專利名稱：前列腺癌標(biāo)志物spink1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于癌癥研究、癌癥診斷和癌癥治療的組合物和方法，包括(但不限于)提供癌癥標(biāo)志物。尤其，本發(fā)明提供前列腺癌的SPINKl標(biāo)志物和其他標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
前列腺癌是美國(guó)男性最常見的非皮膚性癌癥，并且是患癌癥死亡的第二大原因。在過去15年，已記入美國(guó)和英國(guó)的癌癥登記庫(kù)的前列腺癌的數(shù)目顯著增長(zhǎng)。該變化主要表明被確診癌癥的數(shù)目增長(zhǎng)而非患癌人數(shù)的實(shí)際增長(zhǎng)。在2006年，大概出現(xiàn)234，460名新增病例以及27，350個(gè)死亡病例。經(jīng)判定，這些新增病例中大約91%的患者被確診為處于局部化或局部擴(kuò)散期(local or regional stages)。前列腺癌(PCa)的經(jīng)典診斷方式是直腸指診檢測(cè)和/或前列腺特異性抗原(PSA)篩選。血清PSA水平的增高可能標(biāo)志著PCa的存在。因?yàn)镻SA只能由前列腺細(xì)胞分泌，所以PSA被用作前列腺癌的標(biāo)志物。健康的前列腺產(chǎn)生的PSA量穩(wěn)定，一般在4ng/mL以下(或PSA讀數(shù)少于等于4)，而癌細(xì)胞產(chǎn)生的PSA量隨著癌癥嚴(yán)重程度的增加而增加。水平在4-10之間可引起醫(yī)生懷疑病人有前列腺癌，而高于50的量可能意味著腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到身體其他部位。 當(dāng)PSA或直腸指診檢測(cè)顯示極為可能存在癌癥時(shí)，將用直腸超聲(TRUS)法來定位前列腺并顯示任何可疑區(qū)域。使用前列腺各個(gè)部位的活組織檢查來確定前列腺癌是否存在。治療的選擇取決于癌癥分期。預(yù)期壽命為10年或10年以內(nèi)、Gleason評(píng)分較低、腫瘤還未擴(kuò)散到前列腺以外的患者常常采取觀察等待法(不治療)。對(duì)更具侵襲性的癌癥治療的選擇包括:手術(shù)治療法，如根治性前列腺切除術(shù)(RP)，其中前列腺完全切除(使用或不使用神經(jīng)保留術(shù))；和放射治療法，其通過外粒子束從體外將劑量導(dǎo)向前列腺或者通過在前列腺中植入低劑量的放射性粒子殺死局部的癌細(xì)胞。也單獨(dú)或聯(lián)合手術(shù)治療法或放射治療法使用激素療法。激素療法應(yīng)用黃體生成素釋放激素(LH-RH)類似物來阻斷垂體生成促進(jìn)睪丸激素生成的激素。病人的余生都必須注射LH-RH類似物。雖然手術(shù)或激素治療通常對(duì)局部PCa有效，但晚期疾病仍然基本上無法治愈。雄激素切除法是晚期PCa最常用的治療方式，這導(dǎo)致大量的雄激素依賴性惡性細(xì)胞發(fā)生凋亡，腫瘤暫時(shí)消退。然而在大多數(shù)情況下，腫瘤發(fā)生猛烈地復(fù)發(fā)并能產(chǎn)生不依賴雄激素信號(hào)的增殖。PSA篩選法的出現(xiàn)使得可以更早地檢測(cè)出PCa，明顯降低了 PCa相關(guān)的死亡率。PSA篩選法目前是前列腺癌唯一最好的檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于前列腺癌的診斷，但是它無法幫助確認(rèn)檢測(cè)出的癌癥是否將引起具有臨床意義的疾病。盡管PSA對(duì)已經(jīng)確診前列腺癌的隨診患者是很好的標(biāo)志物，然而一些前列腺癌患者的PSA水平可能是正常的。PAS水平中度升高(4-10ng/mL)對(duì)前列腺癌具有低特異性，且PSA水平的升高并非前列腺癌所特有。高血清PSA水平也可能與前列腺炎、前列腺梗塞、PIN、前列腺活組織檢查、經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)和尿道導(dǎo)管插入有關(guān)。由于PSA篩選法的局限性，人們通過使用一些衍生指標(biāo)(如PSA密度、年齡相關(guān)的PSA水平、TZ - PSA密度、PSA速率、游離PSA水平、復(fù)合PSA(cPSA)測(cè)定值和游離PSA與總PSA的比率)來努力提高其診斷特異性。游離PSA與總PSA的比率計(jì)量結(jié)合PSA和游離PSA在總PSA中所占百分比，其是癌癥和良性腫瘤病理學(xué)又一有用的鑒定指標(biāo)，特別是PSA水平中度升高(4-10ng/mL)的患者的鑒定。這個(gè)比率對(duì)確認(rèn)PSA中度升高的患者在初始系統(tǒng)活組織檢查的結(jié)果為陰性的情況下重復(fù)作活組織檢查是否適合也很有用。游離PSA的百分比越低，癌癥的可能性越高。因此，研究開發(fā)血清和組織中其他生物標(biāo)志物來補(bǔ)充PSA篩選法是必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種鑒定患者體內(nèi)的前列腺癌的方法，包括:提供取自患者的包含前列腺細(xì)胞的樣品；在包含前列腺細(xì)胞的樣品內(nèi)檢測(cè)相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)；以及在包含前列腺細(xì)胞的樣品內(nèi)檢測(cè)ERG和/或ETVl的正常表達(dá)，其中，在包含前列腺細(xì)胞的樣品內(nèi)檢測(cè)與ERG和/或ETVl的正常表達(dá)相比互斥的SPINKl的過度表達(dá)，從而鑒定患者體內(nèi)的前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)SPINKl RNA的過度表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)SPINKl蛋白的過度表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，包含前列腺細(xì)胞的樣品是前列腺組織、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或者分離的前列腺細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在包含前列腺細(xì)胞的樣品內(nèi)檢測(cè)SPINKl的過度表達(dá)來鑒定患者體內(nèi)的侵入性前 列腺癌。在一些實(shí)施方案中，包含前列腺細(xì)胞的樣品取自進(jìn)行根治性前列腺切除術(shù)后的患者，并且SPINKl的過度表達(dá)鑒定前列腺癌在進(jìn)行根治性前列腺切除術(shù)后的患者體內(nèi)復(fù)發(fā)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種鑒定患者體內(nèi)的前列腺癌的方法，包括:提供取自患者的包含前列腺細(xì)胞的樣品；以及在包含前列腺細(xì)胞的樣品內(nèi)檢測(cè):(a)、相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)和相較于PCA3的正常表達(dá)的PCA3的過度表達(dá)；(b)、相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)和相較于G0LPH2的正常表達(dá)的G0LPH2的過度表達(dá)；(c)、相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)和TMPRSS2:ERG的存在；⑷相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)、相較于PCA3的正常表達(dá)的PCA3的過度表達(dá)和相較于G0LPH2的正常表達(dá)的G0LPH2的過度表達(dá)；(e)、相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)、相較于PCA3的正常表達(dá)的PCA3的過度表達(dá)和TMPRSS2:ERG的存在；(f)、相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)、相較于G0LPH2的正常表達(dá)的G0LPH2的過度表達(dá)和TMPRSS2:ERG的存在；或(g)、相較于SPINKl的正常表達(dá)的SPINKl的過度表達(dá)、相較于PCA3的正常表達(dá)的PCA3的過度表達(dá)、相較于G0LPH2的正常表達(dá)的G0LPH2的過度表達(dá)和TMPRSS2:ERG的存在，其中，在包含前列腺細(xì)胞的樣品內(nèi)檢測(cè)SPINKl的過度表達(dá)來鑒定患者體內(nèi)的前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)SPINKl