專利名稱：一種產(chǎn)生物表面活性劑烴降解菌的分離篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的分離篩選方法，屬于環(huán)境生物工程和環(huán)境微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著石油的開采、運(yùn)輸和泄漏以及含油廢水的排放，每年有800多萬噸石油進(jìn)入環(huán)境，污染土壤、地下水、河流和海洋，對生態(tài)環(huán)境造成了很大危害，影響生產(chǎn)和人民生活。因此，石油污染問題引起了人們越來越多的關(guān)注，對之進(jìn)行治理也成為了最迫切的事情。石油污染環(huán)境的修復(fù)有物理、化學(xué)和生物修復(fù)等三種方法。微生物修復(fù)技術(shù)是生物修復(fù)中最重要、最核心的組成部分，具有成本低、應(yīng)用方法簡單、污染物氧化完全、無二次污染、可原位處理、不需大型設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，日益引起重視。微生物修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)是選用高效的石油烴降解菌株。主要在被石油污染的水環(huán)境和土壤環(huán)境中采樣后進(jìn)行分離和篩選。雖然產(chǎn)表面活劑被認(rèn)為是微生物乳化石油促進(jìn)降解的機(jī)制之一，但篩選產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的方法尤其是高效初篩方法仍令研究者感到困難。因此，本發(fā)明結(jié)合發(fā)明人自身的研究體會(huì)，歸納并有所創(chuàng)新，提出了一套較簡潔高效的產(chǎn)表面活性劑烴降解菌的分離和篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技 術(shù)問題是:提供一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的分離篩選方法，能夠較快地分離與純化到既產(chǎn)較高產(chǎn)量的表面活性劑，又有效去除石油烴污染的降解純菌株。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下:具體方法步驟為:(I)取樣:取原油污染地或加油站附近污染表層5-20cm深的土樣，記錄采集位置、土壤含水量、含油量等，進(jìn)行編號；(2)富集培養(yǎng):各土樣按質(zhì)量體積比5%加入含有原油的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(MSM，加入原油作為唯一碳源后稱烴降解培養(yǎng)基)中，原油含量分別0.5%、1.0%和1.5%,每個(gè)濃度在30°C條件下培養(yǎng)7天，之后轉(zhuǎn)移至更高濃度原油的烴降解培養(yǎng)基中，直到含油1.5%的培養(yǎng)基培養(yǎng)完成，馴化結(jié)束，使能利用原油做單一碳源的微生物得到富集；礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基按以下方法配制(/L)=MgSO40.2g, KH2PO4L 0g, (NH4)2SO4LOg,CaCl20.02g, K2HPO4L 0g, FeCl30.05g，蒸餾水1L，pH值最后調(diào)整為7.0-7.2，做發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，事先在250mL三角瓶中加入一定量的原油，再加入50mL MSM, 121°C滅菌20min備用。(3)血平板分離:取富集后的菌液，稀釋至適宜倍數(shù)涂布于血平板上，30°C培養(yǎng)1-3天，直到有明顯的溶血圈產(chǎn)生(見

圖1)，平板采用肉胨培養(yǎng)基中加入5-7%的脫纖維羊血獲得。肉胨培養(yǎng)基成份為(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，純凈水或自來水1L，調(diào)pH至7.0左右。配制血平板時(shí)要加1.5%的瓊脂粉，滅菌后取出冷卻至50°C左右時(shí)，力口入 5-7 %的脫纖維無菌羊血，迅速分配至培養(yǎng)皿中，冷卻后即得血平板，血平板不耐貯存，一般隨用隨配；(4)油平板分離:挑取血平板上產(chǎn)透明圈的菌株50個(gè)左右，肉胨培養(yǎng)基活化后接種于油平板上，用牙簽鈍頭接種于油平板上，每個(gè)油平板接種4-5個(gè)菌株。