專(zhuān)利名稱(chēng)：多能干細(xì)胞的傳代方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及多能干細(xì)胞的傳代方法及其用途。
背景技術(shù)：
多能干細(xì)胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)可以在體外適宜的條件下快速增殖而不分化，并且在經(jīng)過(guò)體外大量擴(kuò)增后，再給予特定條件處理，例如使用蛋白質(zhì)或小分子化合物的組合誘導(dǎo)，可以使其定向的分化成具有特定功能的細(xì)胞，將這些分化后失去多能性的特定細(xì)胞收集起來(lái)就可用于治療人類(lèi)的相關(guān)疾病，例如可以將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞后，注入大腦內(nèi)用于治療因神經(jīng)元缺損導(dǎo)致的老年性癡呆或亨廷頓氏癥。工業(yè)化生產(chǎn)中，多能干細(xì)胞的常見(jiàn)增殖培養(yǎng)方式是貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。其中，相比貼壁培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)方式有很多優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)模式，是未來(lái)干細(xì)胞生物研究和應(yīng)用發(fā)展的趨勢(shì)所亟需的技術(shù):懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的分布呈球形，易于操作處理和回收細(xì)胞；懸浮培養(yǎng)可以充分利用空間及培養(yǎng)基，便于集中控制并降低成本，提高效率；懸浮系統(tǒng)產(chǎn)出的多能干細(xì)胞更利于向特定功能細(xì)胞如神經(jīng)前體細(xì)胞和中胚層心肌前體細(xì)胞分化。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)多能干細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要進(jìn)行傳代，進(jìn)行再培養(yǎng)?，F(xiàn)有的傳代方法主要有機(jī)械傳代、酶消化傳代，以及酶消化加機(jī)械傳代三種方式?，F(xiàn)有的機(jī)械傳代是利用極細(xì)的玻璃絲將大的集落劃切成數(shù)枚小片傳代，可用于貼壁培養(yǎng)，而懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞呈實(shí)體球狀，其毫無(wú)附著，無(wú)法固定，很難用玻璃絲將其劃開(kāi)，因而不適宜用現(xiàn)有機(jī)械 傳代。酶消化傳代是向細(xì)胞中加入胰酶等酶進(jìn)行消化處理，使細(xì)胞分散后傳代；可用于貼壁培養(yǎng)，而酶消化對(duì)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞球表面的細(xì)胞起作用快，而球內(nèi)部細(xì)胞消化慢，造成消化不均一，影響了傳代細(xì)胞的性能，例如團(tuán)塊大于150微米的多能干細(xì)胞小塊在接種到小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞上后易于自發(fā)分化，而小于40微米的多能干細(xì)胞小塊則易于死亡。因而懸浮培養(yǎng)不適宜用酶消化傳代。酶消化配合移液槍吹打相較單獨(dú)酶消化，雖然消化相對(duì)均勻，但傳代時(shí)仍不易掌握和控制，導(dǎo)致制備的小團(tuán)塊大小不均一，無(wú)法抑制自發(fā)分化，并且降低定向分化的可行性。并且長(zhǎng)期采用酶消化，容易引起多能干細(xì)胞發(fā)生染色體變異或缺失?？梢?jiàn)，現(xiàn)有的細(xì)胞傳代方法不適于懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞的傳代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種多能干細(xì)胞的傳代方法及其用途，實(shí)現(xiàn)了懸浮培養(yǎng)體系中多能干細(xì)胞的傳代。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:多能干細(xì)胞的傳代方法，包括下列步驟:步驟A:將多個(gè)多能干細(xì)胞小球移入培養(yǎng)基中，并混合均勻；
