專利名稱：一種降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法、所得微生態(tài)制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法，本發(fā)明還涉及使用該方法制得的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑，本發(fā)明還進一步涉及了該降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良中的用途。
背景技術(shù)：
隨著國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴大，集約化程度的不斷提高，超限量放養(yǎng)和集中投餌導(dǎo)致養(yǎng)殖水體產(chǎn)生大量殘餌、糞便和死亡的動植物尸體，這些有機物沉積于池底，在異養(yǎng)菌的作用下腐敗發(fā)酵，其中的蛋白質(zhì)和核酸慢慢被分解，產(chǎn)生大量含氮有害物質(zhì)，使養(yǎng)殖水體水質(zhì)迅速惡化，造成嚴(yán)重的自身污染，嚴(yán)重時使得整個養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境都遭到破壞。污染發(fā)生時，水體中銨氮、亞硝酸鹽等有毒有害物質(zhì)大量產(chǎn)生，尤其是高濃度的亞硝酸鹽使養(yǎng)殖對象血液輸送氧氣能力下降，促使血液中的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，失去和氧結(jié)合的能力，不僅直接危害養(yǎng)殖動物，同時由于它的長期蓄積中毒作用，導(dǎo)致魚、蝦等抗病力降低，易招致各種病原菌的侵襲，故被視為是魚、蝦的致病根源，由此帶來的病害使養(yǎng)殖戶蒙受了嚴(yán)重?fù)p失，水環(huán)境中亞硝酸鹽污染問題已成為困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸之一，極大的限制了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前市場上降解亞硝酸鹽的方法主要有物理、化學(xué)和生物方法，采用換水、吸附、投施氧化還原劑等物理化學(xué)方法來降解亞硝酸鹽，存在用量大、環(huán)保性差、降解率不高、維持時間短、易反彈等缺點，是治標(biāo)不治本的舉措。而采用投加微生態(tài)制劑的生物方法降解亞硝酸鹽具有操作簡單、無毒副作用、無殘留、效果顯著、成本低、不破壞生態(tài)平衡等多方面優(yōu)點，已成為養(yǎng)殖水體凈化技術(shù)的最新發(fā)展趨勢。芽孢桿菌、光合細(xì)菌、乳酸菌等微生態(tài)制劑在降解亞硝酸鹽方面的突出效果不斷有研究報道，其中枯草芽孢桿菌以其繁殖能力強、耐儲存的優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注。

現(xiàn)有微生態(tài)制劑產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)工藝主要有液態(tài)發(fā)酵工藝和固態(tài)發(fā)酵工藝，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品普遍存在有效活菌數(shù)和芽孢率低的問題，導(dǎo)致在后續(xù)生產(chǎn)處理過程中菌體損失嚴(yán)重；固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)過程中工藝參數(shù)難監(jiān)測和控制，雜菌率高。此外，微生態(tài)制劑投入養(yǎng)殖水體后菌體呈游離狀態(tài)，對水中不良環(huán)境的耐受力低，難以抵御池塘中土著菌的競爭拮抗及水生生物的捕食，而固定化技術(shù)可以對微生態(tài)制劑中的功能菌起到有效保護，但現(xiàn)有固定化包埋技術(shù)操作繁瑣，難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。固定化吸附技術(shù)操作簡單，載體成本低廉，目前的主要處理方式是在發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液濃縮再投入固定化載體吸附，菌體與載體間結(jié)合力弱，入水后菌體很容易析脫出來，達不到有效固定化的目的。盡管微生態(tài)制劑在降解水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的應(yīng)用具有許多優(yōu)點，但由于存在上述多方面缺陷，發(fā)展至今，在實際應(yīng)用中仍存在效果不穩(wěn)定或施用后毫無效果的問題，市面上基本還沒有能夠真正有效降解亞硝酸鹽的特效藥，導(dǎo)致亞硝酸鹽污染成為令養(yǎng)殖業(yè)頭疼的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種生產(chǎn)成本較低、操作簡單、產(chǎn)品活菌數(shù)和芽孢率高的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是公開了使用本發(fā)明方法所制得的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑和該微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良中的用途。為達到所述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法，包括如下步驟:(a)制備枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的種子液。(b)將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的種子液接種至發(fā)酵罐的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)中采用二步控溫法，發(fā)酵前期和后期使用不同的溫度進行發(fā)酵，在發(fā)酵前期發(fā)酵溫度較高，在發(fā)酵后期發(fā)酵溫度較低；在發(fā)酵前期，菌體處于停滯期和對數(shù)生長早期，較高的罐溫有利于加速菌體的萌發(fā)，縮短停滯期時間，在發(fā)酵后期，菌體進入對數(shù)生長旺盛時期，自身代謝產(chǎn)熱嚴(yán)重，容易出現(xiàn)局部溫度過高，適當(dāng)降低控制溫度更有利與發(fā)酵生產(chǎn)菌數(shù)的提高和后期芽孢的形成。(C)發(fā)酵完成后，濃縮發(fā)酵液，將菌體干燥，稀釋，檢測，包裝，即得到降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑。 其中，上述步驟(b)中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)種子液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5 10% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:起始pH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為150 200r/min，罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24 28h，在I 16h控溫35 38°C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫28 32°C ;所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組分組成:按重量百分比記，玉米粉2 3%、糖蜜I 2%、豆餅粉I 2%、硫酸銨0.2 0.5%、磷酸氫二鉀0.1 0.2%、七水硫酸鎂0.03%、一水硫酸錳0.01%、沸石粉5 10%，余量為水。