用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（PRRSV）培養(yǎng)的細(xì)胞株及其應(yīng)用。該細(xì)胞株對(duì)PRRSV高度敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖高滴度PRRSV。該細(xì)胞株無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險(xiǎn)，安全性高。將該細(xì)胞株用于PRRSV的增殖培養(yǎng)，其較之Marc145母細(xì)胞更有利于PRRSV的復(fù)制與增殖。因此，采用該細(xì)胞株進(jìn)行高滴度PRRSV的增殖培養(yǎng)有利于獲得有關(guān)PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進(jìn)行更加直接有效的研究。對(duì)PRRSV高敏感的猴腎細(xì)胞系Marc145-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究與疫病防治過(guò)程中具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧類(lèi)生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細(xì)胞株，以及該細(xì)胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(Porcinreproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種豬的高度傳染性疾病，又稱(chēng)豬藍(lán)耳病。本病以妊娠母豬的繁殖障礙(流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道癥狀為特征。該病自1987年在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，曾經(jīng)迅速傳遍世界各個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家，在豬群密集、流動(dòng)頻繁的地區(qū)更易流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，該病在我國(guó)呈現(xiàn)明顯的高發(fā)趨勢(shì)，能引起不同品種、不同日齡、不同飼養(yǎng)管理模式的保育豬、仔豬和懷孕豬高發(fā)病率、高死亡率，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的損失。
[0003]PRRSV病毒的穩(wěn)定性受PH和溫度的影響較大，在PH小于5或大于7的條件下，其感染力降低95%以上；在PH7.5的培養(yǎng)液中可于_20°C和_80°C長(zhǎng)期保存，在4°C則緩慢失去感染力；對(duì)有機(jī)溶劑敏感，對(duì)常用的化學(xué)消毒劑抵抗力不強(qiáng)。
[0004]PRRSV病毒能在多種細(xì)胞上生長(zhǎng)，但Marcl45是目前各實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)PRRSV最常用的細(xì)胞。用Marcl45細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒，細(xì)胞病變以聚集為特征，由于細(xì)胞病變死亡，病毒無(wú)法繼續(xù)繁殖，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融收獲病毒液，病毒液只能收獲一次，收獲量小，病毒滴度低，強(qiáng)毒病毒含量在106_°~107_°TCID5(l/ml,弱毒毒株病毒含量在108_°~108 5TCID5Q/ml?？梢?jiàn)，現(xiàn)有的Marcl45細(xì)胞雖然適合PRRSV的增殖，但是病毒滴度比較低，病毒含量不能滿(mǎn)足疫苗和診斷抗原的制備。
[0005]因此，目前存在的問(wèn)題是為了獲得關(guān)于疫苗、診斷試劑盒等治療手段的更全面信息，進(jìn)行更加直接有效的研究，需要克隆出一株對(duì)PRRSV高度敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖高滴度PRRSV的Marc 145細(xì)胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于PRRSV培養(yǎng)的細(xì)胞株，該細(xì)胞株對(duì)PRRSV高度敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖高滴度PRRSV。該細(xì)胞株無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險(xiǎn)，安全性高。
[0007]本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種上述細(xì)胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用。該細(xì)胞株較之Marcl45母細(xì)胞更有利于PRRSV的復(fù)制與增殖，采用該細(xì)胞株進(jìn)行高滴度PRRSV的增殖培養(yǎng)有利于獲得有關(guān)PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進(jìn)行更加直接有效的研究。
[0008]為此，本發(fā)明提供了一種用于PRRSV培養(yǎng)的細(xì)胞株，其中，所述細(xì)胞株為猴腎細(xì)胞系 Marc 145-1 株(Monke y kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏編號(hào)為:CCTCCN0:C2012185，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年12月10日。上述培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
[0009]本發(fā)明中，所用術(shù)語(yǔ)“猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株”是指從猴腎細(xì)胞系Marcl45母細(xì)胞克隆獲得的新細(xì)胞株，也稱(chēng)為Marcl45-1細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)Marcl45_l。
[0010]本發(fā)明中，所述猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株具有以下特征:
[0011](1)從形態(tài)上觀察，猴腎細(xì)胞系Marc 145-1株比Marc 145母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞之間界限明顯，整齊，細(xì)胞折光性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿(mǎn)，核質(zhì)清晰。細(xì)胞易于傳代和瓶壁分離。細(xì)胞變小，密度增大。
[0012](2)對(duì)PRRSV具有高敏感性；
[0013](3)病毒增殖過(guò)程中細(xì)胞的病變特征表現(xiàn)為細(xì)胞崩解，收獲的病毒液為Marcl45母細(xì)胞的4倍，病毒滴度提高f 2個(gè)滴度，并且這種敏感性可以穩(wěn)定遺傳；
[0014](4)細(xì)胞生長(zhǎng)速度變快，倍增時(shí)間提前了 Id (天)。
[0015]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株通過(guò)以下方法構(gòu)建完成，其包括:
[0016]步驟一，Marc 145細(xì)胞有限稀釋法克隆培養(yǎng)
[0017]將實(shí)驗(yàn)室保存的無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45細(xì)胞(哈爾濱獸醫(yī)研究所)經(jīng)胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋?zhuān)缓蠓謩e接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)l(Tl4d，挑選有單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng)，并依次將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到12孔板、6孔板、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，獲得亞克隆細(xì)胞株；
[0018]步驟二，對(duì)豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒敏感的Marcl45細(xì)胞株的篩選。