步驟B:利用移液器吸取混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，并利用所述移液器產(chǎn)生的壓力擠壓混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，使其通過(guò)30-70 μ m細(xì)胞篩的篩網(wǎng)，形成混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊；步驟C:將所述混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊移入新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，完成傳代；所述多能干細(xì)胞小球?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)形成的多能干細(xì)胞的球狀聚集體，并且所述多能干細(xì)胞小球的直徑為240±40μπι。進(jìn)一步地,所述步驟B包括:利用移液器將混合后的混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，分批通過(guò)30-70 μ m細(xì)胞篩的篩網(wǎng)；并且每批吸取800μ I混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，每批在所述篩網(wǎng)的不同位置通過(guò)。進(jìn)一步地,所述步驟A包括:將每70-90個(gè)所述多能干細(xì)胞小球移入3ml所述培養(yǎng)基中，并混合均勻。進(jìn)一步地，所述移液器為移液槍?zhuān)鲆埔簶屗玫臉岊^為帶濾芯槍頭。進(jìn)一步地,所述步驟A之前進(jìn)一步包括:向所述培養(yǎng)基中加入10 μ mo I/L Rock抑制劑Y-27632，并將所述培養(yǎng)基在37°C水浴中預(yù)熱。進(jìn)一步地，所述步驟A中的混合均勻包括:利用移液管或移液槍反復(fù)吸吹。進(jìn)一步地，所述繼續(xù)培養(yǎng)包括:將所述培養(yǎng)皿置于37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中。進(jìn)一步地，所述步驟B之后和所述步驟C之前進(jìn)一步包括:用磷酸鹽緩沖液或培養(yǎng)基潤(rùn)濕所述培養(yǎng)皿的底部的內(nèi)表面。進(jìn)一步地，所述細(xì)胞篩為尼龍篩網(wǎng)的無(wú)菌細(xì)胞篩，和/或，所述培養(yǎng)基為無(wú)血清成分確定培養(yǎng)基；和/或，所述培養(yǎng)皿為皮氏培養(yǎng)皿。所述的多能干細(xì)胞的 傳代方法的用途，所述多能干細(xì)胞的傳代方法用于脊椎動(dòng)物門(mén)的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的傳代。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的多能干細(xì)胞的傳代方法是:用移液器吸取懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞小球，并利用該移液器產(chǎn)生的壓力使細(xì)胞小球通過(guò)細(xì)胞篩的篩網(wǎng)，同時(shí)利用篩網(wǎng)具有均勻小孔的特點(diǎn)，從而將其切割成均勻的圓柱形小團(tuán)塊，進(jìn)行傳代，其中，無(wú)需細(xì)胞自身具有附著點(diǎn)，并且為無(wú)酶消化的傳代，因而避免了細(xì)胞染色體變異；可見(jiàn)，該方法適于懸浮培養(yǎng)形成的多能干細(xì)胞小球，利用該方法傳代后多能干細(xì)胞存活率高，可以達(dá)到90%，每次傳代比率可達(dá)1:8至1:10。此外，本發(fā)明提供的技術(shù)方案還可以達(dá)到下列技術(shù)效果:(I)簡(jiǎn)單易行:本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞篩和移液器兩個(gè)工具，即可完成傳代，所用工具操作簡(jiǎn)單易行。(2)成本低，耗時(shí)少:本發(fā)明的傳代方法無(wú)需酶消化，因而避免了酶消化中涉及的清洗、處理、終止等繁瑣步驟，因而不僅節(jié)省了酶試劑所需的成本，而且節(jié)省了生產(chǎn)時(shí)間，可用于工業(yè)化量產(chǎn)多能干細(xì)胞。(3)提高細(xì)胞活性，防污染:本發(fā)明分批切割多能干細(xì)胞小球，可以保證得到的細(xì)胞小團(tuán)塊尺寸更均勻，從而提高細(xì)胞活性；并且每批都在細(xì)胞篩的不同位置切割，可以防止污染。(4)培養(yǎng)基安排合理:每70-90個(gè)多能干細(xì)胞小球用3ml培養(yǎng)基，體積適量，既可以保證細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，又可以避免培養(yǎng)基的浪費(fèi)。(5)切割所用的氣流均勻和緩:使用帶濾芯的槍頭，可以產(chǎn)生均勻和緩的氣壓，從而進(jìn)一步提高切割的均勻性。(6)增加細(xì)胞的存活率:培養(yǎng)基中加入Rock抑制劑Y-27632，可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，提聞細(xì)胞的克隆球形成能力。(7)保證培養(yǎng)基順利鋪展:用磷酸鹽緩沖液或培養(yǎng)基潤(rùn)濕所述培養(yǎng)皿的底面，增加了培養(yǎng)皿的浸潤(rùn)性，從而保證培養(yǎng)基可以順利鋪展，防止多能干細(xì)胞克隆球相互聚集成團(tuán)，抑制了自發(fā)分化，提高干細(xì)胞品質(zhì)。