其中，上述步驟(b)中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌液的接種量優(yōu)選為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)選為:起始pH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為200r/min，罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24h，在I 16h控溫37°C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫320C ;所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量優(yōu)選為:按重量百分比記，玉米粉2%、糖蜜1%、豆餅粉2%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、七水硫酸鎂0.03%、一水硫酸錳0.01%、沸石粉10%，余量為水。其中，所述步驟(C)中濃縮發(fā)酵液的方法為離心后收集菌體；菌體干燥的方法為常規(guī)噴霧干燥法。用上述方法獲得的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑和所述降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良中的用途也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:(I)在液態(tài)發(fā)酵法采用二步控溫法，發(fā)酵液活菌數(shù)可達到103億/ml，芽孢率99%以上，有效提高了活菌數(shù)和芽孢率，保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性；(2)向液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中添加沸石粉，可以使菌體在發(fā)酵培養(yǎng)中進入沸石粉的微孔結(jié)構(gòu)中，在菌體增殖的同時實現(xiàn)與載體的緊密結(jié)合，形成牢固的生物膜系，比發(fā)酵結(jié)束后再添加沸石粉的常規(guī)固定化方法實現(xiàn)更牢固的結(jié)合作用，實現(xiàn)有效固定化，同時，這一操作還延長了微生態(tài)制劑的保質(zhì)期；(3)所得微生態(tài)制劑降解水體亞硝酸鹽的效果很好，且生產(chǎn)、使用操作簡單，成本低廉，易于推廣應(yīng)用。本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容可通過后述的說明及所附圖而得到。


圖1為本發(fā)明降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法的工藝路線圖。圖2為不同溫度控制方式下發(fā)酵液中活菌數(shù)增長狀況比較。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實驗材料本發(fā)明所用到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)購于中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心，產(chǎn)品編號為:ACCC02973。預(yù)備實施例1液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備配制液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為:按重量百分比記，玉米粉2%、糖蜜1%、豆餅粉2%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、七水硫酸鎂0.03%、一水硫酸錳0.01%、沸石粉10%，余量為水；按重量百分比稱取各組分加入水中 ，攪拌至均勻。預(yù)備實施例2不含沸石粉的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備配制不含沸石粉的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為:按重量百分比記，玉米粉2%、糖蜜1%、豆餅粉2%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、七水硫酸鎂0.03%、一水硫酸錳0.01%，余量為水；按重量百分比稱取各組分加入水中，攪拌至溶解均勻。實施例1降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備1.將購買來的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化，挑菌至裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為24h ;再將三角瓶中培養(yǎng)好的菌液接種至裝有LB液體培養(yǎng)基的種子罐進行擴大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為24h，得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的種子液。2.將步驟I所得的種子液接種至發(fā)酵罐的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，種子液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為:起始pH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為200r/min,罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24h，在I 16h控溫37°C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫32°C。3.發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液液離心后收集菌體，得到的菌體使用常規(guī)噴霧干燥法進行干燥，稀釋至活菌數(shù)為210億/g，檢測，包裝，即得到降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑。對照例I后固定化降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備1.將購買來的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化，挑菌至裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為24h ;再將三角瓶中培養(yǎng)好的菌液接種至裝有LB液體培養(yǎng)基的種子罐進行擴大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為24h，得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的種子液。2.將步驟I所得的種子液接種至發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)使用不含沸石粉的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5%,發(fā)酵培養(yǎng)條件為:起始PH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為200r/min，罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24h，在I 16h控溫37 °C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫32 °C。3.發(fā)酵完成后，向發(fā)酵液中添加10%的沸石粉吸附，將發(fā)酵液離心后收集菌體，得到的菌體使用常規(guī)噴霧干燥法進行干燥，稀釋至活菌數(shù)為210億/g，檢測，包裝，即得到后固定化降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑。對照例2不固定化降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備1.