專利名稱：一種人參pdr跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人參PDR跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的啟動子。
背景技術(shù)：
人參0°.ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,是名貴中藥材。人參中含有多種藥用成分，其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人參根中分離出50余種人參皂苷，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明各皂苷單體具有重要的藥用價值，且已廣泛應(yīng)用于臨床，但其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等活性強的皂苷含量極低。因此，利用人參皂苷合成代謝相關(guān)的基因調(diào)控技術(shù)促進人參皂苷的合成與積累具有重要的理論價值和應(yīng)用前景?；虻挠行мD(zhuǎn)錄和表達是發(fā)揮其基因功能的重要條件，基因成功轉(zhuǎn)錄和表達需要依靠啟動子對其調(diào)控。啟動子與RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等相互作用發(fā)揮其調(diào)控功能。真核生物中的TATA和CAAT框，它們決定了轉(zhuǎn)錄的起始位點和效率，負責(zé)和RNA聚合酶結(jié)合，啟動基本轉(zhuǎn)錄過程。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導(dǎo)型作用元件、組織特異型作用元件和化學(xué)誘導(dǎo)作用元件等。其中化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)型作用元件在促進次生代謝產(chǎn)物合成方面起重要作用。在次生代謝產(chǎn)物合成與積累相關(guān)基因的表達過程中，順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用發(fā)揮著重要調(diào)控作用。環(huán)境刺激經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞后，激活防衛(wèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與特異順式作用元件的相互作用，從而實現(xiàn)相關(guān)防衛(wèi)功能基因的表達。鑒于順式作用元件的上述重要調(diào)控作用，使用誘導(dǎo)型啟動子介導(dǎo)的抗性基因無疑具有多方面的優(yōu)勢，因此鑒定次生代謝產(chǎn)物合成與積累相關(guān)的誘導(dǎo)型啟動子已成為目前植物分子生物學(xué)研究的熱點之一。在人參次生代謝 調(diào)控中，可以通過導(dǎo)入關(guān)鍵酶等基因調(diào)控合成途徑中的多步限速反應(yīng)，或者通過順式作用元件在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控人參皂苷合成、轉(zhuǎn)運和積累相關(guān)基因的表達，從而提高人參皂苷的含量。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)轉(zhuǎn)運蛋白是目前已知最大，功能最廣泛的蛋白家族，ABC轉(zhuǎn)運蛋白屬跨膜運輸?shù)鞍祝盟釧TP釋放的能量轉(zhuǎn)運有機酸、生物堿、細胞代謝產(chǎn)物和藥物等。參與細菌耐藥性、次生代謝產(chǎn)物積累、脅迫反應(yīng)和腫瘤抗藥性等。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族包括多向耐藥性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多藥耐藥性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亞族,是植物和真菌中特有的一種ABC轉(zhuǎn)運蛋白。但目前對植物PDR基因相關(guān)研究甚少，離體細胞培養(yǎng)中，香紫蘇醇可誘導(dǎo)層基因上調(diào)表達，在細胞內(nèi)NpTORl蛋白累積增強了細胞向胞外轉(zhuǎn)運香紫蘇醇以及其類似物的能力。擬南芥(A細胞內(nèi)香紫蘇醇的累積亦能誘導(dǎo)
