專利名稱：一種合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域的基因的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代畜牧業(yè)飼用動物在具有高產(chǎn)性能的同時，對環(huán)境應(yīng)激和病原愈加敏感。特別是在集約化飼養(yǎng)條件下，飼用動物面臨更多的應(yīng)激和病原的侵襲。畜牧生產(chǎn)中迫切需要一種高效、無毒害、無殘留的免疫促進(jìn)劑和生長促進(jìn)劑，在提高飼用動物抗病力的同時，又能提高飼用動物的生產(chǎn)性能及動物產(chǎn)品的安全，以促進(jìn)畜牧業(yè)的健康發(fā)展，降低畜牧生產(chǎn)對人類健康及生態(tài)環(huán)境的破壞。前人研究發(fā)現(xiàn)，防御素具有廣譜殺菌活性以及超強(qiáng)的抗微生物作用，且作用機(jī)理特殊，微生物不易產(chǎn)生抗性，對腫瘤細(xì)胞還有細(xì)胞毒性作用，同時也可以作為免疫增強(qiáng)劑用于調(diào)節(jié)動物機(jī)體免疫系統(tǒng)，給人們展現(xiàn)了一條開發(fā)理想促生長及免疫促進(jìn)的新途徑。由于動物體天然防御素含量低，直接提取遠(yuǎn)不能滿足需要，且成本高、得率低、工序繁；化學(xué)合成可行但成本太高，應(yīng)用受到局限；隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)防御素多肽，以滿足研究和生產(chǎn)的需要成為可能。目前，防御素的基因工程已是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。基于防御素的重要生理功能及其在生產(chǎn)實(shí)際中具有非常好的應(yīng)用前景，我們進(jìn)行了一種重組鴨β -防御素-2蛋白體外重組表達(dá)生產(chǎn)方法的發(fā)明研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高的合成的重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法。本發(fā)明重組鴨防御素-2基因是這樣實(shí)現(xiàn)的，依次包括鴨防御素-2(AvBD2)基因核苷酸序列設(shè)計與體外合成、重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的構(gòu)建過程、含鴨β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子的篩選過程、含鴨β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)過程，
本發(fā)明的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設(shè)計與體外合成過程是這樣實(shí)現(xiàn)
的，
參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時根據(jù)酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進(jìn)行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行基因合成)，改造后合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下:
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT
GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTM。本發(fā)明的含有重組鴨β -防御素-2基因的重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2是這樣實(shí)現(xiàn)的，
重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的構(gòu)建過程依次是:
1、鴨β_防御素_2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的設(shè)置過程:根據(jù)合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列經(jīng)多重比較后設(shè)計而成，上游引物設(shè)計在該基因起始端，同時根據(jù)表達(dá)載體pPICZ a -A上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計時添加了通ο I酶切位點(diǎn)及Kex2與Stel3蛋白酶裂解位點(diǎn)，在ZAo I酶切位點(diǎn)前加有3個保護(hù)性堿基TCT ;下游引物設(shè)計在基因末端，并加上Not I酶切位點(diǎn)，在Afoi I酶切位點(diǎn)位點(diǎn)前加有4個保護(hù)性堿基GCTG，所設(shè)置的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分別為，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因上游引物:
5’ -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3> Xho I 酶切位點(diǎn)， 鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因下游引物:
5’ -GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3，Not I 酶切位點(diǎn)，
2、鴨防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR擴(kuò)增過程:以合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因?yàn)槟０?，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為:10XPCR Buffer(包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris (三羥甲基氨基甲烷)*HC1，0.001% 明膠)5 μ L, 4X dNTPs (包含 dATP(三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸)各2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各lyL，模板為合成的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應(yīng)過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應(yīng)過程進(jìn)行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物，鴨β -防御素_2(AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約130bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。3、重組質(zhì)粒pPICZ a -A_AvBD2的構(gòu)建:將過程2的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有IOmmoI/L Tris *HCl,lmmol/L EDTA(乙二胺四乙酸))溶解，TE 溶解物用ZoAIjoi I 進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ a-A質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約3.6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素_2(AvBD2)基因片段和3 μ L雙酶切后膠回收 的pPICZ a-A質(zhì)粒，加入IyL的10ΧΤ4 DNA連接Buffer(10XT4 DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)，5mmol/L DATP,0.25mg/mL BSA (牛血清白蛋白))，I μ L Τ4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2的構(gòu)建。培養(yǎng)板上長出來的白色菌落即為含有重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的陽性菌。pPICZ a -A質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品。不呢發(fā)明的重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，
