一種產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：A）構(gòu)建基因表達(dá)模塊，所述基因表達(dá)模塊包括青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子和所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子；B）將所述基因表達(dá)模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)單快速高效的優(yōu)點(diǎn)，避免了多級(jí)的克隆，也不需要依賴酶切位點(diǎn)，多片段共同轉(zhuǎn)化，同源重組效率高，可以明顯縮短工程菌構(gòu)建時(shí)間。
【專利說(shuō)明】一種產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]青蒿素(artemisinin)是中國(guó)科學(xué)家于20世紀(jì)70年代從傳統(tǒng)中草藥青蒿或稱黃花蒿(Artemisia annuaL.)中分離提純的抗痕有效單體，其化學(xué)本質(zhì)是含有“過(guò)氧橋”結(jié)構(gòu)(1，2，4-三噁烷環(huán))的倍半萜內(nèi)酯。以青蒿素為母核經(jīng)人工半合成獲得的青蒿素琥珀酸酯(青蒿琥酯)、青蒿素甲醚(蒿甲醚)、青蒿素乙醚(蒿乙醚)和雙氫青蒿素等青蒿素類藥物,血中溶解性好,生物利用度高,對(duì)氯喹抗性瘧疾及致命性腦型瘧有特效，已成為世界衛(wèi)生組織(WHO)倡導(dǎo)的“基于青蒿素的聯(lián)合療法”(artemisinin-based combinationtherapies’ACTs)首選的抗瘧新藥，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚復(fù)方已被列入WHO “基本藥品目錄”。
[0003]目前而言青蒿素的來(lái)源主要有4種方式:
[0004]第一種是直接從青蒿中提取，這是目前青蒿素的主要來(lái)源。但是青蒿的分布地域狹窄，青蒿中青蒿素的含量很低，因此天然來(lái)源的青蒿素已不能滿足日益增長(zhǎng)的需要。
[0005]第二種方式是通過(guò)化學(xué)全合成來(lái)生產(chǎn)青蒿素，這種方式成本高，難度大，目前還不能投入生產(chǎn)，基本上處 于試驗(yàn)階段。
[0006]第三種方式是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)青蒿素，研究報(bào)道，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的青蒿發(fā)狀根中青蒿素的含量能達(dá)550mg/L，但要進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)還有很多工作要做。
[0007]第四種方式是通過(guò)代謝工程來(lái)生產(chǎn)青蒿素，在模式菌構(gòu)建青蒿酸生物合成途徑，利用重組的模式菌生產(chǎn)青蒿酸，再以青蒿酸為原料化學(xué)合成青蒿素。
[0008]經(jīng)過(guò)多年研究，青蒿素的生物合成基本已經(jīng)闡明，主要包括三個(gè)階段:第一步是乙酰輔酶A形成法尼基焦磷酸(FPP);第二步是通過(guò)FPP合成倍半萜紫穗槐_4，11-二烯；最后一步是由紫穗槐-4，11-二烯合成青蒿酸或二氫青蒿酸。進(jìn)而形成青蒿素(圖1)。
[0009]2003年，Mart in等在大腸桿菌中導(dǎo)入9個(gè)基因，這9個(gè)基因包括合成MVA (甲羥戊酸)的編碼基因以及ADS(紫穗槐-4，11-二烯合酶)基因，通過(guò)在大腸桿菌中重建MVA途徑和紫穗槐-4，11-二烯合成途徑，使其產(chǎn)生了青篙素關(guān)鍵中間產(chǎn)物紫穗槐_4，11-二烯(MartinVJj Pitera DJj Withers ST，et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichiacoli for production of terpenoids.Nat Biotechnol，2003，21:796-803)。
[0010]2006年，Lindahl等在釀酒酵母中導(dǎo)入含ADS基因的質(zhì)?；?qū)DS基因整合到酵母染色體上，分別獲得600和100μ g/L紫穗槐-4，11-二烯。這是第一次在真核生物中生產(chǎn)出青篙素體，為今后利用酵母生產(chǎn)青篙素前體提供了可能(Lindahl Ann-Louise, Olsson ME., Merche P，et al，Production of the artemisinin preceursor amorpha—4，11—dieneby engineered Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology Letter，2006，28:571-580)。
[0011]同年，R0 DK等以釀酒酵母為宿主菌，導(dǎo)入ADS、CYP71AV1基因，重建了青篙酸的代謝途徑，并通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化，獲得115mg/L青蒿酸(Ro DK, Paradise EM., Ouellet M etal, Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineerdyeast, Nature, 2006, 440:940-943)。
[0012]2007年，專利申請(qǐng)CN200710187922.8公開了導(dǎo)入HMG_CoA、ADS合酶和FPP合酶
以及其他基因的方法構(gòu)建青蒿酸生產(chǎn)菌。
[0013]根據(jù)上述文獻(xiàn)，雖然可以構(gòu)建出青蒿酸基因工程菌，但是構(gòu)建時(shí)需要依次將青蒿酸表達(dá)相關(guān)的基因整合于酵母菌染色體上，涉及多級(jí)克隆，且依賴于合適的酶切位點(diǎn)選擇，操作繁瑣，周期長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明旨在提供一種產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0015]本發(fā)明的產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0016]A)構(gòu)建基因表達(dá)模塊，所述基因表達(dá)模塊包括青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子和所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子；
[0017]B)將所述基因表達(dá)模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。 [0018]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟A)中所述基因表達(dá)模塊還包括抗性基因、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子和所述抗性基因下游的終止子。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，所述步驟A)中所述構(gòu)建基因表達(dá)模塊包括以下步驟:
[0020]Al)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段；