基因上調(diào)表達，同時在細胞外檢測到AtH)R12蛋白向胞外轉(zhuǎn)運的香紫蘇醇，推測萜類物質(zhì)可能是基因表達的上游調(diào)控物質(zhì)。矮牽牛中PhTORl蛋白可以轉(zhuǎn)運一種新發(fā)現(xiàn)的植物激素-獨角金內(nèi)酯，進而促進矮牽牛分枝。因而，PDR轉(zhuǎn)運蛋白基因在調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累方面具有重要的潛力。然而，在本發(fā)明的研究之前，尚無人參PDR蛋白基因啟動子及其調(diào)控元件的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在從人參中分離出一種人參PDR跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因啟動子，從而提供一種能夠調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累相關(guān)的基因資源。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累的基因的啟動子ProPDR2，其序列如SEQ ID N0.1所示，或是與SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。本發(fā)明所述的啟動子ProH)R2的制備方法為:提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構(gòu)建四個啟動子文庫-.Dral文庫、￡boR V文庫、Pvu II文庫和Stu I文庫；分別以構(gòu)建的文庫、AcoR V文庫Ira II文庫和泣w I文庫為模板，根據(jù)人參基因的5 '端序列設(shè)計引物；進行PCR擴增；膠回收PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物即得本發(fā)明所述的ProPDR2啟動子。在本發(fā)明的啟動子的制備中，用于擴增ProH)R2啟動子的引物對如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 所示。本發(fā)明還提供了含有ProH)R2啟動子的重組載體pBI121_ProroR2::⑶S，具體構(gòu)建方法為:選擇植物表達載體PBI121，將ProPDR2啟動子連接到空載體pBI121中，獲得ProPDR2啟動子驅(qū)動的⑶S報告基因的重組載體pBI121-ProTOR2::⑶S。ProTOR2啟動子亦可克隆到其他空載體中，或制備成轉(zhuǎn)基因細胞及重組菌。本發(fā)明還通過異源表達鑒定證明啟動子ProPDR2驅(qū)動的⑶S基因表達具有組織特異性且受茉莉酸甲酯和人參皂苷等化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)，這表明本發(fā)明的啟動子Pr0H)R2可在植物基因工程領(lǐng)域中用于調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累，并可用于優(yōu)良人參品種的培育。本發(fā)明利用現(xiàn)有 的植物基因工程技術(shù)，根據(jù)已克隆的人參PgPDR2基因的5'端序列，采用Genomewalker技術(shù)分離ProF1DI^啟動子序列，構(gòu)建ProPDR2::⑶S報告基因的重組表達載體，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)過異源表達鑒定證明啟動子ProPDR2對⑶S報告基因轉(zhuǎn)錄與表達的驅(qū)動功能，ProH)R2驅(qū)動的⑶S基因表達具有組織特異性且受茉莉酸甲酯和人參皂苷等化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)。這表明所述啟動子Pr0H)R2具有促進調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運和積累方面的功能。因此，通過本發(fā)明的啟動子或其衍生物能調(diào)控或改良人參及其它植物，獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。這為后續(xù)克隆人參皂苷轉(zhuǎn)運信號途徑中的關(guān)鍵的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因，以及通過轉(zhuǎn)基因方法調(diào)控人參皂苷等萜類化合物的轉(zhuǎn)運與積累等奠定了基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明擴增的人參ProPDR2啟動子片段電泳結(jié)果；圖中，I表示PCR擴增產(chǎn)物，M表不Marker ；
圖2是本發(fā)明擴增的人參Pr0H)R2啟動子順式作用元件分析 圖3是轉(zhuǎn)基因煙草中擴增的人參Pr0H)R2啟動子片段電泳結(jié)果；圖中，廣5表示PCR擴增產(chǎn)物，M表示Marker ；
圖4是本發(fā)明的啟動子Pr0H)R2啟動⑶S報告基因在轉(zhuǎn)基因煙草不同組織中的表達水平 圖5是本發(fā)明的啟動子ProPDR2啟動⑶S報告基因在IOOiiM MJ,50uM SA,20uM ABA和20mg/L人參總皂苷誘導(dǎo)下表達水平圖；其中:MJ為茉莉酸甲酯、SA為水楊酸、ABA為脫落酸、GS為人參皂苷。
具體實施例方式以下詳細說明本發(fā)明的具體實施，所有對實施例的說明不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。實施例1啟動子ProPDR2的獲得
1、人參根DNA提取及其啟動子文庫的構(gòu)建
取吉林長白山人參產(chǎn) 區(qū)四年生人參根，自來水浸泡45min后沖洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，無菌水沖洗2次。參考Omega Plant DNA Kit (Omega公司)說明提取基因組DNA,以人參根總DNA為模板,按照Genomewalker試劑盒(Takara公司)說明書構(gòu)建DraI文庫(DLl) ,BcoR V 文庫(DL2)、Pvu II 文庫(DL3)和泣w I 文庫(DL4)。2、引物設(shè)計和PCR擴增 (I)引物設(shè)計與合成
