專利名稱：一種鼻病毒實時熒光rt-pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，涉及一種鼻病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其應用。本發(fā)明的試劑盒中包含有篩選獲得的一對寡核苷酸引物和一條寡核苷酸探針，通過一步法實時熒光RT-PCR可檢測出的HRV的最低濃度為1.0X102COpieS/mL，這說明本試劑盒的靈敏度和特異性非常高。
背景技術(shù)：
鼻病毒(HRV)是引起人類病毒性呼吸道感染的最常見病原體，Pelon在1956年首先發(fā)現(xiàn)第I株HRV，至今已發(fā)現(xiàn)超過120個血清型，是人類血清型最多的病毒。研究結(jié)果顯示，成人約50%的感冒都是由鼻病毒感染引起的，而兒童感冒有10% 25%是由鼻病毒致病，其中還有許多病例發(fā)展為哮喘。RhV屬小RNA病毒科，直徑為27 30nm，呈二十面立體對稱結(jié)構(gòu)，分子量大約是8.5 X IO6道爾頓，病毒核心為單股線型RNA，長約7500個核苷酸，其中只有一個讀碼框，長約6500個核苷酸。讀碼框的開讀部位位于5'端611個核苷酸處，終止密碼位于聚A尾前42個核苷酸處。病毒核心外有蛋白衣殼，無包膜。殼體由4種結(jié)構(gòu)蛋白:VP1、VP2、VP3、VP4組成，組合成相同的60個殼粒，呈20面體圍繞著核心RNA。其中VPl是產(chǎn)生保護性抗體的主要抗原。HRV最適于在33°C 35°C生長與復制，HRV在4°C能保存數(shù)周，在_70°C可長期存活，對乙醚、乙醇的抵抗力較強。HRV的主要傳染源是患者及病毒攜帶者。主要經(jīng)過呼吸道傳播，可通過手到鼻或飛沫直接傳播。人對HRV普遍易感，感染后可獲得一定程度的免疫力，各種血清型之間可有部分交叉免疫力。HRV尤以4歲以前的年幼兒童多見，感染率隨年齡增長而下降。常用的檢測鼻病毒感染的方法主要有四種:`
(I)組織培養(yǎng)病毒分離:從鼻咽分泌物及咽拭子中分離病毒接種于原代人胚腎細胞、人胚肺成纖維細胞或猴腎細胞及HeLa細胞等，經(jīng)培養(yǎng)2 3d后用中和抗體做中和試驗和空斑形成試驗，進行特異的血清型鑒定。(2)血清學檢測:包括補體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗、間接免疫熒光及酶聯(lián)免疫試驗等，但由于缺乏合適的交叉反應抗原難以覆蓋眾多HRV血清型，使得這些方法的應用受到很大限制。(3)分子生物學檢測:近來RT-PCR的方法已廣泛用于HRV的檢測，其對HRV檢測較組織培養(yǎng)更敏感更快捷。(4)熒光定量PCR技術(shù)(FQ-PCR)是近年來發(fā)展起來的一種快速直接的核酸的檢測技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的實時核算定量檢測技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)是實時熒光定量PCR技術(shù)的一種也稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR，這是一種直接快速檢測RNA的方法，它與熒光定量PCR技術(shù)的不同之處是多加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時多加了一個逆轉(zhuǎn)錄反應的步驟。實時熒光定量PCR法最大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術(shù)在醫(yī)學臨床檢驗及臨床醫(yī)學研究方面有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本試劑盒檢測的基本原理是利用一對特異性的寡核苷酸引物和一條特異性寡聚核苷酸探針，在逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、高品質(zhì)的脫氧核糖核苷三磷酸CdNTPs)以及Mg2+等RT-PCR反應緩沖液，通過熒光PCR擴增儀實現(xiàn)靶核苷酸的擴增，從而實現(xiàn)分別快速、高效、特異、實時定量檢測鼻病毒寡核苷酸的目的。為了高效、特異、靈敏的檢測出鼻病毒，本發(fā)明在對GeneBank中所有的現(xiàn)有的鼻病毒基因序列進行生物信息學分析，找出了鼻病毒的特異性保守區(qū)，并對這個保守區(qū)域設(shè)計了多對引物、探針。通過對鼻病毒標準株的檢測，篩選出靈敏度高、特異性好、且針對鼻病毒的一對引物(用于擴增鼻病毒靶多核苷酸)和一條探針，即:能與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸正向引物HRV-F、能與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸反向引物HRV-R、能與祀多核苷酸特異性結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有突光報告集團和熒光猝滅集團的寡核苷酸探針HRV-P，其中熒光報告基團任選自FAM、TET、JOE、HEX、VIC ;熒光猝滅基團任選自:TAMRA、DABCYL, BHQ。