專利名稱：一種油菜單粒種子基因組dna高通量快捷提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油菜單粒種子基因組DNA提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的深入發(fā)展，各種生物技術(shù)方法日益成熟，尤其是基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，在種子純度鑒定、種子轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、種質(zhì)資源多樣性研究等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。DNA是生物遺傳信息的載體，無(wú)論是分子標(biāo)記技術(shù)還是遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定，前提都是基因組DNA的提取。目前用于油菜DNA提取的方法有SDS法、CTAB法、高鹽法和試劑盒法，提取方法已被很多研究人員優(yōu)化，但大多針對(duì)油菜葉片進(jìn)行，取材時(shí)需要油菜生長(zhǎng)到一定的階段，這個(gè)過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以利用油菜葉片提取DNA的方法不利于在種子快速檢測(cè)中推廣使用。如何快速簡(jiǎn)便的從油菜種子中提取出基因組DNA，科研人員一直在做著探索。張富麗等(農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)(英文版)，2012年第13卷第3期485-488)將多粒種子混合，打磨成粉，取IOOmg粉末加入高鹽提取液抽提基因組DNA，該方法雖然省去了油菜成苗，避免了液氮研磨，但使用了苯酚、氯仿等有毒有機(jī)溶劑，步驟仍然比較繁瑣；謝景梅等(作物雜志，2012年第I期17-21)直接以油菜干種子和發(fā)芽種子提取基因組DNA，采用改良的CTAB法，提取效果較好，但該方法仍然需要液氮研磨、氯仿抽提等步驟，并未有多大改進(jìn)。綜上所述，目前提取油菜基因組DNA的方法普遍存在著操作繁瑣、提取時(shí)間長(zhǎng)、陳本較高等不足之處。另外，以 油菜單粒種子為材料的基因組DNA提取報(bào)道較少，但油菜雜交種為了保證純度，從田間收獲到包裝之前有限的時(shí)間內(nèi)，必須進(jìn)行雜種純度鑒定，需要快速提取油菜單粒種子的基因組DNA，之前的DNA提取方法不適應(yīng)這種需要。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種油菜單粒種子基因組DNA快捷提取方法，用該方法提取油菜種子基因組DNA時(shí)間短、陳本低、操作簡(jiǎn)便、高通量、后續(xù)DNA吸取方便，提取的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量完全滿足PCR反應(yīng)的需要。技術(shù)方案
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種油菜單粒種子基因組DNA高通量快捷提取方法，其特征在于包括以下步驟
(1)發(fā)芽在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪濾紙，加水至完全濕潤(rùn)濾紙，將油菜種子均勻撒在濾紙上，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放入培養(yǎng)箱中，37°C暗培養(yǎng)12-16小時(shí)至根長(zhǎng)3-5mm ；
(2)取材將破皮萌發(fā)的油菜種子去種皮，放入0.2mL 96孔PCR板，每孔一粒；
(3)裂解每孔加20 u L 0. 25mol/L NaOH,在 PCR 儀上 99. 9 V Imin ；
(4)提取每孔加5u L lmol/L HCl 中和，再加入 25 u L 0. 5mol/L Tris-HCl (pH8. 0)，在 PCR 儀上 99.9 °C 3min ；(5)沉淀待PCR板自然冷卻，用鑷子取出提取液中油菜種子，加入IOOyL預(yù)冷無(wú)水乙醇，蓋上PCR板封口膜，上下?lián)u勻20次；
(6)離心板式離心機(jī)離心PCR板,3000rpm,IOmin,棄上清；
(7)干燥將PCR板置入真空干燥儀，35°C真空干燥5min；
(8)溶解每管加入50μ L滅菌ddH20，37°C完全溶解DNA，4°C保存。有益效果