根據(jù)已克隆的人參PGPDR2基因(登錄號為KC013237，專利申請?zhí)枮?01210462288.5)的5'端基因序列，設(shè)計外側(cè)引物和和巢式引物,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物如下:
Pro2-SP:5' -GTCAAAGGTCGGGAGTTTCTCAAGGGA-3' ；(SEQ ID N0.2)
Pro2-Nest-SP:5' -GACCTCCATTCCATTGCTCCTCCATAC-3'。(SEQ ID N0.3)
引物由上海英駿生物有限公司合成。(2) PCR 擴增
分別以構(gòu)建的DL1、DL2、DL3和DL4四個啟動子文庫為模板，利用Prol-SP引物與試劑盒中外側(cè)引物 APl (5’ - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’)進行第一輪 PCR 擴增。反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液 L、MgCl2 (25mmol/L) 5 y L、dNTP (2.5mmol/L)8 ii L、Prol-SP (10 u mol/L) 2 u L, API (10 u mol/L) 2 u L、文庫 DNA I u L、ddH20 26.5 u L和 LA Taq DNA polymerase (5 U/U L) 0.5 U L0反應(yīng)條件為:94°C變性25sec，72°C延伸3min，7個循環(huán)；94°C變性25sec、67°C退火3min、32個循環(huán)；72°C延伸IOmin0將上述第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，再以試劑盒中提供的巢式引物AP2(5，- ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3，)和 Prol-Nest-SP 引物，以上述同樣體系，94 °C 變性25sec，72°C 延伸 3min，5 個循環(huán)；94°C 變性 25sec，67°C 退火 3min、25 個循環(huán)；72°C 延伸IOmin0 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。(3)擴增片段膠回收、連接、測序及分析
將PCR產(chǎn)物膠回收后連接至pGEM-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，將重組質(zhì)粒pGEM-Pi~0roR2送上海英駿公司測序。測序后獲得的序列長度為1362bp的基因片段，對獲得的基因序列與基因5’端重疊區(qū)序列進行比對，經(jīng)比對準確無誤后，對克隆的序列米用 PlantCARE(http://bioinformatiCS.psb.ugent.be/webtools/plantCare/html/)在線分析工具對所克隆的啟動子片段進行順式元件分析，分析結(jié)果見圖2，結(jié)果表明克隆的序列含有啟動子應(yīng)有的基本元件(TATA-Box和CAAT-Box)和多種順式作用元件。其序列表中SEQ ID N0.1 所示。實施例2植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
1、植物表達載體的構(gòu)建
(I)根據(jù)啟動子序列設(shè)計片段相對應(yīng)的包含III/Bam HI酶切位點的特異性引物，上下游引物分別命名為Pl和P2。Pl:5' -CGCGGATCCTCATTCACCCATCGTAGTCCA-3' ；(SEQ ID N0.4)
P2:5' -CCCCAAGCTTACATGTAGATCCCAACAATAA-3'。(SEQ ID N0.5)
分別用歷'fld III取Bam HI雙酶切pBI121和ProPDR2，回收pBI121載體和ProPDR2啟動子片段。將兩片段連接并轉(zhuǎn)化DH5a，通過卡那霉素篩選、PCR和"i/ d III/Bam HI雙酶切鑒定獲得重組子，重組質(zhì)粒命名為pBI121-ProPDR2::⑶S。(2)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
①在含有IOOii g/mL利福霉素的YEB平板上劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105，28°C暗培養(yǎng)2d。②挑取單菌落接種到含有100 U g/mL利福霉素的YEB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。③將過夜活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50mL含有100 U g/mL的卡那霉索的YEB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600約為0.4-0.6，冰浴30min。④于4°C, 5000rpm 離心 IOmin,棄上清液,用 10mT, 0.15mM NaCl 懸浮菌體。⑤于4°C, 5000rpm離心IOmin,棄上清液,用2mL 20 mM CaCl2懸浮菌體。⑥每管200 ii L分裝，液氮速凍，_70°C保存。(3)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化