其中:所述正向引物HRV-F 的序列為:5’-CTTTGAGTCCTCCGGCCC-3’ (SEQ ID NO:1);所述反向引物 HRV-R 的序列為:5’ -CCCGCAATTGCTCATTACGAC-3，(SEQ ID NO:2);所述寡核苷酸探針 HRV-P 的序列為:5’ -TGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGC-3’ (SEQ ID NO:3),優(yōu)選的，該寡核苷酸探針5’端連接有FAM (5’羧基熒光素)，3’端連接有TAMRA (N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基羅丹明)。所以本發(fā)明提供了一種用于檢測鼻病毒的寡核苷酸組合物，所述組合物包含I)-4)中任一個: I)寡核苷酸正向引物HRV-F ;2)寡核苷酸反向引物HRV-R ;3)寡核苷酸探針HRV-P ；4) I)-3)中一個或多個序列的組合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延長的序列；或與上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的堿基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。本發(fā)明還提供了上述寡核苷酸組合物在制備檢測鼻病毒的試劑中的應用，其中所述試劑為用于實時熒光RT-PCR的試劑。本發(fā)明的目的之一是提供一種鼻病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含I) 4)中任一個:1)能與鼻病毒雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸正向引物HRV-F ；2)能與鼻病毒雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸反向引物HRV-R ；3)能與鼻病毒靶多核苷酸特異性結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報告集團和熒光猝滅集團的寡核苷酸探針HRV-P ；4)1) 3)中一個或多個序列的組合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延長的序列；或與上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的堿基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。本發(fā)明的目的之一是提供一種鼻病毒的實時突光RT-PCR檢測試劑盒,該試劑盒包括:RNA提取試劑，RT-PCR擴增反應液，混合酶，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，鼻病毒陽性標準品等。其中，所述混合酶包含Taq DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶);所述RT-PCR擴增反應液包含有能與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸正向引物HRV-F、能與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸反向引物HRV-R、能與靶多核苷酸特異性結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報告集團和熒光猝滅集團的寡核苷酸探針HRV-P中任意一種或一種以上的組合，所述的RT-PCR擴增反應液還包含有dNTPs、PCR buffer和RNA酶抑制劑(RNas in)。其中:所述正向引物HRV-F 的序列為:5’-CTTTGAGTCCTCCGGCCC-3’ (SEQ ID NO:1);所述反向引物 HRV-R 的序列為:5’ -CCCGCAATTGCTCATTACGAC-3，(SEQ ID NO:2);所述寡核苷酸探針 HRV-P 的序列為:5’ -TGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGC-3’ (SEQ ID NO:3),優(yōu)選的，該寡核苷酸探針5’端連接有FAM (5’羧基熒光素)，3’端連接有TAMRA (N，N，N’，N’ -四甲基-6-羧基羅丹明)；或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延長的序列；或與上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的堿基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。本發(fā)明所提供的試劑盒還包含:(I)分別裝有RNA提取劑、RT-PCR擴增反應液、混合酶、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、鼻病毒陽性標準品的加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方法是:所述的試劑盒中，正向引物濃度為0.5-lumol/L、反向引物的濃度為0.5-lumol/L、寡核苷酸探針的濃度為0.25-0.5umol/L ；優(yōu)選為:正向引物濃度為lumol/L、反向引物的濃度為lumol/L、寡核苷酸探針的濃度為0.5umol/L。