30°C條件下培養(yǎng)3天(見圖2);油平板配制方法如下:將原油溶于濃度10%的石油醚中，濾紙剪成直徑85mm，置90mm培養(yǎng)皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚揮發(fā)后，121°C蒸汽高壓滅菌20min，取出烘干備用。MSM中事先加入1.5%的瓊脂粉，滅菌后傾倒平板，平板尚未凝固時(shí)將濾紙緊貼在平板上后即成油平板。(5)菌種保存、編號:挑取油平板產(chǎn)噬油斑的菌落接種于斜面中30°C培養(yǎng)1-2天長出菌苔后，置4°C備用；(6)烴降解能力搖瓶鑒定和篩選:取平板初篩出來的菌株，用液體肉胨培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)基)做種子培養(yǎng)后接于含原油1%的烴降解培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)7d，觀察原油乳化和降解情況，挑取原油乳化或降解明顯的搖瓶(見圖3)，測定殘余烴的量和發(fā)酵液離心后的上清液的表面張力，測定殘余烴的量和發(fā)酵液離心后的上清液的表面張力。測定殘余烴的量采用重量法，測定表面張力采用表面張力儀進(jìn)行(見圖4);(7)產(chǎn)表面活性劑能力搖瓶鑒定:取上述原油降解率較高且發(fā)酵液上清液表面張力明顯降低的菌株接種于產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基(碳源可以是葡萄糖、廢棄植物油脂等)，30°C培養(yǎng)3d后測定表面張力和發(fā)酵液排油圈大小。測定表面張力采用表面張力儀,排油圈測定大小的方法是:在90mm培養(yǎng)皿小蓋中，加入15mL去離子水，滴加200mL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取樣器加入IOuL的發(fā)酵液。如果排油圈直徑超過培養(yǎng)皿小蓋的直徑，則將發(fā)酵液稀釋10倍后再加入。產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基成份為:NaN032.5g，K2HP044.0g,ΚΗ2Ρ044.0g, CaCl2.2Η200.lg, MgSO40.2g，NaCl1.0g, KCll.0g，酵母粉 1.0g，甘油 30g，去離子水lOOOmL，pH值最后調(diào)整為6.5，分裝搖瓶后加入碳源，121°C滅菌后備用；(8)菌種保存:既可在烴降解培養(yǎng)基中降解石油，降低表面張力并可以在產(chǎn)表活培養(yǎng)基中明顯降低表面張力、排油圈直徑大于3的菌株接種于肉胨培養(yǎng)基斜面中，30°C培養(yǎng)1-2天長出菌苔后，置4°C備用；(9)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證:取上述入選菌株按上述￠) (7)的方法進(jìn)行1-2輪搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，最終獲得既可在烴降解培養(yǎng)基中降解石油，降低表面張力并可以在產(chǎn)表活培養(yǎng)基中明顯降低表面張力、排油圈直徑大于3的菌株保留，最終獲得產(chǎn)表面活性劑的石油烴降解菌。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是:能夠較快地分離與純化到既產(chǎn)較高產(chǎn)量的表面活性劑，又有效去除石油烴污染的降解純菌株。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種快速從油污土壤中分離并篩選產(chǎn)表面活性劑石油烴降解純菌株的方法。首先從油田采集油污土壤，按5%的量添加至原油為唯一碳源并且含量逐漸提高(0.5%、1%和1.5% )的烴降解培養(yǎng)基中，在30°C、180rmp轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床上進(jìn)行耐油污馴化和富集培養(yǎng)，一般每個(gè)原油梯度培養(yǎng)時(shí)間為I周，共3周時(shí)間。