為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，下面將對(duì)具體實(shí)施方式
中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明的實(shí)施例一提供的多能干細(xì)胞的傳代方法流程圖；圖2為本發(fā)明的實(shí)施例二提供的懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞小球的形態(tài)圖；圖3為本發(fā)明的實(shí)施例二提供的多能干細(xì)胞傳代當(dāng)天和傳代第二日的形態(tài)圖；圖4為本發(fā)明的實(shí)施例二提供的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的8次傳代后的多能性染色鑒定結(jié)果具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的具體實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所得到的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。實(shí)施例一多能干細(xì)胞的傳代方法，如圖1所示，包括下列步驟:步驟101:將多個(gè)多能干細(xì)胞小球移入培養(yǎng)基中，并混合均勻；步驟102:利用移液器吸取混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，并利用移液器產(chǎn)生的壓力擠壓混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，使其通過(guò)30-70 μ m細(xì)胞篩的篩網(wǎng)，形成混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊；步驟103:將所述混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊移入新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，完成傳代；所述多能干細(xì)胞小球?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)(非貼壁式)形成的多能干細(xì)胞球狀聚集體，并且所述多能干細(xì)胞小球的直徑為240±40 μ m。與現(xiàn)有的傳代方法相比， 本實(shí)施例的傳代方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)充分考慮懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的球體形狀:用移液器攜帶懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞小球，并利用該移液器產(chǎn)生的壓力使細(xì)胞小球通過(guò)細(xì)胞篩，同時(shí)利用細(xì)胞篩具有均勻小孔的特點(diǎn)，從而將其切割成大小均勻的直徑為30-70μπι的圓柱形小團(tuán)塊，進(jìn)行傳代，其中，無(wú)需細(xì)胞自身具備附著點(diǎn)或事前的特殊處理。(2)避免多能干細(xì)胞的變異:本實(shí)施例的方法為無(wú)酶消化的傳代，因而避免了細(xì)胞染色體變異。(3)簡(jiǎn)單易行:本方法通過(guò)細(xì)胞篩和移液器兩個(gè)工具，即可完成傳代，所用工具操作簡(jiǎn)單易行。(4)成本低，耗時(shí)少:本方法無(wú)需酶消化，因而避免了酶消化中涉及的清洗、處理、終止等繁瑣步驟，因而不僅節(jié)省了酶試劑所需的成本，而且節(jié)省了生產(chǎn)時(shí)間，一次傳代在l-3min即可完成，這樣可以應(yīng)用于工業(yè)自動(dòng)化大規(guī)模量產(chǎn)多能干細(xì)胞。由此可見(jiàn)，本發(fā)明方法更適用于懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工業(yè)化生產(chǎn)，為研究和醫(yī)療需要的大量多能干細(xì)胞生產(chǎn)提供了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。本實(shí)施例還提供了上述方法的用途:所述多能干細(xì)胞的傳代方法用于脊椎動(dòng)物門(mén)的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的傳代。為了進(jìn)一步提高上述實(shí)施例的實(shí)用性，可以在以下方面進(jìn)行改進(jìn):優(yōu)選地,所述步驟101之前進(jìn)一步包括`:向所述培養(yǎng)基中加入10 μ mol/L Rock抑制劑Y-27632，并將所述培養(yǎng)基在37°C水浴中預(yù)熱。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中加入Rock抑制劑Y-27632，可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞的克隆形成能力。