本發(fā)明以油菜芽種為材料，快速基因組DNA的方法，次方法具有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)所需用于提取基因組DNA的材料為油菜單粒種子，只需將種子發(fā)芽，省去成苗的步驟，節(jié)省了材料準(zhǔn)備時(shí)間，為油菜種子質(zhì)量的快速鑒定以及油菜種質(zhì)資源分子水平上的多樣性研究提供了高效可行的技術(shù)途徑。(2)簡(jiǎn)化了操作步驟，使用O. 2mL 96孔PCR板，配合多通道移液器，用PCR儀加溫代替水浴，提取全程操作簡(jiǎn)便迅速，能在短時(shí)間內(nèi)提取大量樣品DNA，一個(gè)熟練的科研人員在8小時(shí)工作時(shí)間內(nèi)至少能完成10X96個(gè)單粒種子DNA的提取，具有高通量提取的優(yōu)點(diǎn)，比常用的CTAB、SDS等方法的提取效率高5倍以上。(3)提取的基因組DNA質(zhì)量較高，瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳條帶清晰，降解少，紫外分光廣度計(jì)測(cè)得濃度在90-125ng/ μ L之間，可以直接用于PCR反應(yīng)，完全滿足PCR擴(kuò)增的需要。(4)相對(duì)其他方法，無(wú)需液氮研磨，無(wú)需種子粉碎，無(wú)需氯仿抽提，所用試劑顯著減少，節(jié)本高效。


圖1為本發(fā)明方法提取的油菜單粒種子基因組DNA的電泳圖，其中，M :5kb DNAMarker ;其他油菜單粒種子基因組DNA。圖2為以本發(fā)明方法提取的油菜單粒種子基因組DNA為模板的SSR-PCR擴(kuò)增圖。M 50bb DNA Marker ;其他以4個(gè)單粒種子DNA為模板，9對(duì)SSR引物的擴(kuò)增電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體的實(shí)施方式的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅作實(shí)例說(shuō)明。提取油菜單粒種子基因組DNA的方法如下
一、材料
甘藍(lán)型油菜“寧雜27”為江蘇省審定的油菜雜交品種，提取基因組DNA種子為“寧雜27”制種大棚收獲的雜交種子。二、試劑
O. 25mol/L NaOH ；ImoI/L HCl ；0. 5mol/L Tris-HCl (pH8. 0);無(wú)水乙醇。三、提取基因組DNA
提取基因組DNA的具體步驟如下
(I)發(fā)芽在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪濾紙，加水至完全濕潤(rùn)濾紙，將油菜種子均勻撒在濾紙上，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放入培養(yǎng)箱中，37°C暗培養(yǎng)16小時(shí)(過(guò)夜)至根長(zhǎng)3-5_ ；(2)取材將破皮萌發(fā)的油菜種子去種皮，放入O.2mL 96孔PCR板，每孔一粒；
(3)裂解每孔加20 μ L O. 25mol/L NaOH,在 PCR 儀上 99. 9 V Imin ；
(4)提取每孔加5 μ L lmol/L HCl 中和，再加入 25 μ L O. 5mol/L Tris-HCl (ρΗ8· O)，在 PCR 儀上 99.9 °C 3min ；
(5)沉淀待PCR板自然冷卻，用鑷子取出提取液中油菜種子，加入IOOyL預(yù)冷無(wú)水乙醇，蓋上PCR板封口膜，上下?lián)u勻20次；
(6)離心板式離心機(jī)離心PCR板,3000rpm,IOmin,棄上清；
(7)干燥將PCR板置入真空干燥儀，35°C真空干燥5min ；
(8)溶解每管加入50μ L滅菌ddH20，37°C完全溶解DNA，4°C保存。四、對(duì)上述提取的DNA的檢測(cè)1、紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度
將溶解的DNA稀釋50倍(吸取40 μ L DNA，加滅菌ddH20至2mL)，以滅菌ddH20為零對(duì)照，用紫外分光廣度計(jì)測(cè)0D260和0D280,結(jié)果0D260值在O. 090-0. 125之間，0D280值在O. 053-0. 074之間，0D260/0D280比值為1. 7左右。用本方法提取的種子基因組DNA的純度較好，污染少。根據(jù)0D260 = I時(shí)，dsDNA濃度約為50 μ g /ml的標(biāo)準(zhǔn)換算，所提取的種子基因組DNA 的濃度為 90-125ng/ μ L ；0D260/0D280 比值為1. 7，根據(jù)純 DNA 的 0D260/0D280 ^1. 8(0D260/0D280 > 1.9，表明有RNA污染；0D260/0D280 <1. 6，表明有蛋白質(zhì)、多糖等污染)的標(biāo)準(zhǔn)。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