[0019]挑選細(xì)胞狀態(tài)比較好的幾株克隆細(xì)胞分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層接種豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒，于37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞病變，并以未接毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，挑選病變最明顯的Marcl45細(xì)胞株進(jìn)行傳代，獲得Marcl45-1株，即，猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株，并用液氮保存。
[0020]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述的細(xì)胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用，其包括:
[0021]步驟B，將豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒接種于猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株進(jìn)行培養(yǎng);
[0022]步驟C，收獲病毒液。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，在步驟B中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在步驟B之前還包括步驟A，培養(yǎng)猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株。在步驟A中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
[0025]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在步驟C之后還包括步驟D，對(duì)步驟C中收獲的病毒液進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強(qiáng)毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株CH-1R株以及豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株HBR株。
[0027]優(yōu)選地，所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強(qiáng)毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株及豬繁殖以及呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株。
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，采用猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株對(duì)豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl株的增殖培養(yǎng)。將猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液，于37°C 5%C02條件下48h可以長(zhǎng)成單層，0.001M0I接種豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl株，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37°C培養(yǎng)36~48h有80%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，以細(xì)胞崩解為主要特征，分別收獲上清液和細(xì)胞中的病毒，豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl株的滴度均可以達(dá)到IO8 tlTCID5ci/ml ο
[0029]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，采用猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株對(duì)豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXAl-R株的增殖培養(yǎng)，收獲的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒NVDC-JXA1-R株病毒液的滴度均可以達(dá)到109_ 5TCID5ciAil。
[0030]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，采用猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株對(duì)豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株的增殖培養(yǎng)，收獲的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株病毒液的滴度均可以達(dá)到109_ 5TCID5tZml。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株形態(tài)均一，生長(zhǎng)性能好，生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”型，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度穩(wěn)定，可連續(xù)傳代，在連續(xù)傳代過(guò)程中，每隔5代對(duì)其進(jìn)行純凈性、病毒敏感性檢測(cè)，每隔10代對(duì)其進(jìn)行“致畸、致瘤、致病變”試驗(yàn)，結(jié)果表明，該細(xì)胞株無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險(xiǎn)，安全性高。 [0032]該猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株在接種PRRSV后，病變特征發(fā)生了一些變化，表現(xiàn)為細(xì)胞崩解，且收獲的病毒液為Marcl45母細(xì)胞的4倍,病毒滴度測(cè)定表明，猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株較之Marcl45母細(xì)胞更有利于PRRSV的復(fù)制與增殖，PRRSV病毒含量提高了1-2個(gè)滴度，并且這種敏感性可以穩(wěn)定遺傳，在傳代至50代內(nèi)沒(méi)有丟失，仍能保持這種對(duì)病毒的高敏感性。經(jīng)檢測(cè)，猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株沒(méi)有細(xì)菌、真菌、支原體以及常見(jiàn)的幾種交叉感染病毒等外源污染。因此，采用該細(xì)胞株進(jìn)行高滴度PRRSV的增殖培養(yǎng)有利于獲得有關(guān)PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進(jìn)行更加直接有效的研究。對(duì)PRRSV高敏感的猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究與疫病防治過(guò)程中具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為實(shí)施例2中Marcl45母細(xì)胞和Marcl45_l細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)比對(duì)結(jié)果。
[0034]圖1中的坐標(biāo)軸含義如下:縱坐標(biāo)活細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/孔)；橫坐標(biāo)為時(shí)間(d)。
[0035]mmm
[0036]猴腎細(xì)胞系Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marc 145-1),由普萊柯生物工程股份有限公司篩選獲得，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年12月10日，保藏編號(hào):CCTCC N0:C2012185o
【具體實(shí)施方式】[0037]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0038]實(shí)施例
[0039]實(shí)施例1:Marcl45細(xì)胞系的克隆和篩選
[0040]1.Marc 145細(xì)胞有限稀釋法克隆培養(yǎng)