RNA的過度表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟括檢測(cè)SPINKl蛋白的過度表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，包含前列腺細(xì)胞的樣品是前列腺組織、血液、尿液、精液、前列腺分泌物或者分離的前列腺細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供一種組合物，包括以下中的至少一項(xiàng):(a)包含與SPINKl RNA或cDNA特異地雜交的序列的第一寡核苷酸探針、包含與ERG RNA或cDNA特異地雜交的序列的第二寡核苷酸探針、和包含與ETVl RNA或cDNA特異地雜交的序列的第三寡核苷酸探針；(b)第一對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸，其中在第一對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸中每個(gè)擴(kuò)增性寡核苷酸均包含與SPINKl RNA或cDNA特異地雜交的序列，第二對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸，其中在第二擴(kuò)增性寡核苷酸對(duì)中每個(gè)擴(kuò)增寡核苷酸均包含與ERG RNA或cDNA特異地雜交的序列，和第三對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸，其中每個(gè)擴(kuò)增性寡核苷酸均包含與ETVl RNA或cDNA特異地雜交的序列；或(c)與SPINKl蛋白特異地結(jié)合的第一抗體、與ERG蛋白特異地結(jié)合的第二抗體、和與ETVl蛋白特異地結(jié)合的第三抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種組合物，包括以下中的至少一項(xiàng):(a)至少兩種寡核苷酸探針，包括:(i)寡核苷酸探針，其包含與SPINKl RNA或cDNA特異地雜交的序列；和(ii)至少另一種寡核苷酸探針，其包含與PCA3 RNA或cDNA、G0LPH2 RNA或cDNA、或嵌合RNA或cDNA的接點(diǎn)(其中嵌合RNA的5’部分轉(zhuǎn)錄自TMPRSS2，嵌合RNA的3’部分轉(zhuǎn)錄自ERG基因)特異地雜交的序列；(b)至少兩對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸，包括:(i)、一對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸，其中每個(gè)擴(kuò)增性寡核苷酸均包含與SPINKl RNA或cDNA特異地雜交的序列；和(ii)至少另一對(duì)擴(kuò)增性寡核苷酸，其中每個(gè)擴(kuò)增性寡核苷酸均包含與PCA3 RNA或cDNA特異地雜交的序列、每個(gè)擴(kuò)增性寡核苷酸均包含與G0LPH2RNA或cDNA特異地雜交的序列、或者第一擴(kuò)增性寡核苷酸包含與轉(zhuǎn)錄自TMPRSS2或其相應(yīng)cDNA的嵌合RNA的5’部分特異地雜交的序列并且第二擴(kuò)增寡核苷酸包含與轉(zhuǎn)錄自ERG或其相應(yīng)cDNA的嵌合RNA的3’部分特異地雜交的序列；或(c)至少兩種抗體，包括:(i)與SPINKl蛋白特異地結(jié)合的抗體；和(ii)至少另一種與如下蛋白特異地結(jié)合的抗體:G0LPH2蛋白、天然ERG蛋白、由TMPRSS2基因和ERG基因的融合體編碼的氨基端截?cái)嗟腅RG蛋白、或具有由TMPRSS2基因編碼的氨基末端部分和由ERF基因編碼的羧基末端部分的嵌合蛋白。本發(fā)明描述了附加的實(shí)施方案。


圖1示出meta COPA鑒定了 SPINKl為前列腺癌中與ERG與ETVl互斥的異常值。a、通過研究的號(hào)碼對(duì)基因進(jìn)行排列，在研究中任意三個(gè)預(yù)定義的百分點(diǎn)分割處(75th、90th、95th)它們的分值都在前100個(gè)異常值中(由COPA排列)。對(duì)排列前100個(gè)基因，根據(jù)決定其排名的研究中它們的平均COPA等級(jí)(Avg.Rank)進(jìn)一步進(jìn)行排列。b、在兩項(xiàng)SPINKl被排為前100個(gè)COPA異常值的研究中顯示出SPINKl的表達(dá)和ERG對(duì)SPINKl與ETVl對(duì)SPINKl表達(dá)的散布圖。在兩個(gè)研究中散布圖顯示出所有樣品的ERG對(duì)SPINKl (中間部分)和ETVl對(duì)SPINKl (底部部分)。圖2示出SPINKl的過度表達(dá)，其鑒定了侵入性EST陰性的前列腺癌亞群并可以通過無創(chuàng)性的方式檢測(cè)。a_b、兩支群組(密西根大學(xué)(University of Michigan(UM))和瑞典觀察等待中心(Swedish Watchful Waiting(Sffff)))用免疫組織化學(xué)法(IHC)評(píng)價(jià)了曾經(jīng)以熒光原位雜交法(FISH)評(píng)價(jià)TMRPSS2:ERG狀態(tài)的組織芯片的SPINKl表達(dá)。a、顯示了代表性的SPINKl陽(yáng)性和陰性中心和來自對(duì)于由FISH重排的TMRPSS2:ERG是陰性和陽(yáng)性的同一中心的細(xì)胞。b、顯示了 SPINKl表達(dá)和TMRPSS2:ERG狀態(tài)以及兩支群組Fisher精確檢驗(yàn)的P值的列聯(lián)表。c_e、SPINKl異常表達(dá)和外科切除術(shù)后生化指標(biāo)復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。Kaplan-Meier分析了(c)來自Glinsky等人的DNA芯片數(shù)據(jù)集的異常的SPINKl表達(dá)和來自(d)UM和(e)紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter (MSKCC))群組的SPINKl IHC檢測(cè)并顯示了外科切除術(shù)后的生化指標(biāo)復(fù)發(fā)。f、無創(chuàng)性檢測(cè)TMRPSS2:ERG陰性的前列腺癌患者的SPINKl異常表達(dá)。列聯(lián)表示出SPINKl的異常表達(dá)和TMRPSS2:ERG的狀態(tài)以及Fisher精確檢驗(yàn)的p值。圖3示出SPINKl在22RV1前列腺癌細(xì)胞中的的抑制(knockdown)削弱了癌癥的侵襲性。a-b、如圖所示SPINKl或LACZ腺病毒感染良性無限增殖前列腺細(xì)胞系RWPE，并且檢驗(yàn)了該細(xì)胞系RWPE的(a)增殖或(b)穿過改良基底膜的侵襲。C、qPCR用于檢測(cè)SPINK1、ERG和ETVl的異常表達(dá)。d-f、SPINKl介導(dǎo)22RV1細(xì)胞的侵襲性。檢驗(yàn)了細(xì)胞的(d)增殖和