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方法是:所述的試劑盒中，Taq DNA聚合酶的濃度為1-8U/反應，逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為50-400U/反應；優(yōu)選為:Taq DNA聚合酶的濃度為5U/反應，逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為100U/反應。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于RT-PCR擴增反應液中Mg2+最佳濃度為2.0mmoI/L, RNA酶抑制劑(RNasin)最佳用量為5-40U/反應，優(yōu)選20U/反應，高品質(zhì)的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳濃度為0.1-0.25mmol/L,優(yōu)選為0.2mmol/L。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方法是:所述的試劑盒的RT-PCR擴增的反應條件為:370C 60min，94°C 5min ;PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 10s,60°C 30s, 72°C ls，共 30 個循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方法是:使用所述的試劑盒時，檢測樣本選自鼻部樣品、口腔樣品、含鼻部或口腔樣品的抽提液或培養(yǎng)上清液。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中陰性質(zhì)控品為生理鹽水。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中陽性質(zhì)控品為HRV體外轉(zhuǎn)錄RNA。其中，建立HRV體外轉(zhuǎn)錄RNA的技術(shù)路線如下:使用HRV特異性正、反向引物定性擴增病毒核酸，擴增產(chǎn)物純化后克隆入PGEM-T載體中，陽性克隆經(jīng)測序確定目的片段是否正確插入并確定插入方向。提取重組質(zhì)粒PGEM-T-HRV質(zhì)粒進行酶切反應，割膠回收后得到其模板，用于體外轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄后消化DNA模板，進行RNA純化，得到HRV-RNA。其中陽性質(zhì)控品的濃度為 103copies/ml。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明試劑盒中定量參考品為104-107copies/mlHRV體外轉(zhuǎn)錄RNA。其中體外轉(zhuǎn)錄步驟同上，體外轉(zhuǎn)錄后的RNA用紫外分光光度計測定A260進行定量，根據(jù)定量結(jié)果，用DEPC處理水將體外轉(zhuǎn)錄的HRV RNA分別稀釋至104-107copies/ml作為本試劑盒中定量參考品。所有定量參考品與標本中提取的RNA同時進行擴增，熒光定量PCR儀會根據(jù)定量參考品繪制出標準曲線，并依此對檢測標本中鼻病毒的感染量進行自動測定。本發(fā)明所提供的檢測樣品中鼻病毒的試劑盒可以檢測出的HRV的最低濃度為1.0X102COpieS/mL，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。本發(fā)明所提供的檢測樣品中鼻病毒的試劑盒是針對鼻病毒基因組保守基因片段設(shè)計特異引物和探針，可檢測出鼻病毒，但不能檢測出非鼻病毒病原體，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等，說明本試劑盒具有很好的特異性。本發(fā)明所提供的檢測樣品中鼻病毒的試劑盒可以檢測痰液、鼻咽拭子等樣本中的鼻病毒；可為靈敏、快速、特異早期診斷鼻病毒感染提供可靠的實驗證據(jù)，并且能夠準確定量，所以可對療效進行有效檢測。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:(1)同時檢測待檢測樣本中鼻病毒感染量，可真實的反映出患者體內(nèi)病原體類型、拷貝數(shù)的高低和復制情況，有助于判斷疾病，選擇治療方案及監(jiān)測治療效果；(2)與ELISA技術(shù)相比，具有更高的靈敏性，適用于痰液、鼻咽拭子等多種樣本的檢測；(3)針對病毒特異性保守序列設(shè)計引物和探針，具有更高的特異性，避免了與其他如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等呼吸道感染病毒的交叉反應；
(4)將PCR的敏感性與探針雜交的特異性相結(jié)合，在很大程度上改變了普通PCR的缺陷，降低了反應時間，簡化了操作步驟；(5)閉管檢測不需要PCR后處理，避免了由于樣本間的交叉污染引起的假陽性和環(huán)境污染；實時的檢測技術(shù)可以連續(xù)的檢測PCR反應中熒光信號的變化，避免了普通PCR的“平臺期效應”，而且模板的定量不通過終產(chǎn)物，而是有Ct值計算，準確性和靈敏性均有很大的提聞。