1、重組質(zhì)粒的制備和線性化:挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)24 h。將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細(xì)菌。然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。用Sac I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2線性化。2、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備:接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD(含lwt%酵母抽提物，2Iwt %蛋白胨，21wt %葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0.1 0.5mL過夜培養(yǎng)菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達(dá)到1.2
1.3。4°C 3 000r/m離心5min,棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/L山梨糖醇重懸菌體洗漆，4°C 3 000r/m離心5min,離心3次；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。3、畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化:取80 μ L準(zhǔn)備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5 10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因?qū)雰x進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω。電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育I 2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子。4、畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定:抽提含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為:10 XPCR Buffer (包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl,10mmol/L Tris.HC1，0.001wt% 明膠)5μ L，4XdNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨AvBD2上、下游引物各I μ L，模板為抽提轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應(yīng)過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應(yīng)過程進(jìn)行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5被％瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，即表明所抽提的酵母為陽性酵母轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明重組鴨β -防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，
1、陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá):挑取經(jīng)鑒定的陽性酵母轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30。。、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (lwt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，Iwt %甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體0D600nm達(dá)到2 6時離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(I wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0), 1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，在誘導(dǎo)過程中，每間隔24h加入100 wt%甲醇使其終濃度為0.5%，培養(yǎng)至72h收集樣品，離心,取上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導(dǎo)的對照組相比，有一條大小為4.32kD非常明顯的蛋白表達(dá)條帶。經(jīng)超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經(jīng)得到表達(dá)即重組鴨β -防御素-2基因蛋白已經(jīng)生產(chǎn)出來。 將含鴨β -防御素_2(AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子體外誘導(dǎo)表達(dá)過程所生產(chǎn)的發(fā)酵液直接用于體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明重組鴨β_防御素-2 (AvBD2)蛋白具有抗大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌能力。體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組鴨β-防御素_2(AvBD2)蛋白有較好的體內(nèi)防治大腸桿菌與沙門氏菌作用效果。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，是對重組鴨AvBD2蛋白進(jìn)行體外表達(dá)生產(chǎn)研究，采用了酵母密碼子優(yōu)化方法對鴨AvBD2基因核苷酸進(jìn)行優(yōu)化，有利于鴨AvBD2在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)生產(chǎn)，能提高表達(dá)量。另外就是，酵母屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出來的重組蛋白更接近于天然蛋白，有利于重組蛋白活性的保持。從活性檢測也可以看出表達(dá)的重組蛋白呈現(xiàn)出鴨AvBD2蛋白所具有的抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高。
具體實(shí)施方式
:
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
本發(fā)明的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列設(shè)計與體外合成過程是這樣實(shí)現(xiàn)
的，
參照GenBank中注冊的鴨AvBD2基因cDNA基因序列，同時根據(jù)酵母密碼子偏好性對鴨AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列進(jìn)行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行基因合成)，改造后合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下:
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCT
GTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTM。本發(fā)明的含有該基因的重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2是這樣實(shí)現(xiàn)的，
重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的構(gòu)建過程依次是:
1、鴨β_防御素_2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的設(shè)置過程:根據(jù)合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列經(jīng)多重比較后設(shè)計而成，上游引物設(shè)計在該基因起始端，同時根據(jù)表達(dá)載體pPICZ a -A上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計時添加了通ο I酶切位點(diǎn)及Kex2與Stel3蛋白酶裂解位點(diǎn)，在ZAo I酶切位點(diǎn)前加有3個保護(hù)性堿基TCT ;下游引物設(shè)計在基因末端，并加上Not I酶切位點(diǎn)，在Afoi I酶切位點(diǎn)位點(diǎn)前加有4個保護(hù)性堿基GCTG，所設(shè)置的鴨β_防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分別為，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因上游引物:
5’ -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3> Xho I 酶切位點(diǎn)，
鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因下游引物:
5’ -GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3，Not I 酶切位點(diǎn)，
2、鴨防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR擴(kuò)增過程:以合成的鴨β-防御素_2(AvBD2)基因?yàn)槟０澹尤隕xTaq DNA聚合酶、鴨β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系為:10XPCR Buffer(包含0.5mmol/L MgC12, 50mmol/LKC1，lOmmol/L Tris.Η(:1，0.001% 明膠)5μ L，4XdNTPs(包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5mmol/L)4y L，濃度均為20 μ mol/L的鴨β -防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各I μ L，模板為合成的鴨防御素-2 (AvBD2)基因lyL，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應(yīng)過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應(yīng)過程進(jìn)行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;即獲得鴨β-防御素-2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物，鴨β -防御素-2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見大小約130bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。3、重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2的構(gòu)建:將過程2的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR產(chǎn)物用氛氯仿抽提純化，加入乙醇獲得沉淀物，將沉淀物干燥后用TE (TE包含有IOmmoI/L Tris.HCl，lmmol/L EDTA)溶解，TE溶解物用XohUot I進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約130bp的條帶；以同樣的方法對pPICZ a -A質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約
3.6kb的DNA片段，分別取5 μ L雙酶切后膠回收的鴨β -防御素_2 (AvBD2)基因片段和3yL雙酶切后膠回收的pPICZa-A質(zhì)粒，加入IyL的10XT4 DNA連接Buffer (IOX T4DNA 連接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT,5mmol/L DATP，0.25mg/mL BSA), I μ L T4 DNA連接酶，在16°C下連接處理18小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過夜，即完成重組質(zhì)?？冢?02(1^"02的構(gòu)建。培養(yǎng)板上長出來的白色菌落即為含有重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的陽性菌。pPICZ a -A質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品。用于生產(chǎn)重組鴨β -防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子是這樣實(shí)現(xiàn)的，
1、重組質(zhì)粒的制備和線性化:挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)24 h。將菌液于4°C，5 OOOrpm離心10 min，沉淀細(xì)菌。然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。用Sac I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2線性化。2、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備:接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD(含lwt%酵母抽提物，2Iwt %蛋白胨，21wt %葡萄糖)培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)。然后接種0.1 0.5mL過夜培養(yǎng) 菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達(dá)到1.2
1.3。4°C 3 000r/m離心5min,棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/L山梨糖醇重懸菌體洗漆，4°C 3 000r/m離心5min,離心3次；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。3、畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化:取80 μ L準(zhǔn)備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5 10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因?qū)雰x進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω。電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育I 2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200 μ g/mL Zeocin YPDS (1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IM山梨糖醇，20g瓊脂粉)平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子。4、畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定:抽提含鴨β -防御素-2 (AvBD2)的酵母重組轉(zhuǎn)化子，以其為模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鴨β -防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為:10 XPCR Buffer (包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl,10mmol/L Tris.HC1，0.001wt% 明膠)5μ L，4XdNTPs (包含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5mmol/L) 4 μ L，濃度均為20 μ mol/L的鴨AvBD2上、下游引物各I μ L，模板為抽提轉(zhuǎn)化的酵母基因組DNA I μ L，ddH20 (雙蒸水)37.5 μ L，濃度為5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反應(yīng)過程依次為:a、94°C處理3min ;b、依次94°C處理30s、56°C處理30s、72°C處理30s ;反應(yīng)過程進(jìn)行30個循環(huán)；c、72°C延伸IOmin ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5被％瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約130bp的擴(kuò)增條帶，即表明所抽提的酵母為陽性酵母轉(zhuǎn)化子。