(e)侵襲。用所示siRNA處理的侵入的細(xì)胞的顯微照片在f中示出。g、VCaP(TMPRSS2:ERG陽(yáng)性)和g) LNCaP (ETV1重排陽(yáng)性)的前列腺癌細(xì)胞系僅用轉(zhuǎn)染試劑(未處理)處理，或如圖所示用相對(duì)于SPINKl、ETVl或ERG非靶向性核酸或siRNA轉(zhuǎn)染，并且檢驗(yàn)侵襲。圖4示出在良性前列腺組織和ETS陽(yáng)性前列腺癌中薈萃異?；?meta-outliergene)的過度表達(dá)。a、根據(jù)圖1所示樣品類別，所指研究顯示薈萃異常基因ORM(列為4級(jí))和NEB (列為7級(jí))在標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)單元中的表達(dá)，揭示了多個(gè)良性樣品中的異常表達(dá)。b、兩項(xiàng)研究中所有定型樣品的第三級(jí)薈萃異?；騁PRl 16 (左邊部分)的表達(dá)和GPRl 16對(duì)ERG(右邊部分)的散布圖顯示了 GPR116和ERG在多個(gè)樣品中的共同異常表達(dá)。圖5示出在DNA芯片研究中的相較于良性前列腺組織的前列腺癌中SPINKl的過度表達(dá)和與ERG和ETVl互斥的SPINKl的過度表達(dá)。5項(xiàng)研究圖譜分析了前列腺組織的獨(dú)特類型(a)和2項(xiàng)研究圖譜分析了作為多發(fā)性癌的一部分的前列腺癌(b)，該五項(xiàng)研究和兩項(xiàng)研究的SPINKl的過度表達(dá)和SPINKl對(duì)ERG與SPINKl對(duì)ETVl的散布圖(如果檢測(cè))在圖5中示出。圖6示出與良性前列腺組織相比的前列腺癌中SPINKl的過度表達(dá)和與ERG和ETVl互斥的SPINKl的過度表達(dá)。a、示出通過qPCR研究了 10例良性前列腺樣品、54例局部前列腺癌(PCa)和7例轉(zhuǎn)移性(Met)PCa樣品而作出的ERG對(duì)SPINKl (左邊部分)與ETVl對(duì)SPINKl (右邊部分)的散布圖。圖7示出在22RV1細(xì)胞內(nèi)的SPINKl抑制時(shí)差異表達(dá)的基因的qPCR證實(shí)。所選擇的22RVlsiSPINKl細(xì)胞中的a)過度表達(dá)基因和b)低表達(dá)基因是通過如圖所示的定量PCR來進(jìn)行評(píng)價(jià)的。圖8示出通過多個(gè)前列腺癌的圖譜研究顯示與SPINKl共同表達(dá)的基因的鑒定。圖9示出前列腺癌的候選物尿基生物標(biāo)志物的表征。A-C、定量PCR(qPCR)檢測(cè)來自做穿刺活組織檢查或前列腺切除術(shù)的患者的尿液的完整轉(zhuǎn)錄物組擴(kuò)增(WTA) cDNA。顯示了穿刺活組織檢查陰性的 患者或者前列腺癌患者中的生物標(biāo)志物的表達(dá)。圖A顯示了通過單變量分析(參見表5)對(duì)前列腺癌的預(yù)測(cè)沒有明顯意義的基因的-ACt值，對(duì)預(yù)測(cè)有明顯意義的那些在圖B和C中得到顯示。D、前列腺癌診斷的單個(gè)變量的受試者操作特性(ROC)曲線。圖10示出在前列腺癌的檢測(cè)中一組多元尿液生物標(biāo)志物優(yōu)于單個(gè)PCA3。A、多變量回歸分析產(chǎn)生包括SPINK1、PCA3、G0LPH2和TMPRSS2:ERG的多元化的模型，其對(duì)前列腺癌的預(yù)測(cè)有明顯意義(參見表5)。ROC曲線上靈敏度(Sens)和特異性(Spec)的總和最大的點(diǎn)由虛線所表示，同時(shí)給出了陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值(分別是PPV和NPV)。B、和A —樣，除了使用留一法交互驗(yàn)證(LOOCV)策略來產(chǎn)生曲線下的非偏倚區(qū)。
具體實(shí)施例方式當(dāng)用于Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)(Rhodes et al., Proc Natl Acad SciUSA101, 9309 [2004] ; Rhodes et al., Neoplasia6, I [2004]),被稱為癌癥異常譜分析(COPA)的方法正確地鑒定了幾種已知的致癌基因，包括白血病中的PBXl和多發(fā)性骨髓瘤中的 CCNDl (Tomlins et al.，Science310, 644 [2005])。另外，COPA 指定 ETS 系基因?yàn)榍傲邢侔┑暮蜻x致癌基因，這促進(jìn)了 ERG或ETVl和雄激素調(diào)控基因TMPRSS2的周期性染色體重排的發(fā)現(xiàn)(Tomlins et al., [2005],上文)。因?yàn)?0-70%的前列腺 癌潛藏TMPRSS2:ETS基因融合，所以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以鑒定另外的前列腺癌的候選致癌基因。所執(zhí)行的試驗(yàn)將COPA的薈萃分析(meta analysis)用于7個(gè)前列腺癌的圖譜研究并且分析了在前列腺癌中異常表達(dá)的候選物和與ERG和ETVl互斥的過度表達(dá)的候選物。作為第2等級(jí)的薈萃異?；虻腟PINKl在8個(gè)數(shù)據(jù)集中均符合了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。SPINKl在325例前列腺癌的圖譜中有50例(15.4%)顯示明顯的過度表達(dá)，而在56例良性前列腺組織樣品中僅有I例(1.8%)。在所有325個(gè)前列腺癌樣品的圖譜中，SPINKl、ERG和ETVl顯示了互斥的異常表達(dá)。通過定量PCR來證實(shí)了與良性前列腺組織相比SPINKl在一部分癌癥樣品中過度表達(dá)并且SPINKl、ERG和ETVl互斥的過度表達(dá)。來自局部前列腺癌中的一者的組織的過度表達(dá)SPINKl的熒光原位雜交法沒有揭示基因重排或擴(kuò)增，這表明SPINKl通過轉(zhuǎn)錄增加而被上調(diào)?？偤瓦@些結(jié)果，在不同的分析方式、芯片平臺(tái)、實(shí)驗(yàn)室和樣品群組中的一致性表明SPINKl在沒有TMPRSS2:ETS基因融合的情況下在前列腺癌中排斥地過度表達(dá)(如由ERG或ETVl的過度表達(dá)所示)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)已表明SPINKl異常表達(dá)與前列腺癌復(fù)發(fā)(即，術(shù)后)的增加相關(guān)聯(lián)。因此，在一些實(shí)施方案中，提供了篩選樣品以確定前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性的方法。高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的受試者可能將提供更加積極的治療方式或其他治療。相反地，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低或沒有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的受試者可免受不必要的治療所帶來的副作用。定義為更好地理解本發(fā)明描述的本發(fā)明的內(nèi)容和權(quán)利要求，一些專用術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)定義如下:本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“SPINK1的異常表達(dá)”是指相對(duì)于已知的正常水平(即，未被診斷為癌癥的受試者中的水平)，SPINKl核酸(如mRNA)或蛋白的表達(dá)水平變化。在一些實(shí)施方案中，正常水平為一個(gè)或多個(gè)未被診斷為癌癥的個(gè)體中的平均水平。在其他實(shí)施方案中，正常水平是在待診斷的個(gè)體中其他組織內(nèi)確定的。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于已知的正常表達(dá)水平(如非癌組織中的表達(dá)水平)，表達(dá)變化至少10%、優(yōu)選至少20%、甚至更優(yōu)選至少50%、還更優(yōu)選至少75%、仍更優(yōu)選至少90%、并且最優(yōu)選至少100%?？捎萌魏芜m合的方法來測(cè)定表達(dá)水平，包括(但不限于)在本發(fā)明(如下文的實(shí)施例1)描述的那些。在一些實(shí)施方案中，SPINKl異常表達(dá)呈陽(yáng)性的樣品是那些與正常表達(dá)單元的表達(dá)差異大于約0.1、優(yōu)選大于0.2、甚至更優(yōu)選大于0.5的樣品。正常表達(dá)單元可使用任何合適的方法來計(jì)算，所述方法包括(但不限于)那些下文實(shí)驗(yàn)部分描述的方法。本發(fā)明中所用的“SPINK1的過度表達(dá)”是指相對(duì)于已知的正常水平，SPINKl核酸(如mRNA)或蛋白的較高水平的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于已知的正常表達(dá)水平，表達(dá)增加至少10%、優(yōu)選至少20%、甚至更優(yōu)選至少50%、還更優(yōu)選至少75%、仍更優(yōu)選至少90%、并且最優(yōu)選至少100%?？