專利名稱：一種改造重組酶Cre的方法及其在植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的植物基因工程領(lǐng)域，涉及對(duì)重組酶Cre進(jìn)行拆分，構(gòu)建新的Cre/loxp系統(tǒng)的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，該技術(shù)在改良作物品質(zhì)，提高作物產(chǎn)量，減少除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥的使用量等方面做出了巨大貢獻(xiàn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)給我們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)利益和生態(tài)效益的同時(shí)，由于該技術(shù)不斷發(fā)展突破并且開發(fā)利用的時(shí)間尚短，轉(zhuǎn)基因植物在生態(tài)環(huán)境和食品安全等方面引起的質(zhì)疑越來越多，賈士榮等認(rèn)為目前人類還不能對(duì)該技術(shù)帶來的潛在危險(xiǎn)性做出正確評(píng)價(jià)，其主要原因是轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中的一些外源的選擇標(biāo)記基因的存在。Goldsbrough等采用轉(zhuǎn)座子技術(shù)、Komari等采用共轉(zhuǎn)化技術(shù)去除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因，而應(yīng)用最早、最廣泛、最深入的是位點(diǎn)特異性系統(tǒng)中的Cre/loxp 系統(tǒng)。

Cre/loxp系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和酵母等生物體中，尤其在小鼠當(dāng)中的研究最為深入。Gilbertson等認(rèn)為Cre/loxp系統(tǒng)是植物生物技術(shù)領(lǐng)域中切除轉(zhuǎn)基因植物染色體上外源基因的重要工具。Sauer等早在1987年將該系統(tǒng)應(yīng)用于釀酒酵母，首次證明了來自原核細(xì)胞的Cre重組酶在真核細(xì)胞中也會(huì)發(fā)生基因敲除。Luo等采用組織特異性啟動(dòng)子Bgp啟動(dòng)重組酶的表達(dá)，在植物體特定的器官(種子或者花粉)中達(dá)到對(duì)外源標(biāo)記基因的刪除。但是特異性的啟動(dòng)子只能控制重組酶基因在特定部位的表達(dá)，從而大大限制了 Cre/1xp系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。蛋白-蛋白之間的相互作用對(duì)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)等程序性的活動(dòng)扮演著重要的角色，一些技術(shù)被用來檢測(cè)活細(xì)胞當(dāng)中蛋白-蛋白之間的相互作用。Yukichi等將螢光素酶拆分為無活性的N端和C端，分別與組蛋白H2A和H2B融合，轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體后檢測(cè)到熒光素酶活性。Yang等在2003年將GUS報(bào)告基因拆分后轉(zhuǎn)化擬南芥，利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白互補(bǔ)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中恢復(fù)了 GUS基因的酶活。大量研究表明，將一個(gè)完整的蛋白拆分為沒有活性的兩部分，通過借助一對(duì)相關(guān)的蛋白輔助因子，在兩部分分別融合其中的一個(gè)輔助因子，進(jìn)而達(dá)到蛋白質(zhì)的重建和活性的恢復(fù)。本發(fā)明對(duì)Cre/loxp系統(tǒng)中的重要元件重組酶Cre進(jìn)行直接拆分，將其拆分為無活性的N端和C端，將這兩部分共同轉(zhuǎn)化煙草發(fā)根，實(shí)現(xiàn)當(dāng)這兩部分在同一個(gè)植物細(xì)胞當(dāng)中時(shí)，恢復(fù)了重組酶的活性而發(fā)生基因刪除，反之將任何一部分單獨(dú)轉(zhuǎn)化，該系統(tǒng)均不具有刪除活性。采用該技術(shù)對(duì)Cre/loxp系統(tǒng)進(jìn)行改造之后，不僅可以獲得沒有活性的Cre/loxp系統(tǒng)，同時(shí)又可以根據(jù)需要使其在轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中恢復(fù)活性，增加了 Cre/loxp系統(tǒng)的可控性和應(yīng)用范圍。本發(fā)明在植物當(dāng)中的應(yīng)用從未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種改造重組酶Cre的方法，并將其應(yīng)用于植物當(dāng)中。本發(fā)明中，所述的方法是利用蛋白拆分技術(shù)將重組蛋白Cre在第59和60個(gè)氨基酸之間直接拆分為無活性的N端(NCre)和C端(CCre)兩部分，對(duì)拆分蛋白進(jìn)行重組活性檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將NCre和CCre構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMAL_C2X上，誘導(dǎo)表達(dá)純化之后，體外檢測(cè)拆分蛋白的活性。