圖1是HRV病毒標準品擴增曲線；圖2是HRV病毒標準品濃度標準曲線；圖3是4例HRV陽性標本擴增曲線。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次或以上重復實驗，結(jié)果取平均值。實施例1:鼻病毒 一步法實時熒光定量RT-PCR試劑的研制1、引物和探針的設(shè)計:通過對Genebank數(shù)據(jù)庫中已有的鼻病毒核酸序列利用DNAman軟件進行序列比對分析，以鼻病毒基因組0RF1-0RF2連接區(qū)的保守片段為擴增靶位點，根據(jù)引物探針設(shè)計的基本原則，利用軟件人工設(shè)計多對引物和探針。2、樣本的選擇:根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)的文獻報道表明，可以選擇來自鼻部樣品、口腔樣品、含鼻部或口腔樣品的抽提液或培養(yǎng)上清液，如痰液、鼻咽拭子等樣品。3、反應體系的建立與優(yōu)化樣本的準備:以病毒鑒定為鼻病毒陽性的10份樣品作為HRV陽性參考品，分別為HRV-1、HRV-2、HRV-3、HRV-4、HRV-5、HRV-6、HRV-7、HRV-8、HRV-9、HRV-10 ；以病毒鑒定為陰性的10份非HRV樣本為陰性參考品，分別為3種病毒樣品(流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒)以及7份正常的痰液、鼻咽拭子樣品。分別提取上述陽性參考品和陰性參考品的RNA，待用。引物探針的篩選:用上述I中設(shè)計的多組引物和探針分別檢測上述的陽性參考品與陰性參考品的RNA，經(jīng)反復多次試驗，篩選出特異性好、靈敏度高和重復性好的最佳引物探針組合，如引物HRV-F、HRV-R及探針HRV-P的組合。引物探針濃度的優(yōu)化:在反應體系中其他反應組分不變的條件下，分別使用0.5umol/L至lumol/L的濃度梯度的引物和0.25umol/L至0.5umol/L的濃度梯度的探針進行PCR反應，經(jīng)反復多次重復試驗，最終確定最佳的引物濃度為lumol/L、探針濃度為0.5umol/L。Taq DNA聚合酶用量的優(yōu)化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應，進行RT-PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的Taq酶用量為5U/反應。RT酶用量的優(yōu)化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從50U (酶單位)至400U濃度梯度的酶 用量/反應，進行RT-PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的RT酶用量為100U/反應。RNasin用量的優(yōu)化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應，進行RT-PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的RNasin用量為20U/反應。dNTPs度的優(yōu)化:在反應體系中其他反應組分不變的情況下，分別使用從
0.lmmol/L至0.25mmol/L濃度梯度的dNTPs用量/反應，進行RT-PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為0.2mmol/Lo反應溫度、時間的優(yōu)化:根據(jù)酶的活性和寡核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為:37°C 60min,94°C 5min ；PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 10s,60°C 30s, 72°C Is 共 30 個循環(huán)。4、標本檢測:以痰液、鼻咽拭子等作為待檢標本，分別提取標本的RNA后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴增體系檢測，結(jié)果表明:本發(fā)明試劑盒可以靈敏的檢測出臨床標本中的諾如病毒(HRV)。實施例2:鼻病毒一步法熒光實時定量RT-PCR檢測試劑盒及其使用1、制備包括下列組分成分的試劑盒:RNA提取液、RT-PCR擴增反應液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、鼻病毒陽性標準品(定量參考品)、DEPC處理水。2、標本的采集、運輸及保存2.1適用標本類型:痰液、鼻咽拭子等。2.2標本采集與前處理(注意無菌操作)2.2.1痰液標本采集:以晨痰為佳，采集標本前應用清水、冷開水漱口或用牙刷(不用牙膏)清潔口腔和牙齒，有假牙者應取下假牙(為減少口腔正常菌群污染標本)，用力咳出呼吸道深部的痰(非后鼻部分泌物、非唾液)，痰液直接吐入無菌痰杯中，標本量應> Iml0對于痰量少或無痰或咳痰困難者可用霧化吸入加溫至45°C的10% NaCl水溶液(痰液粘稠難咳，阻塞氣道的，需要用α -糜蛋白酶鹽水溶液)，使痰液易于排出后咳痰。