專利名稱：一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法。
背景技術(shù)：
以大腸桿菌為宿主菌大規(guī)模胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白過程中，在純化目的重組蛋白前，需破碎菌體以釋放目的蛋白，破菌后高分子量的宿主菌染色體核酸釋放至裂解液中，導(dǎo)致裂解液黏度顯著增加，給后續(xù)純化工作帶來困難。FDA對(duì)藥用重組蛋白的核酸污染限度要求嚴(yán)格(每劑量應(yīng)低于IOOpg)，因此去除核酸污染也是非常必要的。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶(phosphodiesterase)，專一'丨生水解核酸的磷酸二酯酶為核酸酶。利用核酸酶降解核酸可降低破菌液的粘度。目前使破菌液中核酸降解以降低粘度的方法有兩種:一種為添加外源核酸酶，如來自Serratia marcescens的Benzonase，其為經(jīng)基因工程改進(jìn)的核酸內(nèi)切酶。其缺點(diǎn)在于費(fèi)用過高不適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。另一種替代方案是改造基因工程菌，使之能自動(dòng)降解宿主染色體核酸。但是采用一般的重組方法改造菌株，效率很低。金黃色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus nuclease,簡(jiǎn)稱SNase)是金黃色葡萄球菌分泌到胞外的一種核酸非專一性磷酸二酯酶，分子量16807道爾頓。該酶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，為含有149個(gè)氨基酸殘基的單鏈球蛋白，它不含半胱氨酸和二硫鍵，能夠可逆地去折疊和重折疊，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)的重要模型。在Ca2+存在下，SNase可將DNA和RNA水解生成3’ -單核苷酸和3’ - 二核苷酸，并表現(xiàn)出一定程度的序列特異性，傾向于作用AT富集區(qū)，能水解包括DNA、RNA，單鏈、雙鏈、環(huán)形、線形的核酸。因此可在利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時(shí)`裂解宿主菌的核酸以降低破菌液的粘度，從而提高純化效率。但在大腸桿菌中表達(dá)SNase時(shí)，也存在著表達(dá)量低，酶活不高，降解宿主染色體核酸的效果不明顯的缺點(diǎn)。因此需要提供一種既可高效表達(dá)SNase且能快速生長(zhǎng)的大腸桿菌以提聞重組蛋白的純化效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時(shí)裂解液粘度過高影響純化的問題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，該方法包括以下步驟:將pelB信號(hào)肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接，得第一組合序列，其中該P(yáng)elB信號(hào)肽編碼序列在該金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列上游；將該第一組合序列與卡那霉素抗性基因序列連接，得到第二組合序列，其中第一組合序列在卡那霉素抗性基因序列上游；用上述第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列，獲得ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109 ；將上述PtsG基因缺失的大腸桿菌JM109中的第二組合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。本發(fā)明的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法具有如下優(yōu)點(diǎn):1、同源重組效率高；2、所得菌株能在37° C無抗性培養(yǎng)基條件下快速生長(zhǎng)；3、制得的大腸桿菌表達(dá)的金黃色葡萄球菌核酸酶(SNase)可分泌至周質(zhì)空間，直接發(fā)揮作用，簡(jiǎn)化純化步驟；4、SNase基因表達(dá)的產(chǎn)物不會(huì)影響其它目的蛋白的表達(dá)，不會(huì)給宿主菌增加生長(zhǎng)負(fù)荷；5、ptsG基因的敲除能降低發(fā)酵過程中乙酸的積累，減少細(xì)胞毒性，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法操作流程；圖2為本發(fā)明實(shí)施例的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法獲得的第二組合序列的酶切檢驗(yàn)電泳圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法獲得的ptsG:: SNase重組大腸桿菌PCR鑒定圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備的目的重組大腸桿菌的SDS-PAGE電泳驗(yàn)證圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備的目的重組大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白降解染色體DNA的電泳圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明所用術(shù)語“敲除”為分子生物學(xué)常用術(shù)語，通常是指將某段特定基因或序列從宿主中完全地去掉。