本發(fā)明中，將含有一對(duì)同向識(shí)別位點(diǎn)1xp的融合基因loxP-nos-loxP構(gòu)建于PCAMBIA1305.1上得到中間載體pCA-LoxP，以此載體為骨架將不同的拆分蛋白構(gòu)建上去，得到本發(fā)明的含有Cre/loxp系統(tǒng)的所有的植物表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，將所有的植物表達(dá)載體通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化煙草，獲得煙草轉(zhuǎn)基因毛狀根，通過GUS組織染色和PCR分子檢測(cè)改造的Cre/loxp系統(tǒng)的重組活性。在本發(fā)明中，體外蛋白實(shí)驗(yàn)證明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的時(shí)候具有完整的Cre蛋白的活性。本發(fā)明中，將拆分蛋白NCre和CCre分別構(gòu)建的Cre/loxp系統(tǒng)轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)當(dāng)N端和C端(即NCre和CCre)在同一個(gè)植物細(xì)胞時(shí)恢復(fù)重組活性而發(fā)生刪除，反之則不能。這點(diǎn)與體外蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一致。


圖1:重組酶Cre拆分為N端(NCre)和C端(CCre)的模型以及各部分融合NLS。圖2:重組蛋白Cre以及拆分蛋白NCre、CCre的體外誘導(dǎo)表達(dá)、純化以及活性檢測(cè)結(jié)果。其中A:拆分蛋白NCre、CCre在含有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽MBP的表達(dá)載體PMAL-C2X上的表達(dá)及純化和完整的重組蛋白Cre在pET_28a載體上的表達(dá)及純化(其中1，2，7分別為拆分蛋白NCre的誘導(dǎo)，未誘導(dǎo)，純化；3，4，8分別為拆分蛋白CCre的誘導(dǎo)，未誘導(dǎo)，純化；5，6，9為麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽MBP的誘導(dǎo)，未誘導(dǎo)，純化；10，11，12分別為完整的重組蛋白Cre的誘導(dǎo)，未誘導(dǎo)，純化);B:純化蛋白的體外活性檢測(cè)，以含有識(shí)別位點(diǎn)1xp的載體pLoxp_ccre629作為反應(yīng)底物,Control:質(zhì)粒對(duì)照；H+B:Hind III和EcoR I酶切；N:NCre酶切；C:CCre酶切；N+C:NCre和CCre酶切；Cre:Cre蛋白酶切；MBP:MBP蛋白酶切對(duì)照。圖3:轉(zhuǎn)基因毛狀根的⑶S組織染色。其中a為轉(zhuǎn)pCA-LoxP株系；b為轉(zhuǎn)pCA-NCre株系；c為轉(zhuǎn)pCA-nNCre株系；d為轉(zhuǎn)pCA-CCre 株系；e 為轉(zhuǎn) pCA-nCCre 株系；f 為轉(zhuǎn) pCAMBIA1305.1 株系；g 為轉(zhuǎn) pCA-Cre 株系；h 為轉(zhuǎn) pCA-nCre 株系；i 為轉(zhuǎn) pCA_CCre_nNCre 株系；j 為轉(zhuǎn) pCA-nCCre_nNCre 株系。圖4:刪除效率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖5:轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR分子檢測(cè)。其中A:以轉(zhuǎn)基因株系 pCAMBIA1305.1、pCA-LoxP、pCA-Cre、pCA-nCre、pCA-CCre-nNCre、pCA-nCCre-nNCre煙草毛狀根基因組DNA為模板，用測(cè)序引物pCA_F和PCA-R進(jìn)行刪除前后的PCR檢測(cè)；N:陰性(刪除前)；P:陽性(刪除后)；B:以轉(zhuǎn)pCA-NCre、pCA-nNCre、pCA-CCre、pCA-nCCre的不同株系的毛狀根基因組DNA為模板，用測(cè)序引物pCA-F和pCA-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖6:測(cè)序分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的試驗(yàn)材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。實(shí)施例1重組酶Cre的拆分根據(jù)Johannes Hirrlinger等人的研究,將完整的重組酶Cre從第59和60個(gè)氨基酸之間進(jìn)行拆分，分別命名為NCre和CCre，同時(shí)在各個(gè)拆分片段之前融合核定位信號(hào)NLS(圖1)。實(shí)施例2拆分蛋白NCre、CCre以及完整重組蛋白Cre的體外誘導(dǎo)表達(dá)、純化和活性檢測(cè)原核表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)擴(kuò)增NCre 的上游引物:5’ -CGGAATTCATGTCCAATTTACTGACCGTAC-3，,下劃線為EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)，下游引物:5’ -CCCAAGCTTCTAATTCAACTTGCACCATGCC-3’,下劃線為 HindIII識(shí)別位點(diǎn)；擴(kuò)增CCre的上游引物:5 ’ -CGGAATTCATGAACCGGAAATGGTTTCCCG-3 ’，下劃線為EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)，下游引物:5’-CCCAAGCTTCTAATCGCCATCTTCCAGCA-3，，下劃線為 HindIII 識(shí)別位點(diǎn)，以pET-Cre (含有Cre基因)為模板，PCR擴(kuò)增NCre和CCre的體系50 μ 1:
權(quán)利要求
1.一種改造重組酶Cre的方法，其特征在于，其包括以下步驟: (1)將重組蛋白Cre在第59和60個(gè)氨基酸之間直接拆分為無活性的N端(NCre)和C端(CCre)兩部分，在各個(gè)拆分片段之前融合核定位信號(hào)NLS ； (2)將拆分蛋白NCre和CCre構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMAL_C2X上，誘導(dǎo)表達(dá)純化之后，體外檢測(cè)拆分蛋白的活性； (3)將含有一對(duì)同向識(shí)別位點(diǎn)1xp的融合基因loxP-nos-loxP構(gòu)建于pCAMBIA1305.1上得到中間載體pCA-LoxP，以此載體為骨架將拆分蛋白NCre和CCre構(gòu)建上去，得到含有Cre/loxp系統(tǒng)的植物表達(dá)載體； (4)將構(gòu)建的植物表達(dá)載體通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化模式植物煙草，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，通過⑶S組織染色和PCR分子檢測(cè)改造的Cre/loxp系統(tǒng)的重組活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，所述含有一對(duì)同向識(shí)別位點(diǎn)1xp的融合基因loxP-nos-loxP是這樣獲得的:采用人工合成融合片段loxP-nos-loxP,序列如下:5’ -CGGGATCCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTTCCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTT CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCCG-3>,下劃線分別為BamH 1、Bgl I1、BamH I識(shí)別位點(diǎn)，將其用BamH I從pES載體上切下后連接到Bgl II酶切的載體pCAMBIA1305.1上，獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pCA-LoxP，該載體中包括多克隆位點(diǎn)和⑶S報(bào)告基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，含Cre/loxp系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下:用Bgl II酶切載體pCA-LoxP，將用BamH I /BglII雙酶切后膠回收的片段NCre和nNCre分別連接到載體上，獲得載體pCA_NCre和pCA_nNCre ;再將融合片段35S-CCre-nos和35SNLS_CCrenos用EcoR I和Hind III從載體pCXSN上切下后連接到pCA-nNCre的多克隆位點(diǎn)，從而獲得載體pCA-CCre-nNCre和pCA-nCCre_nNCre ;同時(shí)融合片段 35S-CCrenos 和 35S-NLS-CCre_nos 用 EcoR I and Hind III從載體 pCXSN 上切下后連接到pCA-LoxP上得到載體pCA-CCre和pCA-nCCre。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，體外蛋白實(shí)驗(yàn)證明拆分蛋白的NCre和CCre混合在一起的時(shí)候具有完整的Cre蛋白的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，將拆分蛋白NCre和CCre分別構(gòu)建的Cre/loxp系統(tǒng)轉(zhuǎn)化模式植物煙草后發(fā)現(xiàn)當(dāng)N端和C端(即NCre和CCre)在同一個(gè)植物細(xì)胞時(shí)恢復(fù)重組活性而發(fā)生刪除，反之則不能。
6.如權(quán)利要求1、2或3中所述的改造重組酶Cre的方法，其特征在于，將核定位信號(hào)NLS與拆分蛋白融合后的Cre/loxp系統(tǒng)的刪除效率明顯提高。
7.權(quán)利要求1-6之一所述的改造后的重組酶Cre在植物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種改造重組酶Cre的方法及其在植物中的應(yīng)用，它涉及將重組蛋白Cre拆分為無活性的N端(NCre)和C端(CCre)兩部分，并且對(duì)拆分蛋白進(jìn)行體外原核表達(dá)和活性檢測(cè)，同時(shí)分別構(gòu)建新的Cre/loxp系統(tǒng)，將其應(yīng)用于植物當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)了當(dāng)N端和C端在同一個(gè)植物細(xì)胞時(shí)恢復(fù)重組活性而發(fā)生刪除，反之則不能。本發(fā)明還包括核定位信號(hào)NLS對(duì)該系統(tǒng)的影響以及所有的植物表達(dá)載體和體外原核表達(dá)載體。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146818SQ201310052609
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月18日
發(fā)明者高淵, 羅克明, 文夢(mèng)玲, 汪麗君, 李超鋒 申請(qǐng)人:西南大學(xué)