梢允褂迷S多合適的參數(shù)來確定已知的正常表達(dá)水平。其實(shí)例包括(但不限于)非癌性前列腺中的水平(如來自多個(gè)未被診斷為前列腺癌的受試者的前列腺組織中的SPINKl表達(dá)的平均水平)、非癌性組織中的水平(如來自多個(gè)未被診斷為癌的受試者的非前列腺組織中的SPINKl表達(dá)的平均水平)、非癌性前列腺細(xì)胞系中的水平、或相對(duì)的表達(dá)水平(如在同一個(gè)體中一段時(shí)間內(nèi)的水平)?？捎萌魏芜m合的方法來測(cè)定表達(dá)水平，該方法包括(但不限于)那些在本發(fā)明描述的那些。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)水平與已知基因的表達(dá)水平相當(dāng)(如表達(dá)或相對(duì)表達(dá)水平)。在一些實(shí)施方案中，已知基因?yàn)镻SA。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“與前列腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的基因表達(dá)”是指基因表達(dá)譜(如SPINKl的異常表達(dá))與對(duì)原發(fā)腫瘤進(jìn)行治療(如手術(shù))后的前列腺癌復(fù)發(fā)(如在前列腺中或發(fā)生轉(zhuǎn)移)相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于代表性的受試者人群中(例如，缺乏“SPINK1異常表達(dá)”的受試者中較大人群(如，一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選100個(gè)或更多個(gè)、甚至更優(yōu)選1000個(gè)或更多個(gè)、還更優(yōu)選10000個(gè)或更多個(gè)受試者)的平均數(shù))的復(fù)發(fā)水平，前列腺癌的復(fù)發(fā)增加至少10%、優(yōu)選至少20%、甚至更優(yōu)選至少50%、還更優(yōu)選至少75%、仍更優(yōu)選至少90%、并且最優(yōu)選至少100%。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“抗原決定基”指與特定抗體接觸的那部分抗原。當(dāng)?shù)鞍谆虻鞍灼瑪嘤糜诿庖咚拗鲃?dòng)物時(shí)，蛋白的許多區(qū)域可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，該抗體與蛋白的給定區(qū)域或三維結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合；這些區(qū)域或結(jié)構(gòu)即指“抗原決定簇”?？乖瓫Q定簇可能與完整的抗原(·即用于引起免疫反應(yīng)的“免疫原”)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。當(dāng)參考抗體和蛋白或肽的相互作用而使用術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異地結(jié)合”時(shí)是指這種相互作用依賴于蛋白上的特定結(jié)構(gòu)的存在(如抗原決定簇或抗原決定基)；換句話說抗體被識(shí)別并結(jié)合特定的蛋白結(jié)構(gòu)而不是一般的蛋白。例如，如果抗體對(duì)抗原決定基“A”來說是特異性的，在含有標(biāo)記“A”和抗體的反應(yīng)中存在含有抗原決定基“A”(或游離的未標(biāo)記的A)的蛋白將減小與抗體結(jié)合的標(biāo)記“A”的量。當(dāng)本發(fā)明中參考抗體和蛋白或肽的相互作用而使用術(shù)語(yǔ)“非特異性結(jié)合”和“背景結(jié)合”時(shí)是指不依賴于特定結(jié)構(gòu)存在的相互作用(即，該抗體與一般的蛋白結(jié)合而不是與特定結(jié)構(gòu)(如抗原決定基)結(jié)合)。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”是指任何動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)，包括(但不限于)人類、非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等，這些受試者是特定治療的接受者。一般情況下，涉及人類受試者時(shí)，“受試者”和“患者”在本發(fā)明中是可交換使用的。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“懷疑患有癌癥的受試者”是指存在一個(gè)或多個(gè)癌癥癥狀指示(如明顯的腫塊或團(tuán)塊)或正在接受癌癥篩選(如在例行體檢期間)的受試者。懷疑患有癌癥的受試者也可能有一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子。懷疑患有癌癥的受試者一般尚未接受癌癥檢測(cè)。但是，“懷疑患有癌癥的受試者”包括接受初步診斷(如CT掃描顯示團(tuán)塊或PSA水平增加)但癌癥的分期還不明確的個(gè)體。這一術(shù)語(yǔ)還包括曾經(jīng)患有癌癥的人(如處于好轉(zhuǎn)期的個(gè)體)。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“受試者中癌癥的表征”是指鑒定受試者體內(nèi)癌癥樣品的一個(gè)或多個(gè)性能，包括(但不限于)良性組織、癌癥前期組織或癌性組織的存在、癌癥的分期和受試者的預(yù)后。癌癥可通過鑒定一種或多種癌癥標(biāo)志物基因的表達(dá)來表征，所述一種或多種癌癥標(biāo)志物包括(但不限于)在本發(fā)明所描述的癌癥標(biāo)志物。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“受試者中前列腺組織的表征”是指鑒定前列腺組織樣品的一個(gè)或多個(gè)性能(例如，包括(但不限于)癌性組織的存在、可能轉(zhuǎn)化成癌性組織的癌癥前期組織的存在、和可能轉(zhuǎn)移的癌性組織的存在)。在一些實(shí)施方案中，通過鑒定一種或多種癌癥標(biāo)志物基因的表達(dá)來表征組織，所述一種或多種癌癥標(biāo)志物包括(但不限于)在本發(fā)明所描述的癌癥標(biāo)志物。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“癌癥標(biāo)志物基因”是指其單獨(dú)或與其他基因結(jié)合使用時(shí)，其表達(dá)水平與癌癥或癌癥預(yù)后相關(guān)的基因。此相關(guān)性可涉及基因表達(dá)的增加或減少。例如，基因表達(dá)可提不患有癌癥，或者基因表達(dá)缺乏可與癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“特異地檢測(cè)癌癥標(biāo)志物是否存在的試劑”是指用于檢測(cè)一種或多種癌癥標(biāo)志物(例如，包括(但不限于)在本發(fā)明所描述的癌癥標(biāo)志物)的表達(dá)的試劑。合適的試劑的實(shí)例包括(但不限于)能夠與目標(biāo)基因特異地雜交的核酸探針、能夠特異地?cái)U(kuò)增目標(biāo)基因的PCR引物、和能夠與目標(biāo)基因所表達(dá)的蛋白特異地結(jié)合的抗體。在下述的描述和實(shí)施例中可發(fā)現(xiàn)其他的非限制實(shí)例。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“使用所述試劑盒用于檢測(cè)所述受試者體內(nèi)的癌癥的說明”包括使用包含在試劑盒內(nèi)的用于檢測(cè)并表征取自受試者的樣品內(nèi)的癌癥的試劑的說明。在一些實(shí)施方案中，使用說 明還包括美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)在標(biāo)記體外診斷產(chǎn)品方面規(guī)定的使用目的的聲明。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“癌癥的分期”是指癌癥擴(kuò)散水平的定性或定量評(píng)價(jià)。