重組鴨β -防御素-2蛋白的生產(chǎn)方法，
1、陽性酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá):挑取經(jīng)鑒定的陽性酵母轉(zhuǎn)化子接種于3 mL YPD液體中，30。。、250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；再接種于50 mL BMGY (lwt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，Iwt %甘油)體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24 h，至菌體0D600nm達(dá)到2 6時離心棄去上清，加入25 mL BMMY液體培養(yǎng)基(I wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0), 1.34 wt %YNB (無酵母氮源)，4X 10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，在誘導(dǎo)過程中，每間隔24h加入100 wt%甲醇使其終濃度為0.5%，培養(yǎng)至72h收集樣品，離心,取上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體蛋白與未誘導(dǎo)的對照組相比，有一條大小為4.32kD非常明顯的蛋白表達(dá)條帶。經(jīng)超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，與目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已經(jīng)得到表達(dá)即重組鴨β -防御素-2基因蛋白已經(jīng)生產(chǎn)出來。本發(fā)明所使用的限制性內(nèi)切酶Xho 1、Not 1、Sac 1、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶等均購自廣州寶泰克生物科技有限公司。菌株X-33、Zeocin抗生素、pPICZ a-A質(zhì)粒為Invitrogen公司的產(chǎn)品。體外抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)重組鴨AvBD2蛋白具有抗大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌能力，對大腸桿菌44103、豬霍亂沙門氏菌(ATCC13312)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、分離株大腸桿菌和分離株豬霍亂沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為16.41,65.63,32.81,16.41,65.63和131.25 μ g/mL.以兩周齡的雛雞為對象，初步研究了重組鴨AvBD2蛋白防治雛雞細(xì)菌感染的效果。在治療實(shí)驗(yàn)中，對大腸桿菌攻毒的雛雞注射250 μ g重組鴨AvBD2蛋白治療效果最好，一周后雛雞存活率達(dá)到90% ；對沙門氏菌攻毒雛雞注射300 μ g重組鴨AvBD2蛋白治療效果最好，一周后雛雞存活率達(dá)到80% ;結(jié)果表明，重組鴨β -防御素-2蛋白有較好的體內(nèi)防治效果。
權(quán)利要求
1.一種合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法，其特征在于， (1)重組質(zhì)粒的制備和線性化:挑取轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒pPICZa -A-AvBD2的Top 10陽性菌接種于25 mL含25yg/mL Zeocin的低鹽液體LB培養(yǎng)基中，37°C，220 rpm振搖培養(yǎng)24h，將菌液于4°C,5 OOOrpm離心10 min,沉淀細(xì)菌,然后用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,用Sac I酶將抽提的重組質(zhì)粒pPICZ a _A_AvBD2線性化， (2)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備:接種畢赤酵母宿主菌X33單菌落至5mLYPD培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，YPD含lwt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖，然后接種0.1 0.5mL過夜培養(yǎng)菌液到500mL新鮮YPD培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)，使0D600nm達(dá)到1.2 1.3,4°C 3 000r/m離心5min,棄上清；依次以500mL、250mL冰浴滅菌水及20mL冰冷Imol/L山梨糖醇重懸菌體洗漆,4°C 3 000r/m離心5min,離心3次；最后將細(xì)胞重懸于ImL冰浴滅菌的lmol/L山梨糖醇，即為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞， (3)畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化:取80μ L準(zhǔn)備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，與5 10 μ g線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a -A-AvBD2混合，轉(zhuǎn)移到冰浴的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因?qū)雰x進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電脈沖參數(shù)為電壓1500V，電容量25 μ F，電阻200 Ω，電擊后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇到電轉(zhuǎn)化小杯中，將小杯內(nèi)懸液轉(zhuǎn)移到一個滅菌的15mL的試管中，將試管在30°C下孵育I 2小時，取10、25、50、100與200uL分別鋪到含有200μ g/mL Zeocin YPDS平板上以篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，30°C孵化平板2 3d至出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落即為含鴨防御素-2的酵母重組轉(zhuǎn)化子，Zeocin YPDS包含I wt %酵母抽提物、2 wt %蛋 白胨、2 wt %葡萄糖、IM山梨糖醇、20g瓊脂粉。
全文摘要
一種合成的重組鴨β-防御素-2蛋白的重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)方法，其特征在于(1)重組質(zhì)粒的制備和線性化；(2)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備；(3)畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pPICZα-A-AvBD2的構(gòu)建。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有抗菌促生長活性，適合于在畜牧生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用，而且生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N1/19GK103205452SQ201310056858
公開日2013年7月17日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者張輝華, 韓小鳳, 馬保華, 畢英佐, 馬靜云, 謝青梅, 李辰 申請人:佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院