2.2.2鼻咽拭子標本采集:咽拭子:將咽拭子在采樣液中充分浸潤，向上提起離開液面，在管壁上反復擠壓幾下；讓病人頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，手持拭子在病人兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次；將拭子頭浸入采樣液中，把拭子頭部與管壁接觸幾下，使標本盡量多的保存在采樣液中，棄去拭子手捏尾部部分。鼻拭子:將咽拭子在采樣液中充分浸潤，向上提起離開液面，在管壁上反復擠壓幾下；讓病人頭部自然放松，將拭子貼鼻孔壁慢慢轉(zhuǎn)動進入病人一鼻孔內(nèi)，至鼻腭處，然后邊擦拭邊旋轉(zhuǎn)慢慢取出。以同一拭子，用同樣的方法擦拭另一鼻孔；將鼻拭子放入已收集咽拭子的采樣管中，方法同步驟上。這樣，一支采樣管中就有一支咽拭子、一支鼻拭子，即所謂的鼻咽拭子管。2.3標本運輸與保存:采集或處理的樣本在4°C條件下保存應不超過48h ;若需長期保存，須放置_80°C低溫冰箱，但應避免反復凍融(最多凍融3次)。采集的樣本密封后，采用保溫箱加冰密封，并盡快運送到實驗室。3、檢測步驟( I) RNA 提取A.取N個(N=I管陰性質(zhì)控品+待測樣本數(shù))滅菌的1.5ml離心管，并作好標記。B.每個離心管加入600ulTrizol試劑，然后分別加入200ul待測樣品上清液或陰性質(zhì)控品，充分震蕩混勻15s，室溫靜置3 5min ；C.每個離心管加入200ul氯仿,上下震蕩混勻10s, 12, OOOrpm離心5min ；D.小心吸取無色上層液體，轉(zhuǎn)移至新滅菌的1.5ml離心管，然后加入IOuIRNA提取液，充分吸打混勻，8，OOOrpm離心I分鐘，然后小心棄去所有液體；E.加入溶液C (確認已經(jīng)加入無水乙醇)800ul，充分吸打混勻，8，000rpm離心Imin,盡可能將液體去除干凈；F.將離心管的蓋子打開并放入通風櫥中風干15min，也可使用加熱器于60°C干燥5min，(主要去除無水乙醇)，然后加入30U1DEPC處理水，吸打混勻管中沉淀，得到液體，可直接用于檢測，也可存于-80°C備用。(2) RT-PCR反應與結(jié)果分 析、判定分別取陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、定量參考品、待測標本各3ul，加入PCR反應管中進行RT-PCR擴增反應。RT-PCR擴增反應的條件為:37°C逆轉(zhuǎn)錄60min ；94°C 5min ；PCR反應條件為 94°C 5min ;94°C 10s,60°C 30s,72°C Is 共 30 個循環(huán)。結(jié)果分析:據(jù)定量參考品的擴增曲線設(shè)置Baseline的Start值、Stop值以及Threshold的Value值，使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數(shù)值介于-1.0 -0.97。最后在Analysis菜單中選擇Analyze自動分析結(jié)果。
結(jié)果判定:陽性樣本擴增曲線呈S型，所有陰性樣本無擴增曲線出現(xiàn)，待測標本的HRV檢測結(jié)果有效，否則，結(jié)果為無效，需要重新檢測，并根據(jù)標準品進行陽性樣本定量檢測,結(jié)果如圖1-2。實施例3:鼻病毒一步法熒光實時定量RT-PCR檢測試劑盒臨床檢測使用用上述方法對另外疑似鼻病毒感染病人痰液標本18份進行檢測，其中HRV檢測結(jié)果陽性4例，病毒熒光定量PCR擴增曲線見圖3，根據(jù)這4例陽性結(jié)果的Ct值結(jié)合擴增曲線，由Roche LightCycler480分析軟件自動分析得到這4例HRV陽性標本的病毒濃度，具體結(jié)果見表I。表14例HRV陽性標本病毒濃度
權(quán)利要求
1.一種鼻病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:RNA提取試劑，RT-PCR擴增反應液，混合酶，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，鼻病毒陽性標準品。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述混合酶包含TaqDNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中，所述的RT-PCR擴增反應液包含有能與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸正向引物HRV-F、能與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈特異性結(jié)合的寡核苷酸反向引物HRV-R、能與靶多核苷酸特異性結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報告集團和熒光猝滅集團的寡核苷酸探針HRV-P中任意一種或一種以上的組八口 ο