本發(fā)明實(shí)施例提供一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，包括以下步驟:SOl將pelB信號(hào)肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接，得第一組合序列，其中該P(yáng)elB信號(hào)肽編碼序列在所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列上游，然后將該第一組合序列與卡那霉素抗性基因序列連接，得到第二組合序列，其中該第一組合序列在所述卡那霉素抗性基因序列上游；S02用步驟SOl制得的第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列，獲得ptsG基因缺失的大腸桿囷JM109 ；S03將上述ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109內(nèi)的第二組合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。本發(fā)明實(shí)施例通過兩次同源重組獲得表達(dá)SNase的大腸桿菌，操作流程見圖1，圖1中的第一步利用同源重組將第二組合序列(即PelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性基因編碼序列)與ptsG基因替換，該步驟利用質(zhì)粒pKOBEG或pKD46進(jìn)行；第二步將pelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性編碼序列中的Km抗性基因(即圖1中的Kan)敲除，該步驟通過質(zhì)粒pCP20進(jìn)行。
具體地，本發(fā)明實(shí)施例中pelB信號(hào)肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列的連接通過將金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至載體PET獲得，即所述pelB信號(hào)肽編碼序列來自于PET載體。在本發(fā)明實(shí)施例中，將金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至載體pET后，通過PCR擴(kuò)增獲得同時(shí)含有T7啟動(dòng)子、終止子、信號(hào)肽pelB及SNase基因片段的連接序列。具體地，本發(fā)明實(shí)施例中使用的pelB信號(hào)肽編碼序列為SEQ ID NO: 1，如下所示:ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAG CGCAGGCCSEQ ID NO:1。本發(fā)明實(shí)施例中使用的金黃色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因序列為其完整序列(NC_009641.l，534bp)，具體為 SEQ ID NO: 2，如下所示:ATGAAGTCAA ATAAATCGCT TGCTATGATT GTGGTAGCCA TCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAAT TTATGAATCA TACGGGTCCT TTCAAAAAGG GGACGAATCATGAAACTGTACAAGATTTAA ATGGTAAAGA TAAAGTACAT GTTCAAAGAG TTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATC AAAATGGTAA AGAAATTAAA GTTAGGC TTA TAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAAC CGAATACGCC TGTACAACCA TTTGGCAAAG AAGCATCAAATTATAGTAAGAAGACATTAA CAAATCAAGA TGTTTATTTA GAATATGATA AAGAAAAACAAGATCGCTATGGTAGAACAT TGGCGTATGT ATGGATAAGT AAAGATCGTA TGTACAATAAGGAATTAGTGGAAAAGGGAC TTGCTAGAGA GAAGTATTTT TCACCAAATG GCAAATATAGAAATGTATTTATAGAAGCAC AAAATAAAGC TAAACAACAG AAATTAAATA TTTGGAGTAA ATAA該金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列可通過人工合成獲得，也可以金黃色葡萄球菌基因組為模板，用PCR克隆獲 得。本發(fā)明實(shí)施例中利用PCR克隆SNase基因序列時(shí)，所使用的引物對(duì)為PI:GGGGGATCCATGAAGTCAAATAAATCGCT SEQ ID NO:3P2:GGGCTCGAGTTATTTACTCCAAATATTTA SEQ ID NO:4。在上述引物Pl中插入BamHI酶切位點(diǎn)(即下劃線部分)，引物P2中插入XhoI酶切位點(diǎn)(上述下劃線部分)，以便利用雙酶切法與載體pET-22b連接。分別用BamHI和XhoI雙酶切克隆獲得的SNase基因片段和載體pET_22b，用DNA連接酶將兩者連接起來以獲得質(zhì)粒pEY-SNase，即得到位于載體上的信號(hào)肽pelB與SNase連接的第一組合序列，且該序列還含有T7啟動(dòng)子和終止子。