富集后的菌液稀釋到一定程度后在血平板上涂布培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)l-3d，取血平板上透明圈邊緣清晰而大的的菌落，接種于液體肉胨培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基渾濁后用滅菌牙簽鈍頭蘸取菌液點(diǎn)種于油平板上，30°C培養(yǎng)3d，取噬油斑明顯且較大的菌落接種于肉胨斜面并保存?zhèn)溆谩Ｒ后w肉胨培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)基)培養(yǎng)后，按I %的接種量接入烴降解培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)7d，測定烴降解率和發(fā)酵液上清表面張力，表現(xiàn)好的菌株再接入產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3天后評價(jià)產(chǎn)表面活性劑的能力，通過綜合評價(jià)，即得產(chǎn)表面活性劑的石油烴降解菌株。通過這種方法得到的微生物多是細(xì)菌。通過以上方法，先后從大慶油田、勝利油田、河南油田、江蘇油田等油田采集土樣和水樣，進(jìn)行了烴降解菌的分離和篩選工作，獲得50多個(gè)有價(jià)值和有潛力的產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌株，其中Zl、Z41、Z49、HB03、10-18等表現(xiàn)較好。其中Z41為銅綠假單胞菌，利用單個(gè)菌株進(jìn)行搖瓶好氧培養(yǎng)，周降解率穩(wěn)定在40%以上，可利用廢棄食用油脂產(chǎn)表面活性齊U，有效產(chǎn)物經(jīng)鑒定為鼠李糖脂，單菌株搖瓶好氧發(fā)酵條件下，產(chǎn)量10g/L以上，發(fā)酵液稀釋100倍后表面張力在35-40mN/m左右，CMC在174.0mg/L左右，對柴油、石蠟、原油等均可較好地乳 化(見圖5)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的分離篩選方法，其特征是: 具體方法步驟為: (1)取樣:取原油污染地或加油站附近污染表層5-20cm深的土樣，記錄采集位置、土壤含水量、含油量等，進(jìn)行編號； (2)富集培養(yǎng):各土樣按質(zhì)量體積比5%加入含有原油的礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(MSM，加入原油作為唯一碳源后稱烴降解培養(yǎng)基)中，原油含量分別0.5%、1.0%和1.5%，每個(gè)濃度在30°C條件下培養(yǎng)7天，之后轉(zhuǎn)移至更高濃度原油的烴降解培養(yǎng)基中，直到含油1.5%的培養(yǎng)基培養(yǎng)完成，馴化結(jié)束，使能利用原油做單一碳源的微生物得到富集； (3)血平板分離:取富集后的菌液，稀釋至適宜倍數(shù)涂布于血平板上，30°C培養(yǎng)1-3天，直到有明顯的溶血圈產(chǎn)生(見圖1)，平板采用肉胨培養(yǎng)基中加入5-7%的脫纖維羊血獲得。肉胨培養(yǎng)基成份為(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，純凈水或自來水1L，調(diào)pH至7.0左右。配制血平板時(shí)要加1.5%的瓊脂粉，滅菌后取出冷卻至50°C左右時(shí)，加入5-7%的脫纖維無菌羊血，迅速分配至培養(yǎng)皿中，冷卻后即得血平板，血平板不耐貯存，一般隨用隨配；(4)油平板分離:挑取血平板上產(chǎn)透明圈的菌株50個(gè)左右，肉胨培養(yǎng)基活化后接種于油平板上，用牙簽鈍頭接種于油平板上，每個(gè)油平板接種4-5個(gè)菌株。30°C條件下培養(yǎng)3天(見圖2)； (5)菌種保存、編號:挑取油平板產(chǎn)噬油斑的菌落接種于斜面中30°C培養(yǎng)1-2天長出菌苔后，置4°C備用； (6)烴降解能力搖瓶鑒定和篩選:取平板初篩出來的菌株，用液體肉胨培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)基)做種子培養(yǎng)后接于含原油I %的烴降解培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)7d，觀察原油乳化和降解情況，挑取原油乳化或降解明顯的搖瓶(見圖3)，測定殘余烴的量和發(fā)酵液離心后的上清液的表面張力，測定殘余烴的量和發(fā)酵液離心后的上清液的表面張力。測定殘余烴的量采用重量法，測定表面張力采用表面張力儀進(jìn)行(見圖4); (7)產(chǎn)表面活性劑能力搖瓶鑒定:取上述原油降解率較高且發(fā)酵液上清液表面張力明顯降低的菌株接種于產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基(碳源可以是葡萄糖、廢棄植物油脂等)，30°C培養(yǎng)3d后測定表面張力和發(fā)酵液排油圈大小。