4.權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中: 所述正向引物 HRV-F 的序列為:5’ -CTTTGAGTCCTCCGGCCC-3’ ； 所述反向引物 HRV-R 的序列為:5’ -CCCGCAATTGCTCATTACGAC-3’ ； 所述寡核苷酸探針 HRV-P 的序列為:5’ -TGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGC-3’ ； 或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延長的序列；或與上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的堿基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組口 ο
5.權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒，其中，所述的RT-PCR擴增反應液還包含有dNTPs、PCR buffer和RNA酶抑制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的試劑盒，其中，正向引物濃度為0.5-lumol/L、反向引物的濃度為0.5-lumol/L、寡核苷酸探針的濃度為0.25-0.5umol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的試劑盒，其中，正向引物濃度為lumol/L、反向引物的濃度為lumol/L、寡核苷酸探針的濃度為0.5umol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一所述的試劑盒，其中，TaqDNA聚合酶的濃度為1_8U/反應，逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為50-400U/反應。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8任一所述的試劑盒，其中，TaqDNA聚合酶的濃度為5U/反應，逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為IOOU/反應。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9任一所述的試劑盒，其中，RT-PCR擴增反應液中的RNA酶抑制劑的濃度為5-40U/反應，dNTPs的濃度為0.1-0.25mmol/L/反應。
11.根據(jù)權(quán)利要求5-10任一所述的試劑盒，其中，RT-PCR擴增反應液中的RNA酶抑制劑的濃度為20U/反應，dNTPs的濃度為0.2mmol/L/反應。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一所述的試劑盒，其中，RT-PCR擴增的反應條件為:370C 60min，94°C 5min ;PCR 反應條件為 94°C 5min ；94°C 10s,60°C 30s，72°C ls，共 30 個循環(huán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一所述的試劑盒，其特征還在于:檢測樣本選自鼻部樣品、口腔樣品、含鼻部或口腔樣品的抽提液或培養(yǎng)上清液。
14.一種用于檢測鼻病毒的寡核苷酸組合物，所述組合物包含1)-4)中任一個: 1)寡核苷酸正向引物HRV-F，其序列為:5’-CTTTGAGTCCTCCGGCCC-3’ ； 2)寡核苷酸反向引物HRV-R，其序列為:5’ -CCCGCAATTGCTCATTACGAC-3’ ； 3)寡核苷酸探針HRV-P，其序列為:5’ -TGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGC-3’ ； 4)I)-3)中一個或多個序列的組合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延長的序列；或與上述序列同源性大于85%的序列；或上述序列的堿基互補序列；或使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
15.權(quán)利要求14所述的寡核苷酸組合物在制備檢測鼻病毒的試劑中的應用。
16.權(quán)利要求 15所述的應用，其中所述試劑為用于實時熒光RT-PCR的試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，涉及一種鼻病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其應用。本發(fā)明的試劑盒中包含有篩選獲得的一對寡核苷酸引物和一條寡核苷酸探針，通過一步法實時熒光RT-PCR可檢測出的HRV的最低濃度為1.0×102copies/mL，這說明本試劑盒的靈敏度和特異性非常高。通過本發(fā)明試劑盒實現(xiàn)了對痰液、鼻咽拭子等樣品中的鼻病毒的快速早期檢測和定量分析。本發(fā)明檢測周期短、效率高；檢測病毒特異性強，準確率高；病毒定性分析的同時還能定量分析；靈敏度比普通PCR和免疫學檢測方法高；操作簡單、易于推廣；實驗結(jié)果重復性好。
文檔編號C12Q1/68GK103114154SQ201310058249
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月25日
發(fā)明者石康, 王琳琳, 朱世新 申請人:湖北朗德醫(yī)療科技有限公司