使用引物對(duì)P3和P4獲得該信號(hào)肽pelB與SNase連接的編碼序列，P3和P4序列為:P3:TTCAGCAAAAAACCCCTCAA SEQ ID NO:5P4:CGCGTCGACAATTAATACGACTCACTATA SEQ ID NO:6，該P(yáng)4中加入SalI酶切位點(diǎn)，如下劃線所示，使得該第一組合序列3’末端引入SalI酶切位點(diǎn)，同時(shí)在卡那霉素抗性基因序列5’端引入SalI酶切位點(diǎn)，便于將兩者連接得到第二組合序列。本發(fā)明實(shí)施例中使用的卡那霉素(Km)抗性基因序列為SEQ ID N0:7，如下所示:GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAA GATCCCCTTA TTAGAAGAAC TCGTCAAGAA GGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGG GAGCGGCGAT ACCGTAAAGC ACGAGGAAGC GGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAG CAATATCACG GGTAGCCAAC GCTATGTCCT GATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCAC AGTCGATGAA TCCAGAAAAG CGGCCATTTT CCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGC CATGGGTCAC GACGAGATCC TCGCCGTCGG GCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTT CGGCTGGCGC GAGCCCCTGA TGCTCTTCGT CCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTT CCATCCGAGT ACGTGCTCGC TCGATGCGAT GTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAG CCGGATCAAG CGTATGCAGC CGCCGCATTG CATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAG GAGCAAGGTG AGATGACAGG AGATCCTGCC CCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCC TTCCCGCTTC AGTGACAACG TCGAGCACAG CTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCC ACGATAGCCG CGCTGCCTCG TCCTGCAGTT CATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGA CAAAAAGAAC CGGGCGCCCC TGCGCTGACA GCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGA TTGTCTGTTG TGCCCAGTCA TAGCCGAATA GCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTG CGTGCAATCC ATCTTGTTCA ATCATGCGAA ACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATC TTGATCCCCT GCGCCATCAG ATCCTTGGCG GCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGG GCTTCCCAAC CTTACCAGAG GGCGCCCCAG CTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGTCCATA AAACCGCCCA GTCTAGCTAT CGCCATGTAA GCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTG CGCTTGCGTT TTCCCTTGTC CAGATAGCCC AGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACC GTTTCTGCGG ACTGGCTTTC TACGTGTTCC GCTTCCTTTAGCAGCCCTTGCGCCCTGAGT GCTTGCGGCA GCGTGAGCTT CAAAAGCGCT CTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGG AACTTCGAAC TGCAGGTCGA CGGATCCCCG GAATTAATTCTCATGTTTGACAG。該Km抗性基因序列以質(zhì)粒PKD13為模板，利用引物P5和P6通過PCR克隆獲得。具體地，該引物P5和P6的序列為:`