[0041]將實(shí)驗(yàn)室保存的無(wú)支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒污染的Marcl45細(xì)胞(哈爾濱獸醫(yī)研究所)經(jīng)胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋?zhuān)缓蠓謩e接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，370C 5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)l(Tl4d，挑選有單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng)，并依次將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到12孔板、6孔板、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，獲得亞克隆細(xì)胞株；
[0042]2.對(duì)豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒敏感的Marcl45細(xì)胞株的篩選
[0043]挑選細(xì)胞狀態(tài)比較好的幾株克隆細(xì)胞分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層接種NVDC-JXAl病毒(0.001M0I)，37°C吸附lh，接毒后48h觀察細(xì)胞病變，并以未接毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，挑選病變最明顯的Marcl45細(xì)胞克隆株進(jìn)行傳代，獲得Marcl45克隆細(xì)胞，亦即猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株，并用液氮保存。
[0044]實(shí)施例2:猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株的生物學(xué)性狀研究 [0045]1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)
[0046]分別接長(zhǎng)成單層的Marcl45母細(xì)胞和猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株制備成細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照8 X IO4個(gè)/cm2接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含8%~?Ο%胎牛血清的DMEM生長(zhǎng)液，于37°C 5%C02條件下培養(yǎng)48h，觀察兩者的細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞貼壁良好、形態(tài)飽滿(mǎn)、界限清晰，表面光滑。猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株較Marcl45母細(xì)胞變小，密度增大，細(xì)胞之間的界限更明顯、整齊，細(xì)胞折光性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿(mǎn)，核質(zhì)清晰。
[0047]2.細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
[0048]將長(zhǎng)滿(mǎn)單層的Marcl45母細(xì)胞和猴腎細(xì)胞系Marcl45_l株制備成細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照8 X IO4個(gè)/cm2接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含8%~10%胎牛血清的DMEM生長(zhǎng)液，于37°C 5%C02條件下培養(yǎng)。24h后取3瓶細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，三次測(cè)定結(jié)果取平均值。以后每隔24h取3瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)一次，連續(xù)計(jì)數(shù)7d。
[0049]根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(見(jiàn)表1)，以活細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/孔)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)。
[0050]用下列公式計(jì)算細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(μ )和分裂指數(shù)(Cd)。
「 nInXn-1nX11-1
[0051]μ =-

tn - tn -1
[0052]其中，X代表每毫升活細(xì)胞數(shù)目；t代表采樣的時(shí)間點(diǎn)；n代表采樣點(diǎn)。
[0053]

細(xì)胞培養(yǎng)最后的密度
—°82 細(xì)胞接種的密度
[0054]表1細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測(cè)對(duì)比結(jié)果
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種用于豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)的細(xì)胞株，其中，所述細(xì)胞株為猴腎細(xì)胞系 Marcl45_l 株(Monkey kidney cell line strain Marcl45_l),其保藏編號(hào)為:CCTCCN0:C2012185，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞株，其特征在于:所述培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞株在豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用，其包括: 步驟B，將豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒接種到猴腎細(xì)胞系Marcl45-1株進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟C,收獲病毒液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:在步驟B中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:在步驟B之前還包括步驟A，培養(yǎng)猴腎細(xì)胞系 Marcl45_l 株。
6.根據(jù)權(quán)利要求 5所述的應(yīng)用，其特征在于:在步驟A中，所述的培養(yǎng)為增殖培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:在步驟C之后還包括步驟D，對(duì)步驟C中收獲的病毒液進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求3~7中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于:所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強(qiáng)毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXAl-R株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株CH-1R株以及豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株HBR株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒包括豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒強(qiáng)毒株NVDC-JXAl株、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株及豬繁殖以及呼吸系統(tǒng)綜合征病毒CH-1R株。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103966157SQ201310046123
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月5日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司