏號:CCTCCM209102)谷氨酸合成途徑，但具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，能高效催化Y _氨基丁酸的合成，以及權利要求1中的鈍齒棒桿菌EOl缺少Y-氨基丁酸合成途徑，但能高效催化葡萄糖轉化為谷氨酸的特點，該重組菌成功重組了鈍齒棒桿菌的谷氨酸代謝途徑和植物乳桿菌的Y-氨基丁酸合成途徑，獲得能以葡萄糖為底物，生物轉化Y-氨基丁酸的高效重組鈍齒棒桿菌。
5.權利要求書3中的重組菌C.crenatum EOl/pGAD的構建方法，其特征是將植物乳桿菌的Ipgad基因插入到載體pJC-tac,構建得重組質粒pGAD,電擊轉化鈍齒棒桿菌E01,通過含有30 μ g/mL的卡那霉素抗性篩選,獲得目的重組菌株C.crenatum EOl/pGAD。
6.權利要求書3中的重組質粒pGAD的構建，其特征是將純化后的Ipgad基因與pMD18-T連接，反應體系如下:質粒pMD18-T0.5 μ L，目的基因4.5 μ L，LigationSolution5yL，混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接4h以上，轉化大腸桿菌JM109，提取質粒pMD18-T-lpgad,酶切驗證并測序,提取質粒pMD18-T_lpgad和表達載體pJC-tac, 二者同時用Sal I/BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物通過粘性末端連接，獲得重組質粒pGAD。
7.權利要求5中的Ipgad基因的獲得，其特征是以保藏編號為CCTCCM209102的L.plantarum GB01-21 為模板，設計正反向引物 lpgad F Sal I 和 lpgad R BamH I (如下所示)，以L.plantarum GB01-21染色體為模板，lpgad F、lpgad R為引物進行PCR擴增反應，PCR 采用 50yL 體系:10XExTaq Buffer5 μ L, dNTP4 μ L，模板 DNAl μ L，上下游引物各0.5 μ L，ExTaq酶0.5 μ L，ddH20補齊至總體積50 μ L。PCR反應條件:94°C預變性5min ；94°C變性 50s, 56°C退火 45s, 72°C延伸 90s, 35 個循環(huán)；72°C終延伸 lOmin, 15。。lOmin,獲得lpgad基因，其全長1400bp。lpgad F Sail:5/ -CGCGTCGACATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3'lpgad R BamHI:5/ -GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3;。
8.權利要求1所述鈍齒棒桿菌EOl發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酸的方法，其特征是:通過發(fā)酵過程不斷添加NH4+源合成谷氨酸。
9.權利要求3所述的重組鈍齒棒桿菌C.crenatum EOl/pGAD發(fā)酵產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征是:通過誘導使得谷氨酸脫羧酶高效表達，前期通過添加NH4+源充分合成谷氨酸，后期停止NH4+源的添加終止谷氨酸的合成，繼續(xù)發(fā)酵合成Y -氨基丁酸。
10.權利要求9中，重組菌C.crenatum EOl/pGAD的谷氨酸脫羧酶活力測定方法，其特征是:取凍管保藏的菌種接種至含卡那霉素(終濃度為50 μ g/mL)的活化培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉接活化培養(yǎng)基中，IPTG誘導表達，超聲波破碎法制備粗酶液，采用比色法進行酶活測定，配制底物溶液Macllvaine緩沖體系(0.2mol/L, pH4.8，含0.lmmol/LPLP, 0.4mol/L底物L-谷氨酸鈉)，取200 μ L底物溶液和100 μ L酶液在30°C反應一定時間，置于冰浴中，加入200 μ L0.2mol/L硼酸緩沖液(pH9.0)終止反應，加入1.0mL6%苯酚和400 μ L次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應lOmin，迅速在冰浴中冷卻顯色，一個酶活力單位(U)定義為在測定條件下每分鐘產(chǎn)生Iymol Y-氨基丁酸所需的酶量，經(jīng)測定，重組鈍齒棒桿菌谷氨酸脫羧酶活力為0.81U/mL。
11.權利要求9中的底物與產(chǎn)物的定性與定量分析以及菌體生長情況的監(jiān)測方法，其特征是發(fā)酵液中葡萄糖和谷氨酸的實時檢測通過SBA-40B生物傳感分析儀測定；Y -氨基丁酸通過氨基酸測定儀測定，利用氨基酸測定儀分別測定標準樣品Y-氨基丁酸和轉化液各自的出峰時間和峰面積，即可以對轉化液中Y-氨基丁酸進行定性與定量檢測；菌液濃度測定:吸取樣品菌液，用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，以蒸餾水作為空白對照，采用分光光度計于Icm光程測定OD562。 ·
全文摘要
利用重組鈍齒棒桿菌以葡萄糖為底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法屬于基因工程和酶工程領域。本發(fā)明應用基因工程方法，將鈍齒棒桿菌SYPA5-5基因argB敲除，獲得能夠積累谷氨酸的安全菌株鈍齒棒桿菌E01；從L.Plantarum GB01-21克隆谷氨酸脫羧酶基因于鈍齒棒桿菌E01中表達，獲得以葡萄萄糖為底物直接合成γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌C.crenatum E01/pGAD。重組菌發(fā)酵液γ-氨基丁酸積累量達13.98g/L。此發(fā)明成功整合谷氨酸和γ-氨基丁酸代謝途徑，實現(xiàn)葡萄糖到γ-氨基丁酸一步法生產(chǎn)，簡化制備途徑，降低成本，提高安全性，為氨基酸的高效低成本制備提供嶄新的思路。
文檔編號C12N15/63GK103215198SQ201310043508
公開日2013年7月24日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權日2013年2月4日
發(fā)明者饒志明, 孫紅梅, 徐美娟, 李秀鵬, 張顯 申請人:江南大學