優(yōu)選地，步驟101中，將每70-90個(gè)所述多能干細(xì)胞小球移入3ml所述培養(yǎng)基中，并混合均勻。因?yàn)槊?0-90個(gè)多能干細(xì)胞小球所傳代后的多能干細(xì)胞小球置用3ml培養(yǎng)基，體積適量，既可以保證細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，又可以避免培養(yǎng)基的浪費(fèi)。優(yōu)選地，步驟102中，利用移液器將混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，分批通過(guò)30-70 μ m細(xì)胞篩，得到多能干細(xì)胞小團(tuán)塊；并且每批吸取800 μ I混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，每批在所述細(xì)胞篩的不同位置通過(guò)。因?yàn)榉峙懈疃嗄芨杉?xì)胞小球，可以保證得到的細(xì)胞小團(tuán)塊尺寸更均勻，從而提高細(xì)胞活性；并且每批都在細(xì)胞篩的不同位置切割，可以防止污染。優(yōu)選地，所述移液器為移液槍?zhuān)鲆埔簶屗玫臉岊^為帶濾芯槍頭。因?yàn)槭褂脦V芯的槍頭，可以產(chǎn)生均勻和緩的氣壓，從而進(jìn)一步提高切割的均勻性。優(yōu)選地，所述步驟102之后和所述步驟103之前進(jìn)一步包括:用磷酸鹽緩沖液或培養(yǎng)基潤(rùn)濕所述培養(yǎng)皿的底部的內(nèi)表面。因?yàn)橛昧姿猁}緩沖液或培養(yǎng)基潤(rùn)濕所述培養(yǎng)皿的底面，增加了培養(yǎng)皿的浸潤(rùn)性，從而保證培養(yǎng)基可以順利鋪展，可以防止多能干細(xì)胞小球自發(fā)聚合成團(tuán)。優(yōu)選地，所述步驟101中的混合均勻進(jìn)一步包括:利用移液管或移液槍反復(fù)吸吹。優(yōu)選地，所述步驟103中的所述繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)一步包括:將所述培養(yǎng)皿置于37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中。優(yōu)選地，所述細(xì)胞篩為尼龍篩網(wǎng)的無(wú)菌細(xì)胞篩。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為mTeSRl培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)皿為皮氏培養(yǎng)皿。
由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)改進(jìn)，本發(fā)明的傳代方法的實(shí)用性在以下發(fā)明得到了進(jìn)一步提高:試劑得到充分利用，細(xì)胞的切割更均勻，細(xì)胞的存活率高，操作更簡(jiǎn)單易行，從而使本發(fā)明的適用范圍更廣。為了更充分說(shuō)明本發(fā)明的改進(jìn)點(diǎn)，以下實(shí)施例二提供了具體試驗(yàn)例。實(shí)施例二以下試驗(yàn)例所用的多能干細(xì)胞均為人類(lèi)胚胎干細(xì)胞BG02。將懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞在平均直徑達(dá)到240 μ m時(shí)進(jìn)行利用細(xì)胞篩進(jìn)行傳代。第一步:輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞小球聚集在培養(yǎng)皿中央。第二步:使用200 μ I的移液槍無(wú)選擇的吸取少量多能干細(xì)胞小球置于96孔板的一個(gè)孔中。第三步:在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整小球個(gè)數(shù)至70-90個(gè)。第四步:將小孔中的多能干細(xì)胞小球轉(zhuǎn)移至3ml37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基中(內(nèi)含10μ mol/L Rock 抑制劑 Y-27632)。第五步:將直徑為40 μ m細(xì)胞篩置于潔凈的小管上。第六步:用移液槍輕輕吹吸步驟4中的多能干細(xì)胞小球，用Iml帶濾芯的槍頭吸取800 μ I的培養(yǎng)基。第七步:將槍頭輕輕的抵緊細(xì)胞篩網(wǎng)面，緩緩按壓使培養(yǎng)基及多能干細(xì)胞小球通流流過(guò)篩網(wǎng)流入下面的潔凈 小管中，得到混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊。第八步:重復(fù)步驟6-7直至3ml培養(yǎng)基及多能干細(xì)胞小球全部通流完畢，且每次通過(guò)篩網(wǎng)面的位置不同。第九步:撤去細(xì)胞篩，使用5ml的移液槍輕輕吹吸傳代后的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊及