將購買來的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化，挑菌至裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為24h ;再將三角瓶中培養(yǎng)好的菌液接種至裝有LB液體培養(yǎng)基的種子罐進行擴大發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為24h，得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的種子液。2.將步驟I所得的種子液接種至發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)使用不含沸石粉的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5%,發(fā)酵培養(yǎng)條件為:起始PH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為200r/min，罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24h，在I 16h控溫37 °C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫32 °C。3.發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液離心后收集菌體，得到的菌體使用常規(guī)噴霧干燥法進行干燥，稀釋至活菌數(shù)為210億/g，檢測，包裝，即得到不固定化降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑。試驗例I 二步控溫 法與一步控溫法發(fā)酵效果對比1.試驗方法按照實施例1所述步驟I制備枯草芽孢桿菌的種子液，在步驟2中，設(shè)置三組試驗進行發(fā)酵效果對比，其中:處理A:發(fā)酵全程控溫32 °C ；處理B:發(fā)酵全程控溫37 °C ；處理C:采用二步控溫法，對溫度進行分段控制，前16h控溫37°C，16h后，控溫32。。。發(fā)酵過程中每4h抽取每組的發(fā)酵液檢測其活菌數(shù)，結(jié)果見圖2 ;發(fā)酵結(jié)束時檢測每組發(fā)酵液的活菌數(shù)和芽孢率，結(jié)果見表I。2.試驗結(jié)果2.1發(fā)酵過程中活菌數(shù)增長狀況比較從圖2可知，處理A全程控溫在32°C的較低溫度，前期菌數(shù)上升緩慢，后期進入對數(shù)增長期菌數(shù)增長較快但高度有限；處理B全程控溫在37°C的較高溫度，前期菌數(shù)上升快，但發(fā)酵后期菌數(shù)增長速率不及處理A和處理C ;處理C采用二步控溫法分段控制溫度相較于處理A和處理B有明顯優(yōu)勢，前期菌數(shù)上升快，同時后期可實現(xiàn)高速率的對數(shù)增長。2.2不同溫度控制方式下發(fā)酵液中活菌數(shù)和芽孢率比較表I不同溫度控制方式下發(fā)酵液中活菌數(shù)和芽孢率的比較
權(quán)利要求
1.一種降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法，包括如下步驟: (a)制備枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的種子液。
(b)將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的種子液接種至發(fā)酵罐的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)中采用二步控溫法，發(fā)酵前期和后期使用不同的溫度進行發(fā)酵，在發(fā)酵前期發(fā)酵溫度較高，在發(fā)酵后期發(fā)酵溫度較低； (c)發(fā)酵完成后，濃縮發(fā)酵液，將菌體干燥，稀釋，檢測，包裝，即得到降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(b)中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)種子液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5 10% ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:起始PH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為150 200r/min，罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24 28h，在I 16h控溫35 38°C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫28 32°C。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(b)中液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組分組成:按重量百分比記，玉米粉2 3%、糖蜜I 2%、豆餅粉I 2%、硫酸銨0.2 0.5%、磷酸氫二鉀0.1 0.2%、七水硫酸鎂0.03%、一水硫酸錳0.01%、沸石粉5 10%，余量為水。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(c)中濃縮發(fā)酵液的方法為離心后收集菌體；菌體干燥的方法為常規(guī)噴霧干燥法。
5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于: 所述步驟(b)中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5% ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:起始PH值為7 7.5，轉(zhuǎn)速為200r/min，罐壓為0.04 0.06MPa,發(fā)酵時間為24h，在I 16h控溫37°C，16h至發(fā)酵結(jié)束控溫32°C。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 所述步驟(b)中液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由以下組分組成:按重量百分比記，玉米粉2%、糖蜜1%、豆餅粉2%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、七水硫酸鎂0.03%、一水硫酸錳0.01%、沸石粉10%，余量為水。
7.按照權(quán)利要求1 6任何一項所述方法獲得的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑。
8.按照權(quán)利要求7所述的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑的制備方法，本發(fā)明先制備枯草芽孢桿菌的種子液，將種子液接種至發(fā)酵罐的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)中采用二步控溫法，發(fā)酵前期和后期使用不同的溫度進行發(fā)酵，發(fā)酵完成后，濃縮菌液，將菌體干燥，稀釋，檢測，包裝，即得到降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑；本發(fā)明還公開了使用上述方法獲得的降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑以及該微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良中的用途。本發(fā)明在發(fā)酵中采用二步控溫法，有效提高了活菌數(shù)和芽孢率，保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方中添加沸石粉，比常規(guī)固定化方法實現(xiàn)更有效的固定化，延長了產(chǎn)品的保質(zhì)期，所得微生態(tài)制劑降解亞硝酸鹽的效果很好。
文檔編號C12N1/20GK103160453SQ20131005898
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者劉全禮, 曹芬, 蔡君, 黃劍, 湯天靜, 谷序文 申請人:武漢施瑞福生物技術(shù)有限公司