①將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞置于冰上，緩慢解凍。②加入0.5 ii g pBI121- ProPDR2 質(zhì)粒 DNA，輕輕混勻，冰浴 30min。③置液氮中冷凍2min，迅速移入37°C水浴中熱激5min，再迅速冰浴2min，之后加A 800 u L YEB液體培養(yǎng)基，于28 °C振蕩培養(yǎng)3_4h。④5000rpm離心5min沉淀菌體,棄掉800ii L上清后重新懸浮菌體,均勻涂布于含有100 u g/mL利福霉素和50 u g/mL卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2_3d。(4)根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取和鑒定 ①PCR鑒定
挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于1.5mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)，用Pi*0roR2啟動子特異性引物進行鑒別，引物如下:
P3:5' -AATTTGTTGGGGGCAGTAGGT-3' ；(SEQ ID N0.6)
P4:5' -GGTCGGTCTTTCACGCTTTG-3' ；(SEQ ID N0.7)
PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預(yù)期片段。PCR反應(yīng)程序如下:94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 30sec，35 個循環(huán)；72°C 2min。②酶切鑒定
挑取PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有100 u g/mL的利福霉素和50 u g/mL的卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中， 28°C培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pBI121-ProroR2::⑶S，采用上述方法以歷id III/Bam HI雙酶切提取的質(zhì)粒。經(jīng)過酶切鑒定正確后獲得含重組質(zhì)粒pBI121-ProPDR2: AUS 的農(nóng)桿菌。2、基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的篩選
(I)含pBI121-ProroR2::⑶S質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)
28°C劃線培養(yǎng)含有pBI121-ProroR2::⑶S質(zhì)粒的農(nóng)桿菌約2d。挑取單菌落接種于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，至0D600約為0.6時收集菌液，4000rpm離心lOmin，沉淀重懸于1/2MS液體培養(yǎng)基中。(2)葉盤法侵染煙草
將煙草benthamiana )幼葉置于自來水中沖洗3_4次,然后在70%乙醇中浸泡30-60sec，10%次氯酸鈉中消毒10_20min，再用無菌水充分沖洗，然后置于無菌培養(yǎng)皿中，將葉片切成0.5-1 cm2的小片，將剪好的葉片分別放入含有pBI121-ProroR2::⑶S質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中侵染5min，將葉片上的菌液用無菌濾紙吸干。(3)共培養(yǎng)
侵染過并吸干表面菌液的葉盤，氣孔面朝上，緊靠著放在共培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L)，黑暗處培養(yǎng) 2d。(4)篩選及分化培養(yǎng)
暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)換到篩選分化培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L+Kan IOOmg/L+Cef 300mg/L),每15d換一次篩選分化培養(yǎng)基,至分化出的煙草長至3_5cm時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中。 (5)生根培養(yǎng)
將分化至3-5cm的煙草分別切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 2.0mg/L)。(6)移栽
當(dāng)再生植株的根長至5-8cm時，打開封口膜煉苗2-3d，將幼苗移栽至花盆內(nèi)，移栽后最初的5-10d罩上透明塑料，保持90%-100%的濕度，并在罩上打些小孔以利于氣體交換。移栽的基質(zhì)以及花盆均預(yù)先消毒。(7)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定