用于確定癌癥的分期的標(biāo)準(zhǔn)包括(但不限于)腫瘤的尺寸、腫瘤是否已擴(kuò)散至身體的其他部分、和癌癥已擴(kuò)散的部位(例如，在體內(nèi)相同器官或相同區(qū)域內(nèi)擴(kuò)散或擴(kuò)散至其他器官)。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“提供預(yù)后”是指提供關(guān)于癌癥的存在(例如，通過在本發(fā)明所描述的診斷方法所確定)對(duì)受試者未來健康的影響的信息(例如，預(yù)期患病或死亡、患癌的可能性和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn))。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“初步診斷”是指初步癌癥診斷的結(jié)果(例如是否存在癌性細(xì)胞)。初步診斷不包括關(guān)于前列腺特異性抗原失效風(fēng)險(xiǎn)的癌癥的分期的信息。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“活組織檢查組織”是指當(dāng)為了確定樣品是否包含癌性組織的目的而取自受試者的組織(例如前列腺組織)樣品。在一些實(shí)施方案中，因懷疑受試者患有癌癥，所以獲取活組織檢查組織。之后，檢測(cè)活組織檢查組織(例如通過顯微鏡)是否存在癌癥。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“非人類動(dòng)物”是指所有非人類動(dòng)物，包括(但不限于)脊椎動(dòng)物(例如嚙齒類)、非人類的靈長(zhǎng)類、羊類、牛類、反芻類、兔類、豬類、山羊類、馬類、犬科、貓科、
僉米坐坐尚寸寸O術(shù)語(yǔ)“基因”是指核酸(例如DNA)序列，所述核酸序列包括產(chǎn)生多肽、前體或RNA(例如rRNA、tRNA)所必需的編碼序列。多肽可由全長(zhǎng)編碼序列或編碼序列的任意部分所編碼，只要保留全長(zhǎng)或片段的所需活性或所需功能特性(例如，酶活性、配體結(jié)合性、信號(hào)傳導(dǎo)性、免疫原性等)。該術(shù)語(yǔ)還包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和位于鄰近該編碼區(qū)5’和3’端處距離每端約Ikb或以上的序列，以使該基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于該編碼區(qū)的5’端并在mRNA上存在的序列被稱為5’非翻譯序列。位于該編碼區(qū)的3’端或下游并在mRNA上存在的序列被稱為3’非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”包括cDNA和基因的基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆包含被非編碼序列(被稱為“基因內(nèi)區(qū)”、或“介入?yún)^(qū)”、或“介入序列”)中斷的編碼區(qū)?；騼?nèi)區(qū)是轉(zhuǎn)錄到核RNA (hnRNA)中的基因片段；基因內(nèi)區(qū)可包含調(diào)控元件，例如增強(qiáng)子?；騼?nèi)區(qū)是從核轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物移除或“剪接”的；因此基因內(nèi)區(qū)不存在于信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物內(nèi)。mRNA在翻譯過程中起作用以在新生多肽內(nèi)指定氨基酸的序列或次序。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“異源基因”是指不處于其自然環(huán)境內(nèi)的基因。例如，異源基因包括來自被引入另一個(gè)物種中的一個(gè)物種的基因。異源基因還包括源于按照一些方式改變(例如，突變、添加多個(gè)拷貝、與非天然調(diào)控序列連接等)的有機(jī)體的基因。因?yàn)楫愒椿蛐蛄幸话闩c這樣的DNA序列連接，該DNA序列未被發(fā)現(xiàn)與染色體的基因序列自然相關(guān)或與在自然界內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的染色體的部分相關(guān)(例如在基因非正常表達(dá)的基因座內(nèi)表達(dá)的基因)，所以異源基因不同于內(nèi)源基 因。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”是指將編入基因內(nèi)的基因信息通過基因的“轉(zhuǎn)錄”(即，通過RNA聚合酶的酶促作用)轉(zhuǎn)換成RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的過程，對(duì)于編碼蛋白的基因而言，是通過mRNA的“翻譯”轉(zhuǎn)換成蛋白的過程。可在該過程中的許多階段調(diào)控基因表達(dá)。“上調(diào)”或“活化”是指產(chǎn)生增加的基因表達(dá)產(chǎn)物(即，RNA或蛋白)的調(diào)控，而“下調(diào)”或“抑制”是指產(chǎn)生降低的基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控。上調(diào)或下調(diào)中涉及的分子(例如，轉(zhuǎn)錄因子)常常分別被稱為“活化因子”和“抑制因子”。除包含基因內(nèi)區(qū)之外，基因的基因組形式還可包括位于在RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)的序列的5’和3’端的序列。這些序列被稱為“側(cè)翼”序列或“側(cè)翼”區(qū)域(這些側(cè)翼序列位于在mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)的非翻譯序列的5’端或3’端)。5’側(cè)翼區(qū)域可包含調(diào)控序列，例如控制或影響基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3’側(cè)翼區(qū)域可包含指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后裂解和聚腺苷酸化的序列。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指長(zhǎng)度短的單鏈多核苷酸鏈。盡管本發(fā)明所用的寡核苷酸的殘基長(zhǎng)度一般小于200 (例如在15-100之間)，但是該術(shù)語(yǔ)還意欲包括較長(zhǎng)的多核苷酸鏈。寡核苷酸常常由其長(zhǎng)度所命名。例如，24殘基寡核苷酸被稱為“24聚體(24-mer)”。寡核苷酸可通過自雜交或通過與其他多聚核苷酸雜交而形成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)可包括(但不限于)雙鏈體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、十字形結(jié)構(gòu)、彎曲結(jié)構(gòu)和三鏈體。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)”用于指通過堿基配對(duì)規(guī)則相關(guān)的多聚核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“5’-A-G-T-3' ”與序列“3’-T-C-A-5' ”是互補(bǔ)的?；パa(bǔ)可以是“局部的”，其中根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則僅有一些核酸的堿基是匹配的?；蛘撸诤怂嶂g可能有“完全”或“全部”的互補(bǔ)。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度顯著影響核酸鏈之間的雜交的效率和強(qiáng)度。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及取決于核酸之間的結(jié)合的檢測(cè)方法中特別重要。術(shù)語(yǔ)“同源”是指互補(bǔ)的程度?？赡苡胁糠滞椿蛲耆?即，同一性)。部分互補(bǔ)序列是至少部分抑制完全互補(bǔ)的核酸分子與“基本上同源”的目標(biāo)核酸雜交的核酸分子。