P5:CGCGTCGACGGACCATGGCTAATTCCCAT SEQ ID NO:8P6:CGCGATATCCTGTCAAACATGAGA`ATTAA SEQ ID NO:9且所得Km抗性基因序列5’端和3’端均包含F(xiàn)RT位點(diǎn)，F(xiàn)RT便于進(jìn)行DNA序列的同源重組。在引物P5中加入SalI酶切位點(diǎn)，在引物P6中加入EcoRV酶切位點(diǎn)，如下劃線所示。將第一組合序列與Km抗性基因序列連接，即獲得步驟SOl中的第二組合序列，即pelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性基因編碼序列。具體地，在獲得該第二組合序列的連接過程中，通過將第一組合序列與平末端克隆載體pEASY-Blunt連接，通過SalI與EcoRV雙酶切，第一組合序列只含有SalI酶切位點(diǎn)，而pEASY-Blunt上含有EcoRV酶切位點(diǎn)，因此將該載體切開，且第一組合序列連接于載體上dfKm抗性基因序列與另一平末端克隆載體pEASY-Blunt連接，通過SalI與EcoRV雙酶切，切下Km抗性基因序列，然后將其與上述被切開的載體連接，即得連接至載體pEASY-Blunt的第二組合序列。本發(fā)明實(shí)施例中使用JM109菌株作為重組蛋白表達(dá)菌株，JM109可作為大多數(shù)質(zhì)粒載體的受體菌，該菌株易于培養(yǎng)，并且可以用較多的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明實(shí)施例中利用基因重組系統(tǒng)使用上述第二組合序列(即pelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性基因編碼序列)替換大腸桿菌JM109中的ptsG基因序列，即在插入該pelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性基因編碼序列時(shí)敲除了 ptsG基因序列。大腸桿菌對(duì)葡萄糖的攝取主要通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)完成，其中由PtsG基因編碼的酶II CBGlc在葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用。故在大腸桿菌JM109中敲除ptsG基因，能夠很大程度地降低葡萄糖的攝取速率，由此可降低乙酸的累積，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。具體地，在步驟S02中，替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列的步驟即利用基因重組系統(tǒng)替換PtsG基因序列，該操作包括將質(zhì)粒pKOBEG轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，然后將第二組合序列即PelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性基因編碼序列轉(zhuǎn)化，此時(shí)質(zhì)粒pKOBEG將促使pelB信號(hào)肽-SNase-Km抗性基因編碼序列與ptsG基因序列替換。所述轉(zhuǎn)化步驟采用電轉(zhuǎn)化進(jìn)行，電轉(zhuǎn)化具有較高的轉(zhuǎn)化效率。另一可選方案中，在步驟S02中，可用質(zhì)粒PKD46代替上述質(zhì)粒pKOBEG，兩者具有相同的性質(zhì)，均可用于大腸桿菌的基因重組系統(tǒng)。在步驟S02中，利用第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列完成之后，將用于基因替換的質(zhì)粒PKOBEG或質(zhì)粒pKD46去除，以消除該外來質(zhì)粒對(duì)于宿主大腸桿菌的影響。因?yàn)檫@兩種質(zhì)粒均對(duì)溫度敏感，因此可通過在37°C連續(xù)培養(yǎng)來使這兩種質(zhì)粒消失。因?yàn)橘|(zhì)粒PKOBEG具 有氯霉素抗性，因此可以用含氯霉素的培養(yǎng)基檢驗(yàn)質(zhì)粒pKOBEG是否真正被消除；而質(zhì)粒PKD46具有氨芐青霉素抗性，因此可以用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基檢驗(yàn)質(zhì)粒pKD46是否真正被消除。在步驟S03中，通過基因重組系統(tǒng)將所述第二組合序列中的卡那霉素抗性基因敲除，該敲除過程通過質(zhì)粒PCP20進(jìn)行。且將卡那霉素抗性基因敲除后，再將質(zhì)粒PCP20消除。以消除該外來質(zhì)粒對(duì)于宿主大腸桿菌的影響。本發(fā)明的大腸桿菌制備方法通過兩次連接，兩次同源重組，制得一種含SNase基因的重組大腸桿菌，該制備方法步驟簡(jiǎn)便，易于操作；重組的大腸桿菌表達(dá)的金黃色葡萄球菌核酸酶(SNase)可分泌至周質(zhì)空間，直接發(fā)揮作用，簡(jiǎn)化純化步驟；因?yàn)榍贸?ptsG基因可降低發(fā)酵過程中乙酸的積累，減少細(xì)胞毒性，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)；且同源重組使用的質(zhì)粒在宿主菌中均被去除，減少了對(duì)于重組蛋白表達(dá)的影響，提聞了表達(dá)效率。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。本發(fā)明實(shí)施例中使用的核酸內(nèi)切酶、連接酶、質(zhì)粒pMD18-Tsimple、PCR反應(yīng)試劑盒以及DNA片段回收試劑盒等為商業(yè)產(chǎn)品，均可從市場(chǎng)購得，具體操作按照說明書進(jìn)行，在此不再詳述。其他未注明的實(shí)驗(yàn)操作按照常規(guī)分子操作方法進(jìn)行，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。另外，本發(fā)明實(shí)施例中涉及的引物、基因合成、測(cè)序均由深圳華大基因有限公司合成。質(zhì)粒pKD46、pKD13、pCP20購自耶魯大學(xué)(CGSC)，大腸桿菌JM109購自大連寶生物工程有限公司。實(shí)施例11、SNase片段的獲得按如下序列合成正反向引物:if 向引物 Pl:GGGGGATCCATGAAGTCAAATAAATCGCT SEQ ID NO: 3反向引物 P2:GGGCTCGAGTTATTTACTCCAAATATTTA SEQ ID NO:4在Pl引物中加入BamHI酶切位點(diǎn)，即下劃線部分，在P2中加入XhoI酶切位點(diǎn)，即下劃線部分，以PU P2為引物，以金黃色葡萄球菌基因組為模板，配制50μ L的PCR反應(yīng)體系，具體如下:
權(quán)利要求
1.一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，該方法包括以下步驟: 將pelB信號(hào)肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接，得第一組合序列，其中所述PelB信號(hào)肽編碼序列在所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列上游； 將所述第一組合序列與卡那霉素抗性基因序列連接，得到第二組合序列，其中所述第一組合序列在所述卡那霉素抗性基因序列上游； 用所述第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列，獲得PtsG基因缺失的大腸桿菌JM109 ； 將所述PtsG基因缺失的大腸桿菌JM109的第二組合序列中的卡那霉素抗性基因敲除。
2.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述pelB信號(hào)肽編碼序列為SEQ ID NO: 1，所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列為SEQ IDNO:2，所述卡那霉素抗性基因序列為SEQ ID N0:5。
3.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌核酸酶基因利用序列為SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4的引物對(duì)克隆獲得。
4.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因序列以質(zhì)粒PKD13為模板，利用序列為SEQ IDN0:8和SEQ ID N0:9的引物對(duì)克隆獲得。
5.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述將pelB信號(hào)肽編碼序列與金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列連接通過將金黃色葡萄球菌核酸酶基因序列插入至載體 PET獲得。
6.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因序列以質(zhì)粒PKD13為模板克隆獲得，且其5’端和3’端均包含F(xiàn)RT位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述用第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列的步驟包括將質(zhì)粒pKOBEG或質(zhì)粒PKD46轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109的操作。
8.如權(quán)利要求7所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述用第二組合序列替換大腸桿菌JM109的ptsG基因序列的步驟還包括將所述質(zhì)粒pKOBEG或質(zhì)粒PKD46去除的操作。
9.如權(quán)利要求1所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述將卡那霉素抗性基因敲除的步驟包括將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)化至所述ptsG基因缺失的大腸桿菌JM109的操作。
10.如權(quán)利要求9所述的裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，其特征在于，所述將卡那霉素抗性基因敲除的步驟還包括將所述質(zhì)粒PCP20去除的操作。
全文摘要
本發(fā)明適用于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種裂解時(shí)自動(dòng)降解核酸的大腸桿菌制備方法，包括將pelB信號(hào)肽序列與SNase序列連接，得第一組合序列，將該第一組合序列與Km基因序列連接，得到第二組合序列；用該第二組合序列替換大腸桿菌的ptsG基因序列，獲得ptsG基因缺失的大腸桿菌；將該ptsG基因缺失的大腸桿菌中的第二組合序列中的Km基因敲除。本發(fā)明的大腸桿菌制備方法具有同源重組效率高的優(yōu)點(diǎn)，且制得的大腸桿菌表達(dá)的SNase可分泌至周質(zhì)空間，且SNase基因表達(dá)的產(chǎn)物不會(huì)影響其它目的蛋白的表達(dá)，能降低發(fā)酵過程中乙酸的積累，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103205448SQ20131005235
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月18日
發(fā)明者徐東, 任昌義 申請(qǐng)人:深圳市亞太興實(shí)業(yè)有限公司