以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，采用上述重組質(zhì)粒鑒定所用的ProroR2基因特異性引物(P3和P4)進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。轉(zhuǎn)基因煙草植株P(guān)CR檢測結(jié)果見圖3，其中廣4號為轉(zhuǎn)化pBI121-ProroR2::⑶S成功并分化成苗的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株，5號為轉(zhuǎn)空載體pBI121成功并分化成苗的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株。(8 ) ProPDR2啟動⑶S表達及其活性檢測
利用GUS能與底物MUG (3,4-甲基傘型酮-￠-葡萄糖醛酸苷)反應(yīng)產(chǎn)生熒光物質(zhì)MU(4-甲基傘型酮)。MU的激發(fā)波長為365nm,發(fā)射波長為456nm,其含量可由突光分光光度計測出。根據(jù)單位質(zhì)量的植物總蛋白在單位時間內(nèi)產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的多少來定量的檢測GUS含量。試劑配制:lmol/LNa2HPO4 溶液:35.814g Na2HPO4 溶于 IOOmL 水。lmol/L NaH2PO4溶液:15.601g NaH2PO4溶于 IOOmL水。0.1M磷酸緩沖液(pH7.0): lmol/L 似2冊04取5.1lmL,lmol/L NaH2PO4 取 4.23mL，定容至 100mL。10% SDS 溶液:將 90mL水稍微加熱，加 IOg SDS,攪拌溶解，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，然后加水定容至IOOmL150.5 M EDTA (pH8.0):在80mL水中加入18.61g Na2EDTA*2H20,用NaOH調(diào)pH至8.0 (約需2g左右的固體NaOH)，溶解后定容至IOOmL0 GUS酶提取液:0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)取50mL ；10% SDS取ImL ；0.5MEDTA(pH8.0)取 2mL;Triton X-100 取 100 y L ; 3 -巰基乙醇 IOOyL;用水定容至 IOOmL0MUG底物:稱8.8mg MUG，溶于IOmL⑶S酶提取液中，配制成2mmol/L的工作濃度。反應(yīng)終止液(0.2 mol/L Na2CO3):稱2.12g Na2CO3，用水定容至100mL?？捡R斯亮藍G250溶液:考馬斯亮藍G250 IOmg, 95%乙醇5ml, H3PO4 IOmL,定容至IOOmL,過濾后4°C保存。I mg/mLBSA:20mg BSA，用GUS提取緩沖液定容至20mL。①植物總蛋白的提取
取轉(zhuǎn)基因植株新鮮的植物組織IOOmg左右，用液氮將生物材料急速冷凍，然后采用液氮研磨的方式在研缽里磨碎組織。如果不立即研磨，可以先將液氮冷凍處理的植物組織儲存于_80°C冰箱。將研磨破碎的組織轉(zhuǎn)到Ep管里，并立即加入ImL的⑶S提取緩沖液，充分混勻。12，000rpm，4°C離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一潔凈的Ep管，冰上放置待用。②蛋白濃度的測定
取 7 個 Ep 管，分別加入 0 ii L、2 ii L、4 ii L、8 u LU2u L、16u L,20u L 的 BSA 標準液，用水補至相同體積20 u L0加入980 u L的考馬斯亮藍G250溶液，充分混勻，冰上靜置5min。用紫外分光光度計測定595nm處的吸收值。以蛋白濃度(mg/mL)對吸收值A(chǔ)595做標準曲線。取待測蛋白樣品10 iiL，加IOii L水，加入980 ii L的考馬斯亮藍G250溶液，充分混勻，冰上靜置5min，用紫外分 光光度計測定595nm處的吸收值，計算蛋白樣品的濃度。③⑶S表達水平的定量測定
取IOOiI L蛋白上清，加入400 i! L 37°C預(yù)熱的⑶S提取緩沖液里，再加入500 i! L MUG底物，37°C溫浴。在0min、15min、30min、45min和60min分別取混合反應(yīng)物200 y L加入到800 u L反應(yīng)終止液，室溫避光保存。用熒光分光光度計在激發(fā)波長365nm、發(fā)射波長455nm下，狹縫IOnm時測定不同時間點的熒光強度值。以熒光強度值對反應(yīng)時間作曲線，求出單位時間的熒光強度變化。用單位時間的熒光強度變化除以參加反應(yīng)的蛋白量，求出單位質(zhì)量的蛋白單位時間的熒光強度變化。圖4和圖5分別為不同組織和不同誘導(dǎo)物作用下轉(zhuǎn)基因煙草中GUS活性與對照煙草(轉(zhuǎn)PBI121空載體)的相對值(倍數(shù))。圖4顯示ProPDR2啟動子表達具有明顯的組織特異性，其在莖中的活性最高，根中次之。