在低嚴(yán)密性條件下，使用雜交分析法(DNA印跡雜交法、或RNA印跡雜交法、溶液雜交法等等)可檢測(cè)完全互補(bǔ)序列與目標(biāo)序列雜交的抑制情況。在低嚴(yán)密性條件下，基本上同源的序列或探針將競(jìng)爭(zhēng)并且抑制完全同源的核酸分子與目標(biāo)的結(jié)合(即，雜交)。但這并不代表低嚴(yán)密性條件為允許非特異性結(jié)合的條件；低嚴(yán)密性條件要求兩個(gè)序列的相互結(jié)合是特異性(即，選擇性)相互作用。通過利用基本上不互補(bǔ)的(例如同一性小于約30%)的第二目標(biāo)可檢測(cè)非特異性結(jié)合的缺乏；在非特異性結(jié)合缺乏的情況下，探針將不與該第二不互補(bǔ)的目標(biāo)雜交。當(dāng)涉及雙鏈核酸序列(例如cDNA或基因組克隆)而使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上同源的”是指在如上所述低嚴(yán)密性條件下任何可與雙鏈核酸序列中任何單鏈或雙鏈雜交的探針。當(dāng)涉及單鏈核酸序列而使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上同源的”是指在如上所述低嚴(yán)密性條件下任何可與單鏈核酸序列雜交(即，它是互補(bǔ)物)的探針。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”用來指互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交和雜交強(qiáng)度(即，核酸間的締合強(qiáng)度)受如下因子影響(例如):核酸間的互補(bǔ)程度、所涉及的條件的嚴(yán)密性、所形成的雜種的Tn1、和核酸內(nèi)的G:C比。在結(jié)構(gòu)內(nèi)包含互補(bǔ)核酸的配對(duì)的單分子被認(rèn)為是“自雜交的”。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是指雙鏈核酸分子總體半解離成單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸的Tm的等式是本領(lǐng)域公知的。如由標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所表示的，當(dāng)核酸在IMNaCl的水溶液中時(shí)，可通過等式:Tm=81.5+0.41 (%G+C)來計(jì)算Tm的簡(jiǎn)單估計(jì)值(參見例如，Anderson和Young，定量過濾雜交，核酸雜交[1985])。其他參考文獻(xiàn)包括考慮結(jié)構(gòu)特性以及序列特性來計(jì)算Tm的更復(fù)雜計(jì)算。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)密性”用來指溫度、離子強(qiáng)度和其他例如有機(jī)溶劑之類的化合物存在的條件，在該條件下進(jìn)行核酸雜交。在“低嚴(yán)密性條件下”，目標(biāo)核酸序列將與其精確互補(bǔ)物、單個(gè)堿基失配的序列、密切相關(guān)的序列(例如同源性在90%或以上的序列)和僅部分同源的序列(例如，同源性為50-90%的序列)雜交。在“中等嚴(yán)密性條件下”，目標(biāo)核酸序列將僅與其精確互補(bǔ)物、單個(gè)堿基失配的序列和密切相關(guān)的序列(例如同源性在90%或以上)雜交。在“高嚴(yán)密性條件下”，目標(biāo)核酸序列將僅與其精確互補(bǔ)物和(依賴于例如溫度之類的條件)單個(gè)堿基失配的序列雜交。換句話說，在高嚴(yán)密性條件下，可升高溫度以排除與單個(gè)堿基失配的序列的雜交。當(dāng)“高嚴(yán)密性條件”用來指核酸雜交時(shí)，其包括等同于下述的條件:當(dāng)采用長(zhǎng)度為約 500 個(gè)核苷酸的探針時(shí)，在 42°C下在由 5X SSPE (43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 和
1.85g/l EDTA，pH 以 NaOH 調(diào)節(jié)至 7.4),0.5% 的 SDS、5X 丹哈特試劑(Denhardt，s reagent)和100 μ g/ml的變性鮭魚精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交并且接著在包含0.1XSSPEU.0%的SDS的溶液中在42 °C下清洗。當(dāng)“中等嚴(yán)密性條件”用來指核酸雜交是，其包括等同于下述的條件:當(dāng)采用長(zhǎng)度為約500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，在42°C下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl,6.9g/l NaH2PO4H2O和
1.85g/l EDTA，pH以NaOH調(diào)節(jié)至7.4),0.5%的SDS、5X丹哈特試劑和100 μ g/ml的變性鮭魚精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交并且接 著在包含1.0X SSPEU.0%SDS的溶液中在42°C下清洗。
“低嚴(yán)密性條件”包括等同于下述的條件:當(dāng)采用長(zhǎng)度為約500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，在 42°C下在由 5X SSPE (43.8g/l NaCl,6.9g/1NaH2PO4H2O 和 1.85g/l EDTA，pH 以 NaOH調(diào)節(jié)至7.4),0.1%的SDS、5X丹哈特試劑[50X丹哈特試劑每500ml包含:5g聚糖體(400型,Pharamcia)、5g BSA (Fraction V ;西格瑪(Sigma)]和 100 μ g/ml 的變性鮭魚精 DNA 組成的溶液中結(jié)合或雜交并且接著在包含5X SSPE、0.1%SDS的溶液中在42 °C下清洗。本領(lǐng)域公知可采用許多等同條件以包括低嚴(yán)密性條件；考慮例如探針的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)、靶的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中、被固定等)、以及鹽和其他組分的濃度(例如，是否存在甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇)之類的因素，并且可改變雜交溶液以產(chǎn)生不同于、但等效于上述所列條件的低嚴(yán)密性雜交條件。此外，本領(lǐng)域已知在高嚴(yán)密性條件下促進(jìn)雜交的條件(例如，提高雜交和/或清洗步驟的溫度、將甲酰胺用于雜交溶液等等)(參見上述關(guān)于“嚴(yán)密性”的定義)。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“探針”是指寡核苷酸(S卩，核苷酸序列)，其中無論其是在如純化限制酶切消化中天然存在的的還是合成、重組或通過PCR擴(kuò)增制備的，其都能夠與另一種目標(biāo)寡核苷酸的至少一部分雜交。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針用于檢測(cè)、鑒定和分離特定的基因序列?？煽紤]用任何“報(bào)道分子”標(biāo)記本發(fā)明所用的任何探針，使得在任何檢測(cè)系統(tǒng)中都是可檢測(cè)的，所述檢測(cè)系統(tǒng)包括(但不限于)酶檢測(cè)系統(tǒng)(例如ELISA以及酶基組織化學(xué)分析)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)、放射檢測(cè)系統(tǒng)和發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)。其意圖并非將所描述的方法限制為任何特定的檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)簽。當(dāng)本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“部分”用來指核苷酸序列(如“給定核苷酸序列的一部分”)時(shí)，其是指該序列的片段。片段的尺寸范圍在四個(gè)核苷酸到整個(gè)核苷酸序列減去一個(gè)核苷酸(10個(gè)核苷酸、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)等)。“氨基酸序列”和例如“多肽”或“蛋白”之類的術(shù)語(yǔ)并不意味著將氨基酸序列限制為與所述的蛋白分子相關(guān)的完整、天然的氨基酸序列。

