專利名稱：一種適用于三磷酸腺苷分析的固定熒光素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)分析領(lǐng)域，更確切的說是一種新的適用于三磷酸腺苷分析的固定熒光素酶的制備方法。
背景技術(shù)：
微生物的檢測無論是在臨床檢測還是在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域都具有重要的意義。當(dāng)前，對微生物的檢測主要采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計數(shù)法，該方法需要較長的時間對微生物在一定條件下進行培養(yǎng)，然后進行平板計數(shù)以獲取微生物的濃度。平板技術(shù)法步驟繁瑣、耗時長，很多時候難以滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。ATP生物熒光檢測法是近幾年發(fā)展起來的一種新的微生物檢測方法，它具有快速、準確、靈敏等諸多優(yōu)點。ATP(adenosine triphosphate,中文三磷酸腺苷)作為重要的能量分子存在于所有的生物體內(nèi)，通過測定一定條件下ATP的數(shù)量，可以間接推斷微生物的數(shù)量或濃度。ATP生物熒光檢測法利用微生物細胞內(nèi)的三磷酸腺苷(ATP)與熒光素-熒光素酶間的復(fù)雜生化反應(yīng)，產(chǎn)生生物熒光，然后通過熒光測定儀或液閃測定儀測定熒光強度。在熒光素、熒光素酶、溫度、PH等外界條件相同的情況下，上述熒光強度與ATP的數(shù)量成正比關(guān)系。`熒光素酶+Mg2+
ATP+熒光素+O2 — AMP + PPi +氧化熒光素+光但是，上述方法長期以來受到螢光素酶穩(wěn)定性的巨大挑戰(zhàn)，外界環(huán)境如光、氧氣、溫度、pH、甚至濃度，都會極大地減低酶的活性。迄今，已經(jīng)提出了幾種上述問題的解決方法。例如，可以通過添加還原劑如DTT等減小酶的被氧化副作用，加入牛血清蛋白提高對酶的保護作用，加入輔酶提高螢光素酶的反應(yīng)熒光強度。美國專利(U.S.Pat.N0.4，833，075)則采用豬皮膠制備成生物膜，經(jīng)戊二醛交聯(lián)后作為載體，制備固定熒光素酶。但上述方法存在制備繁瑣、價格較高等缺點。此外，它們的穩(wěn)定性仍然不夠令人滿意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有ATP生物熒光檢測中存在的酶穩(wěn)定性問題，提供一種方便和有效的固定螢光素酶制備方法。本申請人發(fā)現(xiàn),半乳甘露聚糖(Galactomannan,簡寫為半乳甘露聚糖)等植物多糖可以在醇(如異丙醇)存在的情況下，在水溶液中形成顆粒狀懸浮液，水溶液中的螢光素酶可以吸附固定于該懸浮液中的植物多糖顆粒上，將上述固定有螢光素酶的半乳甘露聚糖經(jīng)過濾干燥后，可以極大的提高螢光素酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明提供的制備固定有螢光素酶的植物多糖的步驟是:I)制備螢光素酶溶液:將螢光素酶、還原劑及其它成分如熒光素、牛血清蛋白、Mg2+、螯合劑等按照一定比例配成溶液，獲得第一種溶液；
2)配制半乳甘露聚糖溶液:首先配制一定濃度的醇溶液，然后在上述醇溶液中按照一定的配比加入半乳甘露聚糖，攪拌，呈現(xiàn)懸浮狀液體，獲得第二種溶液；3)將上述第一種和第二種溶液混合，輕輕攪拌一定時間，獲得第三種混合液；4)將上述第三種溶液過濾、干燥，獲得固定有螢光素酶的植物多糖，稱為固定螢光素酶。第一種混合液中所用的還原劑包括但不限于二硫蘇糖醇(DTT)、乙醇胺、巰基乙醇等以及它們的混合物。所述的還原劑的濃度為0.1 100mM/L。第二種混合液中所用的半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖包括但不限于胡蘆巴膠、關(guān)華豆膠、塔拉膠、刺槐豆膠、角豆膠、蘆薈膠、魔芋膠等以及它們的混合物。所述的半乳甘露聚糖的濃度為0.1 % 99%
第二種混合液中所用的醇溶液中的醇包括但不限于乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、異丙醇、異丁醇、異戊醇、環(huán)戊醇、環(huán)己醇、乙二醇、丙二醇等。所述的醇的濃度為30% 70%。上述發(fā)明還提供了一種固定螢光素酶材料。


圖1示出了固定螢光素酶和液體螢光素酶在室溫條件(20°C )下置放不同時間后的螢光強度對比。圖2示出了螢光素酶和半乳甘露聚糖接觸不同時間下螢光素酶活性保持率的變化關(guān)系。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例進一步闡述本發(fā)明的特點和優(yōu)點。但是，應(yīng)該明白，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明的優(yōu)點在于:針對現(xiàn)有ATP生物熒光檢測中酶穩(wěn)定性存在的問題，提供一種方便和有效的固定螢光素酶及其制備方法。上述方法制備的固定螢光素酶穩(wěn)定性好，使用方便，且價格較低，具有工業(yè)實用價值。實施例1熒光素酶溶液由以下成分組成::蟲突光素酶:5mg/mL蟲突光素:1.5mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%DTT: ImMEDTA:50mM