[0021]A2)以所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段為模板，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增獲得基因表達(dá)模塊。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述步驟A)中所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因?yàn)閍ds、amo和 cpr。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例,所述ads、amo和cpr來(lái)源于青蒿。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述步驟A)中所述啟動(dòng)子選自ADHlp、TEFlp、TPIlp和PGKlp。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述啟動(dòng)子來(lái)源于釀酒酵母。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述步驟A)中所述終止子選自TKLlt、ADHlt、EN02t和TDH2t。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述終止子來(lái)源于釀酒酵母。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述抗性基因?yàn)閎le基因。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述抗性基因來(lái)源于pGAPZ α A。
[0030]本發(fā)明的有益效果:將外源基因片段同時(shí)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，利用酵母自身胞內(nèi)生物質(zhì)系統(tǒng)一步將各片段組裝，并進(jìn)一步同源整合到設(shè)計(jì)的染色體位置，具有簡(jiǎn)單快速高效的優(yōu)點(diǎn)，避免了多級(jí)的克隆，也不需要依賴酶切位點(diǎn)，多片段共同轉(zhuǎn)化，同源重組效率高，1-2周即可獲得工程菌株，這種良好的酵母基因工程方法可以明顯縮短工程菌構(gòu)建時(shí)間。按照本發(fā)明的方法獲得的基因工程菌的青蒿酸的發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到大約1-1.5g/L，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為青蒿(Artemisiae annuae)的青蒿素合成途徑示意圖,其中，ADS代表紫穗槐-4，11- 二烯合酶，AMO代表紫穗槐-4，11- 二烯P450單加氧酶，CPR代表細(xì)胞色素P450氧化還原酶。
圖2為PCR程序I。
圖3為PCR程序2。
圖4為Overlap PCR程序。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0033]實(shí)施例1、實(shí)驗(yàn)方案及引物設(shè)計(jì)
[0034]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)如下: [0035]在釀酒酵母BY4742 (購(gòu)自 EUROSCARF，編號(hào) Y10000，菌株信息:MAT a ；his3 Δ I ；Ieu2 Δ O ；lys2 Δ O ；ura3 Δ O)中表達(dá)來(lái)自于青蒿的青蒿素合成途徑的3個(gè)基因ads(GenBank:DQ241826)、amo (GenBank:DQ872632)和 cpr (GenBank:DQ984181 )，經(jīng)酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化，并同時(shí)表達(dá)ble基因(Zeocin抗性基因)作為篩選標(biāo)記，選擇酵母染色體δ位點(diǎn)作為整合位點(diǎn)，各基因模塊在染色體上的整合組裝順序如圖1所示。將各啟動(dòng)子和基因分別編號(hào)，如表1所示。
[0036]表1、各啟動(dòng)子和基因編號(hào)
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)青蒿酸基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: A)構(gòu)建基因表達(dá)模塊，所述基因表達(dá)模塊包括青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子和所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子； B)將所述基因表達(dá)模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述基因表達(dá)模塊還包括抗性基因、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子和所述抗性基因下游的終止子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述構(gòu)建基因表達(dá)模塊包括以下步驟: Al)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段； A2)以所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因、所述抗性基因片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因上游的啟動(dòng)子片段、所述抗性基因上游的啟動(dòng)子片段、所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因下游的終止子片段和所述抗性基因下游的終止子片段為模板，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增獲得基因表達(dá)模塊。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述青蒿酸生產(chǎn)相關(guān)的基因?yàn)閍ds、amo和cpr。
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述ads、amo和cpr來(lái)源于青蒿。
6.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述啟動(dòng)子選自ADHlp、TEFlp、TPIlp 和 PGKlp。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子來(lái)源于釀酒酵母。
8.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中所述終止子選自TKLlt, ADHlt,EN02t和 TDH2t。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述終止子來(lái)源于釀酒酵母。
10.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗性基因?yàn)閎le基因。
11.如權(quán)利要求 10所述的方法，其特征在于，所述抗性基因來(lái)源于pGAPZaA。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK103981110SQ201310048422
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月7日
【發(fā)明者】魏維, 戈梅, 孫新強(qiáng), 羅敏玉, 肖彩霞, 夏興, 盛保偉, 金一平 申請(qǐng)人:上海來(lái)益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司, 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