取提取的油菜單粒種子基因組DNA樣品5 μ L進(jìn)行1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，8V/cm,電泳20min,EB染色,在凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。結(jié)果如圖1所示，用本方法所提取DNA樣品的電泳條帶清晰，降解少，所有DNA濃度較一致。3、SSR-PCR擴(kuò)增檢測(cè)所提取DNA質(zhì)量
直接以本方法提取的DNA為模板，用李海渤等(中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2010年第32卷第3期329-336)篩選的多對(duì)甘藍(lán)型油菜SSR核心引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為DNA模板lul、上下游引物各 O. 2ymol/L、lXPCR Buffer,2. O mmol/L MgCl2、200 μ mol/L dNTPs、0. 5UTaq 酶，ddH20 補(bǔ)足 10 μ L0 PCR 程序?yàn)?4°C 預(yù)變性 4min ;94°C變性 40s, 60°C (-0. 5°C /循環(huán))退火30s，72°C延伸40s，10個(gè)循環(huán)；94°C變性40s，55°C退火30s，72V延伸40s，25個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min ；Hold 12°C結(jié)束。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，8V/cm，電泳90min，銀染染色(張潔夫等，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004年第20卷第4期225-229)。結(jié)果如圖2所示，每對(duì)SSR引物均能成功擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，片段大小與預(yù)期一致，表明用本方法提取的油菜種子基因組DNA能夠滿足基于PCR等分子生物學(xué)試驗(yàn)的需要。本發(fā)明方法也為適用于油菜多粒種子混合提取基因組DNA，只需將反應(yīng)容器和反應(yīng)體積相應(yīng)放大；該方法也為其他材料提取DNA提供了新思路。
權(quán)利要求
1.一種油菜單粒種子基因組DNA高通量快捷提取方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)發(fā)芽在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪濾紙，加水至完全濕潤(rùn)濾紙，將油菜種子均勻撒在濾紙上，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放入培養(yǎng)箱中，37°C暗培養(yǎng)12-16小時(shí)至根長(zhǎng)3-5mm ； (2)取材將破皮萌發(fā)的油菜種子去種皮，放入0.2mL 96孔PCR板，每孔一粒；(3)裂解每孔加20 u L 0. 25mol/L NaOH,在 PCR 儀上 99. 9 V Imin ；(4)提取每孔加5u L lmol/L HCl 中和，再加入 25 u L 0. 5mol/L Tris-HCl (pH8. 0)，在 PCR 儀上 99.9 °C 3min ； (5)沉淀待PCR板自然冷卻，用鑷子取出提取液中油菜種子，加入IOOuL預(yù)冷無(wú)水乙醇，蓋上PCR板封口膜，上下?lián)u勻20次； (6)離心板式離心機(jī)離心PCR板,3000rpm,IOmin,棄上清； (7)干燥將PCR板置入真空干燥儀，35°C真空干燥5min ； (8)溶解每管加入50iiL滅菌ddH20，37°C完全溶解DNA，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種油菜單粒種子基因組DNA高通量快捷提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括發(fā)芽；取材；裂解；提??；沉淀；離心；干燥；溶解；保存等步驟，用PCR儀代替水浴，提取全程使用96孔PCR板，配合多通道移液器操作。用本發(fā)明方法提取油菜種子基因組DNA時(shí)間短、陳本低、操作簡(jiǎn)便、高通量、后續(xù)DNA吸取方便，提取的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量完全滿足PCR反應(yīng)的需要。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103060311SQ201310044228
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者陳鋒, 張潔夫, 戚存扣, 陳松, 浦慧明, 付三雄 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院