本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“天然蛋白”是指不包含由載體序列編碼的氨基酸殘基的蛋白；即，天然蛋白只包含那些天然存在的蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸?？赏ㄟ^重組方式制備天然蛋白，或者可將天然蛋白與天然存在源相分離。當(dāng)本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“部分”用來指蛋白(例如“給定蛋白的一部分”)時(shí)，其是指該蛋白的片段。片段的尺寸范圍在四個(gè)氨基酸殘基至整個(gè)氨基酸序列減去一個(gè)氨基酸之間。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“過度表達(dá)”和語(yǔ)法上的同等術(shù)語(yǔ)用來指mRNA的水平時(shí)，其是指表示表達(dá)水平比在對(duì)照或非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)的給定組織中觀察到的表達(dá)水平大約高3倍(或更高)。使用若干本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(包括(但不限于)RNA印跡分析法)中的任一技術(shù)來測(cè)定mRNA的水平。在RNA印跡法中包括適當(dāng)?shù)膶?duì)照以控制來自各接受分析的組織中的RNA的量的差異(例如，28S rRNA的量、以基本上相同的量存在于所有組織內(nèi)、并存在于每個(gè)樣品內(nèi)的豐富的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可用作標(biāo)準(zhǔn)化或規(guī)范化在RNA印跡上觀察到的mRNA特異性信號(hào)的方法)。對(duì)存在于尺寸對(duì)應(yīng)于正確拼接的轉(zhuǎn)基因RNA的條帶上的mRNA的量進(jìn)行定量；在轉(zhuǎn)基因mRNA表達(dá)的定量時(shí)忽略其他少數(shù)物種的與轉(zhuǎn)基因探針雜交的RNA。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“體外”是指人造環(huán)境和在人造環(huán)境下產(chǎn)生的過程或反應(yīng)。體外環(huán)境可包括(但不限于)試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”是指自然環(huán)境(例如，動(dòng)物或細(xì)胞)和在自然環(huán)境下產(chǎn)生的過程或反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“受試化合物”和“候選化合物”是指任何化學(xué)實(shí)體、藥物、藥品等，所有這些都作為用于治療或防治疾病、病癥、不適或身體機(jī)能混亂(例如，癌癥)的候選物。受試化合物包括已知和潛在的治療化合物。可通過使用本發(fā)明描述的篩選法進(jìn)行篩選而確定受試化合物是治療性的。在一些實(shí)施方案中，受試化合物包括反義化合物。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“樣品”是以其最廣泛的意義使用的。在某種意義上，其意味著包括從任何來源所獲得的樣品或培養(yǎng)物以及生物樣品和環(huán)境樣品。生物樣品可獲得自動(dòng)物(包括人類)并且包括流體、固體、組織和氣體。生物樣品包括血液制品，例如血漿、血清等。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料，例如表面物質(zhì)、土壤、水、晶體和工業(yè)樣品。然而，不應(yīng)將此類樣品理解為是對(duì)適用于所述組合物和方法的限制。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“前列腺樣品”是指任何包含前列腺細(xì)胞或分泌物的樣品。前列腺樣品包括(但不限于)前列腺組織樣品(例如活組織檢查樣品)或尿液樣品。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”可描述進(jìn)行一般的發(fā)現(xiàn)或辨別或者對(duì)可檢測(cè)地標(biāo)記的組合物進(jìn)行特異性地觀測(cè)。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“siRNA”是指小干擾RNA。在一些實(shí)施方案中，siRNA包括約18-25核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈體或雙鏈區(qū)域；并且通常而言siRNA在每條鏈的3’端包含約2_4個(gè)未配對(duì)的核苷酸。siRNA的雙鏈體或雙鏈區(qū)域中的至少一條鏈?zhǔn)桥c目標(biāo)RNA分子基本上同源或基本上互補(bǔ)的。與目標(biāo)RNA分子互補(bǔ)的鏈?zhǔn)恰胺戳x鏈”；與目標(biāo)RNA分子同源的鏈?zhǔn)恰坝辛x鏈”，并且其還與siRNA的反義鏈互補(bǔ)。siRNA還可包含另外的序列；此類序列的非限制實(shí)例包括連接序列、或環(huán)、以及莖和其他折疊結(jié)構(gòu)。siRNA似乎在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物體內(nèi)觸發(fā)RNA干擾和在植物內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后基因的沉默過程中觸發(fā)序列特異性RNA分解中起關(guān)鍵媒介作用。術(shù)語(yǔ)“RNA干擾”或“RNAi”是指經(jīng)由于siRNA基因的表達(dá)沉默或降低。這是由siRNA在動(dòng)物體內(nèi)或植物內(nèi)觸發(fā)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因的沉默過程，該siRNA在其雙鏈體區(qū)域內(nèi)與沉默基因的序列是同源的。該基因?qū)τ谟袡C(jī)體而言可以是內(nèi)源性的或外源性的，存在并整合到染色體中或存在于`未整合到染色體組中的轉(zhuǎn)染載體中?？赏耆虿糠忠种苹虻谋磉_(dá)。還可認(rèn)為RNAi抑制目標(biāo)RNA的功能；該目標(biāo)RNA可具有完整的功能或部分的功能。本發(fā)明描述了用于研究、診斷和治療癌癥的組合物和方法，包括(但不限于)癌癥標(biāo)志物。特別地，本發(fā)明提供前列腺癌的SPINKl和其他標(biāo)志物。因此，本發(fā)明提供檢測(cè)標(biāo)志物以及藥物篩選和治療應(yīng)用的方法和試劑盒。1.前列腺癌標(biāo)志物本發(fā)明提供在前列腺癌組織中表達(dá)發(fā)生特異地改變的標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)該標(biāo)志物可用于前列腺癌的診斷和表征。例如，本發(fā)明所述的試驗(yàn)鑒定SPINKl在前列腺癌中過度表達(dá)。此外，SPINKU ERG和ETVl呈現(xiàn)互斥的異常表達(dá)。進(jìn)一步試驗(yàn)鑒定用于檢測(cè)與前列腺癌相關(guān)的基因表達(dá)(包括SPINK1、PCA3、G0LPH2和TMPRSS2:ERG融合體)的多重系列檢驗(yàn)。A.SPINKlSPINKl (絲氨酸肽酶抑制劑，Kazall型)的cDNA序列在Genbank中的編號(hào)為NM_003122.2。由SPINKl編碼的肽(又稱PSTI或TATI)最初從牛胰腺和人胰液中分離出來；它的常規(guī)功能被認(rèn)為是抑制胰腺中的胰蛋白酶(參見:Haverback etal., Am J Med29, 421-33 (1960) ; Kazal et al.