測定表面張力采用表面張力儀，排油圈測定大小的方法是:在90mm培養(yǎng)皿小蓋中，加入15mL去離子水，滴加200mL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取樣器加入IOuL的發(fā)酵液。如果排油圈直徑超過培養(yǎng)皿小蓋的直徑，則將發(fā)酵液稀釋10倍后再加入。產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基成份為:NaN032.5g，K2HP044.0g,ΚΗ2Ρ044.0g, CaCl2.2Η200.lg, MgSO40.2g，NaCl 1.0g, KCll.0g，酵母粉 1.0g，甘油 30g，去離子水lOOOmL，pH值最后調(diào)整為6.5，分裝搖瓶后加入碳源，121°C滅菌后備用； (8)菌種保存:既可在烴降解培養(yǎng)基中降解石油，降低表面張力并可以在產(chǎn)表活培養(yǎng)基中明顯降低表面張力、排油圈直徑大于3的菌株接種于肉胨培養(yǎng)基斜面中，30°C培養(yǎng)1-2天長出菌苔后，置4°C備用； (9)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證:取上述入選菌株按上述(6) (7)的方法進(jìn)行1-2輪搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，最終獲得產(chǎn)表面活性劑的石油烴降解菌； (10)搖瓶鑒定:既可在烴降解培養(yǎng)基中降解石油，降低表面張力并可以在產(chǎn)表活培養(yǎng)基中明顯降低表面張力、排油圈直徑大于3的菌株保留，再進(jìn)行1-2輪搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，最終獲得產(chǎn)表面活性劑的石油烴降解菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的分離篩選方法，其特征是:礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基按以下方法配制(/L) =MgSO40.2g, KH2PO41.0g, (NH4)2SO4LOg, CaCl20.02g,K2HPO4L 0g, FeCl30.05g,蒸餾水1L，pH值最后調(diào)整為7.0-7.2，做發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，事先在250mL三角瓶中加入一定量的原油，再加入50mL MSM, 121°C滅菌20min備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的分離篩選方法，其特征是:油平板配制方法如下:將原油溶于濃度10%的石油醚中，濾紙剪成直徑85mm，置90mm培養(yǎng)皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚揮發(fā)后，121°C蒸汽高壓滅菌20min，取出烘干備用。MSM中事先加入1.5%的瓊脂粉 ，滅菌后傾倒平板，平板尚未凝固時(shí)將濾紙緊貼在平板上后即成油平板。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速從油污土壤中分離并篩選產(chǎn)表面活性劑石油烴降解純菌株的方法。首先從油田采集油污土壤，按5％的量添加至原油為唯一碳源并且含量逐漸提高的烴降解培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上進(jìn)行富集培養(yǎng)。富集后的菌液稀釋到一定程度后在血平板上涂布培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)1-3d，取血平板上透明圈邊緣清晰而大的菌落，液體肉胨培養(yǎng)基培養(yǎng)后用滅菌牙簽鈍頭蘸取菌液點(diǎn)種于油平板上，30℃培養(yǎng)3d，取噬油斑明顯且較大的菌落接種于肉胨斜面并保存?zhèn)溆貌⒂萌怆伺囵B(yǎng)基培養(yǎng)后，先后接種烴降解培養(yǎng)基和產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7d和3d，測定烴降解能力和產(chǎn)表面活性劑的能力，獲得產(chǎn)表面活性劑的石油烴降解菌株。
文檔編號C12Q1/04GK103160452SQ20131004357
公開日2013年6月19日 申請日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者張祥勝, 范紅香 申請人:鹽城師范學(xué)院