專利名稱：一種魚類NK-lysin效應(yīng)因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種魚類NK-1ysin效應(yīng)因子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NKC)是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。這些細(xì)胞在受到刺激時(shí)分泌一系列引起祀細(xì)胞凋亡和殺傷的效應(yīng)因子，其中一種即為NK-lysin。NK-1ysin是saposin家族的一員，具有典型的saposin結(jié) 構(gòu)域。在哺乳動(dòng)物中，NK-1ysin是一種抗菌肽，具有廣譜的抑菌活性。因此，NK-1ysin在細(xì)菌性疾病的防治中有良好的應(yīng)用前景。ΝΚ-lysin目前只在五種硬骨魚中發(fā)現(xiàn)，但其功能、應(yīng)用等尚待研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種ΝΚ-lysin效應(yīng)因子及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種魚類ΝΚ-lysin效應(yīng)因子，ΝΚ-lysin為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。NK-1 ysin效應(yīng)因子的制備方法，以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)±曾，PCR產(chǎn)物純化后與質(zhì)粒PIRES2-EGFP用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的質(zhì)粒pCNKl ;所述Fl為5， -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3， ；R1 為 5， -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。ΝΚ-lysin效應(yīng)因子的應(yīng)用，所述ΝΚ-lysin效應(yīng)因子用于制備抗細(xì)菌或病毒的藥物。將含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的質(zhì)粒pCNKl在PBS中稀釋至200ug/ml。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的NK-1ys in表達(dá)質(zhì)粒注射魚類后能夠明顯提高魚類的抗病毒和抗細(xì)菌感染能力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法:1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。
實(shí)施例1本發(fā)明的NK-1ysin為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID N0.1 為:MNKSPILLFCILAACSVWSVHGKSQEMNIDDEEPAEVELPVEAKPPGLCWGCKWALNKVKKAMTQKETYEKVKAR LIKICNKIGFLKSRCHKFVITHLDELVEELSTTDDVKTICVNVKACNPKEPSHLLFYPNN(a)序列特征: 長度:135 (有效作用區(qū)域47 — 121) 類型:氨基酸序列籲鏈型:單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(b)分子類型:蛋白質(zhì)(C)假設(shè):否(d)反義:否( e )最初來源:半滑舌鰨結(jié)構(gòu)特點(diǎn):該蛋白預(yù)期含有一個(gè)Saposin B功能域(氨基酸47 — 121)。實(shí)施例2NK-1ysin表達(dá)質(zhì)粒pCNKl的構(gòu)建:以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為:94 V 60s預(yù)變性模板DNA，然后94 °C 40s, 50 V 60s, 72 V 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為940C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 30個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)7 — IOmin0 PCR產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá)載體pIRES2-EGFP (購于美國Clontech公司)用限制性內(nèi)切酶SmaI酶切后回收5kb片段，將其與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pCNKl。通過DNA測(cè)序分析證明了 pCNKl為含有實(shí)施例1NK-1ysin序列的表達(dá)質(zhì)粒。所述LB組成成分按重量百分比計(jì):1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97.5%蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3’ ;R1 為 5’ -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。實(shí)施例3NK-1ys in表達(dá)質(zhì)粒pCNKl的應(yīng)用步驟I)質(zhì)粒注射將上述實(shí)施例2的pCNKl在PBS中稀釋至200ug/ml，即為pCNKl稀釋液。將20條半滑舌鰨(重約5.1g)隨機(jī)分為4組，每組5條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚分別注射50 ulpCNKl稀釋液，將B和D組(對(duì)照組)的每條魚分別注射50 ulPBS。所述PBS組 成成分按重量百分比計(jì):0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024% NaH2PO4,余量為水。步驟2)細(xì)菌和病毒懸液制備在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)鰻弧菌C312至OD6tltl為0.8，然后離心(5000g，4 V，IOmin),收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為I xl07cfu/ml，即為鰻弧菌懸液。將細(xì)胞腫大病毒RBIV-Cl (具體制備方法見Zhang M, Xiao Z, HuY, Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012; 43:556 - 64)于 PBS 中稀釋至5xl05copies/ml,即為病毒懸液。所所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.6250，保藏日期2012.6.21，分類命名為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。步驟3)攻毒感染

在上述步驟I)注射后第7天，將A和B組的每條魚注射50ul上述步驟2)的鰻弧菌懸液，將C和D組的每條魚注射50ul上述步驟2)的病毒懸液。在感染后24h，取魚腎臟和脾臟組織。將A和B組魚的組織在2ml PBS中勻漿，將IOOul勻漿液涂布于LB平板。將平板置于30°C培養(yǎng)48h，計(jì)算出現(xiàn)的菌落數(shù)。利用DNA提取試劑盒(購于天根生化科技(北京)有限公司”)從C和D組魚腎臟和脾臟組織中提取DNA，用絕對(duì)定量PCR法檢測(cè)組織中病毒含量(具體方法見上述參考文獻(xiàn))。結(jié)果表明A組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)(分別為IxlO5和8xl05)顯著(P〈0.01)低于B組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)(分別為4.2xl05和2.7xl06)；C組魚腎臟和脾臟的病毒數(shù)(分別為IxlO8和IxlO9)顯著(P〈0.01)低于D組魚腎臟和脾臟的病毒數(shù)(分別為3.4xl08和4.3xl09)。這些結(jié)果表明，ΝΚ-lysin能夠顯著增強(qiáng)魚類抵抗細(xì)菌和病毒的侵染。
權(quán)利要求
1.一種魚類NK-1ysin效應(yīng)因子，其特征在于:NK_lysin為序列表SEQID N0.1中的氨基酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述NK-1ysin效應(yīng)因子的制備方法，其特征在于: 以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)±曾，PCR產(chǎn)物純化后與質(zhì)粒PIRES2-EGFP用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的質(zhì)粒pCNKl ;所述Fl為5， -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3， ；R1 為 5， -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。
3.一種權(quán)利要求1所述NK-1ys in效應(yīng)因子的應(yīng)用，其特征在于:所述NK-1ysin效應(yīng)因子用于制備抗細(xì)菌或病毒的藥物。
4.按權(quán)利要求3所述NK-1ysin效應(yīng)因子的應(yīng)用，其特征在于:將含SEQIDN0.1中氨基酸序列所示的質(zhì)粒pCNKl在 PBS中稀釋至200ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種半滑舌鰨NK-lysin及其應(yīng)用。NK-lysin為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。應(yīng)用方法以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體后得質(zhì)粒pCNK1，將其注射魚類，即能顯著增強(qiáng)魚類的抗病毒和抗細(xì)菌能力。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103145822SQ20131004456
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者張敏, 孫黎 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所