，美國(guó)化學(xué)會(huì)志(Journal of theAmerican Chemical Society) 70，3034-3040 (1948) ;Paju et al., Crit Rev Clin LabSci43, 103-42(2006) ; Greene et al.,Methods Enzymol45, 813-25 (1976))。在許多良性和癌性組織中已檢測(cè)出SPINKl mRNA和蛋白，然而其在前列腺中的表達(dá)并未得到描述(Paju 和 Stenman 的綜述,Crit Rev Clin Lab Sci43, 103-42 (2006)，Stenman, ClinChem48, 1206-9(2002) )。SPINKl編碼具有79個(gè)氨基酸的肽(其具有23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽)，并且其可于健康個(gè)體的尿液和血清中檢測(cè)到(Paju and Stenman,上文)。SPINKl的血清濃度除在重度炎癥和胰腺炎中急劇升高外，在很多癌癥中可出現(xiàn)調(diào)節(jié)異常，包括胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、腎癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、腎癌以及卵巢癌(Paju和Stenman的綜述，上文，Stenman,上文)?？傊?，該項(xiàng)研究使用生物信息學(xué)方法在TMPRSS2:ETS陰性前列腺癌亞群中鑒定了顯著的SPINKl的過度表達(dá)，并用qPCR法確認(rèn)了這些結(jié)果。綜上所述，研究結(jié)果表明=SPINKl的過度表達(dá)在前列腺癌的進(jìn)展和起到前列腺癌的分子亞型的生物標(biāo)記的功能中起到重要作用。B.ERG相對(duì)于其他正常人體組織，已驗(yàn)證ERG(NM_004449)在前列腺上皮組織中高度表達(dá)。ERG基因位于21號(hào)染色體上。該基因位于pter基因中的38，675，671-38，955，488堿基對(duì)上。ERG基因總計(jì)有279，817個(gè)堿基對(duì)，負(fù)鏈方向。相應(yīng)的ERG cDNA和蛋白的序列在Genbank中的編號(hào)分別為M17254和NP04440(Swiss Protein蛋白序列庫(kù)的編號(hào)為P11308)。C.ETVlETVl基因位于7號(hào)染色體上(在Genbank中的編號(hào)為NC_000007.11、NC_086703.11 以及 ΝΤ_007819.15)。該基因位于 pter 基因中的 13，708330 - 13，803，555堿基對(duì)上。ETVl基因總計(jì)有95，225個(gè)堿基對(duì)，負(fù)鏈方向。相應(yīng)的ETVl cDNA和蛋白的序列在Genbank中的編號(hào)分別為NM_004956和NP_004947 (Swiss Protein蛋白序列庫(kù)的編號(hào)為 P50549)。 D.PCA3PCA3基因也稱之為DD3 (參見Bussemakers，PCT公開N0.W098/45420, Schalken, Eur.Urol.34(suppl.3):3 - 6(1998)，Bussemakers etal., Cancer Res.59:5975 - 5979(1999)和 Bussemakers, Eur.Urol.35:408 - 412(1999)),其位于9號(hào)染色體上，更準(zhǔn)確地說位于9q21_22區(qū)域。它包括四個(gè)外顯子，外顯子通過選擇性拼接和選擇性多聚腺苷酸化來產(chǎn)生不同大小的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過RT-PCR法，發(fā)現(xiàn)PCA3dd3的表達(dá)僅出現(xiàn)在前列腺組織中，而在所有其他測(cè)試的組織(包括睪丸、精囊、卵巢、胎盤和膀胱)中都不存在。此外，RNA印跡分析法顯示，PCA3dd3在絕大多數(shù)檢查的前列腺癌中高度表達(dá)(50例中占47例)，而在BPH患者或同一患者的正常前列腺細(xì)胞中沒有表達(dá)或極低量表達(dá)。相對(duì)于正常或BPH組織，前列腺癌中的PCA3dd3至少進(jìn)行20倍過度表達(dá)。PCA3dd3表達(dá)似乎隨腫瘤級(jí)別的增加而增加，而且可在轉(zhuǎn)移病灶中檢測(cè)到。PCA3為發(fā)生明顯選擇性拼接(以及選擇性多聚腺苷酸化)的基因，這通過在RNA印跡上觀察到不同大小的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和鑒定不同類型的克隆體中來證實(shí)。實(shí)質(zhì)上外顯子的各種結(jié)合均有可能。 在80個(gè)經(jīng)過分析的cDNA克隆中，由于選擇性拼接或選擇性多聚腺苷酸化而顯示存在至少四種不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如參見美國(guó)專利N0.7，008, 765、PCT 公開 N0.TO05/003387A2、美國(guó)專利 N0.7，138，235 和 de Kok et al., CancerRes2002 ;62:2695-8;所述每項(xiàng)專利以引用方式并入于此)。與cDNA克隆相比，基因組克隆的序列分析顯示了 PCA3基因的基因組結(jié)構(gòu)。有三個(gè)內(nèi)含子和四個(gè)外顯子。第一內(nèi)含子的長(zhǎng)度接近20kb。從約5%的cDNA克隆中發(fā)現(xiàn)第一 cDNA種屬，且該種屬含有外顯子l、2、3、4a和4b (4b的多聚腺苷酸化后進(jìn)行了實(shí)質(zhì) 共有的加(polyA)信號(hào))。約15%的cDNA克隆中發(fā)現(xiàn)第二 cDNA種屬，且該種屬中含有外顯子l、3、4a、4b和4c,其通過第二外顯子(未在該cDNA中出現(xiàn))的選擇性拼接來產(chǎn)生，并以不同的(實(shí)質(zhì)共有的)加(polyA)信號(hào)終結(jié)。第三cDNA種屬含有外顯子l、3、4a和4b,且為其是已知種屬中最常見的一種(約80個(gè)克隆的65%)(見圖1)。該cDNA最可能是引起RNA印跡分析法中觀察到的最主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的原因。所檢測(cè)的第四類cDNA種屬含有外顯子1、3和4a，代表約15%的克隆，其在4a后終止，4a是初始DD3克隆的終止點(diǎn)。這里存在的加(polyA)信號(hào)接近共有序列。E.G0LPH2G0LPH2(GP73)為與肝癌有關(guān)的乙型肝炎的糖蛋白標(biāo)志物(Block et al.，(2005)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 102，779-784)。GP73為II型高爾基體跨膜蛋白，其在病毒性肝炎患者的肝細(xì)胞中高水平地表達(dá)(Kladney，et al.，2000, Gene249, 53-65)。GP73在膽管上皮細(xì)胞中組成性表達(dá)，且在正常的肝細(xì)胞中最低限度地表達(dá)。相比而言，患有巨細(xì)胞肝炎患者的肝臟在多核肝細(xì)胞中對(duì)GP73表現(xiàn)出強(qiáng)免疫反應(yīng)活性。GP73mRNA和蛋白在感染病毒(包括腺病毒)后在高度分化的HepG2肝癌細(xì)胞中表達(dá)。由于GP73為高爾基體跨膜蛋白，因此它被認(rèn)為不會(huì)大量存在于血清、甚至具有損壞的或患病的肝臟的受試者中。已發(fā)現(xiàn)在由病毒感染(HBV、HCV)或非病毒感染(酒精導(dǎo)致的肝病、自體免疫性肝炎)導(dǎo)致的肝病中，整個(gè)器官中的GP73水平顯著增加(Kladney，et al., 2002, Hepatology35 (6):1431-40)。在不考慮病因的情況下，在患病的肝臟中，GP73的肝細(xì)胞表達(dá)不受調(diào)節(jié)；而膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)沒有明顯按變化。Gp73已用做肝癌細(xì)胞標(biāo)志物(參見，US20050112711,該案之全文以引用的方式并入本文中)。F.TMPRSS2:ERG美國(guó)
發(fā)明者阿魯·M·欽耐揚(yáng), 斯科特·A·湯姆林斯, 丹尼爾·R·羅茲, 羅希特·梅拉 申請(qǐng)人:密歇根大學(xué)董事會(huì)