培養(yǎng)基3次。第十步:吸取全部的步驟9中溶液在35_直徑的皮氏培養(yǎng)皿中央注入，注入時(shí)使液流垂直。第十一步:將培養(yǎng)皿輕輕的移入培養(yǎng)箱中，在移入過(guò)程中盡量不要使液面發(fā)生波動(dòng)。上述細(xì)胞在傳代后24h內(nèi)不要移動(dòng)培養(yǎng)皿。上述第一步中的懸浮培養(yǎng)的多能干細(xì)胞小球形狀如圖2所示，左側(cè)為4X鏡下照片，右側(cè)為IOX鏡下照片。傳代當(dāng)天僅為d0日，傳代第二日(dl)進(jìn)行照相和換液，。照相:在傳代后24_30h內(nèi)將培養(yǎng)皿取出，輕輕晃動(dòng)，使多能干細(xì)胞小球聚集于培養(yǎng)皿中央。利用4X鏡下拍攝照片。利用攝像軟件測(cè)量200個(gè)以上的多能干細(xì)胞小球直徑，計(jì)算平均直徑。多能干細(xì)胞在傳代當(dāng)天的形態(tài)如圖3的左側(cè)所示，在傳代第二日的形態(tài)如圖3的右側(cè)所示。換液過(guò)程:在傳代24小時(shí)后需要更換不含Y-27632的新鮮培養(yǎng)基。吸取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基并用2ml預(yù)熱的PBS涮一下培養(yǎng)基，回收剩余的多能干細(xì)胞小球離心500rpm, 5min ;去掉上清，用3ml新鮮的預(yù)熱過(guò)的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，后按實(shí)施例1中步驟十，十一鋪入原來(lái)的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。檢驗(yàn)多能干細(xì)胞經(jīng)過(guò)8次傳代后的多能性。檢驗(yàn)方法:免疫染色法。將經(jīng)過(guò)8次通流細(xì)胞篩傳代后的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞BG02在傳代后第I天轉(zhuǎn)移到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層細(xì)胞上，待其貼壁，觀察其是否形成并恢復(fù)典型的平面生長(zhǎng)形態(tài)，在貼壁后進(jìn)行多項(xiàng)多能性標(biāo)記物免疫染色鑒定，方法如下(以O(shè)ct-3為例):將貼壁的BG02品在4%多聚甲醛中固定lOmin，PBS洗兩次，每次5min。加入0.3%Triton-X1002mL,室溫放置 lOmin，隨后 PBS 洗兩次，每次 5min。樣品在5%BSA中封閉20min，PBS稀釋一抗(鼠抗Oct_3IgG)，稀釋比例為1:500，將樣品與一抗室溫孵育lh，隨后PBS洗2次，每次5min。所用二抗為生物素化羊抗小鼠IgG，1:100稀釋后，將樣品與二抗室溫孵育30min，隨后PBS洗2次，每次5min。SABC-Cy31:100稀釋?zhuān)覝乇芄?，與樣品孵育30min，隨后PBS洗3次，每次5分鐘。DAPI染色:DAPI1:50稀釋?zhuān)c涂片室溫孵育10分鐘，熒光顯微鏡觀察。SSEA-4和Tra-1-6 0兩種抗體的操作方法同上，只需將一抗更換即可。結(jié)果:結(jié)果如圖4所示，可知，采用本發(fā)明的方法將人類(lèi)胚胎干細(xì)胞BG02傳代8次后，細(xì)胞的存活率還可以達(dá)到90%以上，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明適用于懸浮培養(yǎng)多能干細(xì)胞的傳代。上述實(shí)驗(yàn)只是選取了本發(fā)明研究工作中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)證明，該方法用于懸浮培養(yǎng)形成的多能干細(xì)胞小球傳代，每次傳代比率可達(dá)1:8至1:10。最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上具體實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對(duì)前述實(shí)施方式所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施方式和具體實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，包括下列步驟: 步驟A:將多個(gè)多能干細(xì)胞小球移入培養(yǎng)基中，并混合均勻； 步驟B:利用移液器吸取混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，并利用所述移液器產(chǎn)生的壓力擠壓混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，使其通過(guò)30-70 μ m細(xì)胞篩的篩網(wǎng)，形成混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊； 步驟C:將所述混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊移入新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，完成傳代； 所述多能干細(xì)胞小球?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)形成的多能干細(xì)胞的球狀聚集體，并且所述多能干細(xì)胞小球的直徑為240 ±40 μ m。