按照上述成分組成配制螢光素酶溶液，將螢光素酶、熒光素、TRICINE緩沖液、Mg2+、牛血清蛋白、還原劑DTT、螯合劑EDTA等按照一定比例配成溶液。配制30%的異丙醇水溶液，在上述醇溶液中加入20 %的瓜兒膠，攪拌成懸浮狀液體，加入螢光素酶溶液，繼續(xù)攪拌lOmin，過濾、干燥后獲得固定螢光素酶。將上述固定螢光素酶加入標準ATP溶液中，用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)檢測熒光強度，記錄熒光值。同時，將上述螢光素酶溶液直接與標準ATP溶液混合，作為參比樣品，檢測螢光強度。圖1示出了固定和液體螢光素酶在室溫條件(20°C )下置放不同天數(shù)后的螢光強度對比，結(jié)果顯示了雖然初始液體螢光素酶的活性很高，但在第三天后，其螢光強度已經(jīng)低于固體螢光素酶，證明了固體螢光素酶的穩(wěn)定性較液體螢光素酶更優(yōu)。實施例2熒光素酶溶液由以下成分組成::蟲熒光素酶:2mg/mL蟲熒光素:0.8mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%
DTT: ImMEDTA:50mMEDTA:50mM按照上述成分組成配制螢光素酶溶液，將螢光素酶、熒光素、TRICINE緩沖液、Mg2+、牛血清蛋白、還原劑DTT、螯合劑EDTA等按照一定比例配成溶液。配制45%的乙醇溶液，在上述醇溶液中加入15%的葫蘆巴膠，攪拌成懸浮狀液體，加入螢光素酶溶液，繼續(xù)攪拌5min、10min、20min、40min、60min,過濾、干燥后獲得固定螢光素酶。將上述固定螢光素酶加入標準ATP溶液中，用微量熒光檢測儀(北京濱松光子股份的9504型熒光檢測儀)立即檢測熒光強度，記錄熒光值。結(jié)果如圖2示。結(jié)果顯示，不同的接觸時間對螢光素酶的活性保持率不同，從5min的10%逐漸上升到20min的45%。進一步的提高接觸時間反而導(dǎo)致酶活性的降低。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備固定熒光素酶的方法，其特征在于通過懸浮半乳甘露聚糖到熒光素酶的醇溶液中，飽和植物多糖后，對附有熒光素酶的半乳甘露聚糖進行分離、干燥，獲得固定于植物多糖的固定熒光素酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于半乳甘露聚糖包括但不限于胡蘆巴膠、關(guān)華豆膠、塔拉膠、刺槐豆膠、角豆膠、蘆薈膠、魔芋膠等半乳甘露聚糖以及它們的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2，其特征在于半乳甘露聚糖的濃度為0.1 % 99%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于醇溶液中的醇包括但不限于乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、異丙醇、異丁醇、異戊醇、環(huán)戊醇、環(huán)己醇、乙二醇、丙二醇等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4，醇的濃度為30% 70%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，熒光素酶溶液中含有還原劑，還原劑包括但不限于二硫蘇糖醇(DTT)、乙醇胺、β-巰基乙醇等以及它們的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和6，還原劑的濃度為0.1 100mM/L。
8.本發(fā)明還提供了一種固 定螢光素酶材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的適用于三磷酸腺苷分析的固定熒光素酶的制備方法。本方法針對三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)生物熒光檢測中螢光素酶存在的穩(wěn)定性問題，通過溶液法將其附著固定于半乳甘露聚糖(Galactomann)上，成為固定螢光素酶。上述方法制備的固定螢光素酶穩(wěn)定性優(yōu)于液體螢光素酶。本發(fā)明還提供了一種固定螢光素酶材料。
文檔編號C12N11/10GK103088012SQ20131004790
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者萬冬云 申請人:萬冬云