圖5結(jié)果顯示ProPDR2啟動子受茉莉酸甲酯(MJ)、水楊酸(SA)和人參皂苷(ginsenosides，GS)的誘導(dǎo)，ProPDR2啟動中包含茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的順式作用元件(TGACG-motif)、水楊酸響應(yīng)順式作用元件(TCA-element)，因此表明ProPDR2啟動子的應(yīng)答反應(yīng)與這些順式作用元件有關(guān)，該啟動子受人參皂苷的誘導(dǎo)，表明該啟動子與人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累有關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種人參PDR跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因啟動子，其特征在于:所述啟動子序列如SEQ IDN0.1所示，或是與SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子,其特征在于:所述啟動子包括ERE元件、TCA元件、TGACG-Motif 和 W-Box。
3.如權(quán)利要求1或2所述的啟動子的制備方法，其特征在于依次為下列步驟:(I)提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構(gòu)建四個啟動子文庫:Dra I文庫、EcoR V文庫、Pvu II文庫和Stu I文庫；(2)分別以構(gòu)建的Dra I文庫、EcoR V文庫、Pvu II文庫和Stu I文庫為模板，根據(jù)人參PgPDR2基因的5'端序列設(shè)計引物，進行PCR擴增；(3)膠回收PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物即得本發(fā)明所述的Pr0H)R2啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的啟動子的制備方法，其特征在于:所述根據(jù)人參PgPDR2基因的5 '端序列設(shè)計的弓I物包括外側(cè)弓丨物Pro3-SP和巢式弓I物Pr03-Nest-SP，外側(cè)弓I物Pro3-SP 如 SEQ ID N0.2 所示，巢式引物 Pro3-Nest_SP 如 SEQ ID N0.3 所示。
5.含有權(quán)利要求1或2所述的啟動子的重組載體，其特征在于:所述重組載體為pBI121-ProPDR2::⑶S，所述空載體為pBI121載體，在ProPDR2啟動子的下游連接⑶S報告基因。
6.如權(quán)利要求5所述的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于依次為下述步驟:(I)根據(jù)啟動子序列設(shè)計片段相對應(yīng)的包含歷'fld III/Bam HI酶切位點的特異性引物，分別用及 HI和Afco I雙酶切pBI121和啟動子ProPDR2，回收pBI121載體和ProPDR2啟動子片段；(2)將PBI121和ProPDR2兩片段連接并轉(zhuǎn)化DH5a ; (3)通過卡那霉素篩選、PCR和及 HI/AfcoI雙酶切鑒定，即獲得所述重組載體pBI121-ProroR2::⑶S。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法`，其特征在于:在所述步驟(I)中根據(jù)啟動子序列設(shè)計片段相對應(yīng)的包含歷'fld III/Bam HI酶切位點的特異性引物如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:步驟(3)中PCR鑒定的引物對如SEQID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的啟動子ProPDR2在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運積累和人參育種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的重組載體pBI121-ProroR2::⑶S在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運積累中和人參育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人參PDR跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因啟動子ProPDR2及其應(yīng)用，所述啟動子至少含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或是與SEQIDNO.1具有99%以上同源性的DNA序列，該序列包含ERE元件、TCA元件、TGACG-Motif和W-Box。本發(fā)明還構(gòu)建了啟動子表達載體pBI121-ProPDR2::GUS，并研究表明在該啟動子啟動表達GUS的轉(zhuǎn)基因煙草中可較強地受人參皂苷、水楊酸、茉莉酸甲酯和脫落酸的調(diào)控，表明該啟動子參與調(diào)控人參皂苷的轉(zhuǎn)運和積累，可以通過該啟動子或其衍生物調(diào)控或改良人參及其它植物。
文檔編號C12N15/10GK103103193SQ20131004366
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者羅志勇, 張儒, 曹宏哲, 黃景嘉, 陳湘暉, 楊芳 申請人:中南大學(xué)