2.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟B包括: 利用移液器將混合后的混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，分批通過(guò)30-70 μ m細(xì)胞篩的篩網(wǎng)； 并且每批吸取800μ I混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，每批在所述篩網(wǎng)的不同位置通過(guò)。
3.如權(quán)利要求2所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A包括: 將每70-90個(gè)所述多能干細(xì)胞小球移入3ml所述培養(yǎng)基中，并混合均勻。
4.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述移液器為移液槍?zhuān)鲆埔簶屗玫臉岊^為帶濾芯槍頭。
5.如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A之前進(jìn)一步包括: 向所述培養(yǎng)基中加入 ο μ mo I/L Rock抑制劑Y-27632，并將所述培養(yǎng)基在37°C水浴中預(yù)熱。
6.如權(quán)利要求3所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A中的混合均勻包括: 利用移液管或移液槍反復(fù)吸吹。
7.如權(quán)利要求6所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述繼續(xù)培養(yǎng)包括: 將所述培養(yǎng)皿置于37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中。
8.如權(quán)利要求7所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟B之后和所述步驟C之前進(jìn)一步包括: 用磷酸鹽緩沖液或培養(yǎng)基潤(rùn)濕所述培養(yǎng)皿的底部的內(nèi)表面。
9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞的傳代方法，其特征在于，所述細(xì)胞篩為尼龍篩網(wǎng)的無(wú)菌細(xì)胞篩，和/或， 所述培養(yǎng)基為無(wú)血清成分確定培養(yǎng)基；和/或，所述培養(yǎng)皿為皮氏培養(yǎng)皿。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞的傳代方法的用途，其特征在于，所述多能干細(xì)胞的傳代方法用于脊椎動(dòng)物門(mén)的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的傳代。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及多能干細(xì)胞的傳代方法及其用途。該方法包括將定量的多能干細(xì)胞小球移入培養(yǎng)基中，并混合均勻；利用移液器吸取混于培養(yǎng)基的所述多能干細(xì)胞小球，并利用所述移液器產(chǎn)生的壓力擠壓，使其通過(guò)30-70μm細(xì)胞篩的篩網(wǎng)，形成混于培養(yǎng)基的更多的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊；將所述混于培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞小團(tuán)塊移入新的培養(yǎng)皿中，完成傳代。該方法用于脊椎動(dòng)物門(mén)的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的傳代。本發(fā)明適于懸浮培養(yǎng)形成的多能干細(xì)胞小球，是一種無(wú)需酶消化的新型傳代方法。利用該方法傳代后多能干細(xì)胞克隆球存活率高，可以達(dá)到90％，每次傳代比率可達(dá)1:8至1:10，可以滿(mǎn)足干細(xì)胞大規(guī)模量產(chǎn)化的需求。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK103146641SQ20131004850
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者蔣斌, 李天晴, 季維智, 牛昱宇 申請(qǐng)人:云南中科靈長(zhǎng)類(lèi)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室