基于str基因標(biāo)志用于鑒定供者dna嵌合比率的pcr引物、試劑盒及其應(yīng)用以及嵌合體的檢 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于STR基因標(biāo)志鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物、試劑盒及其應(yīng)用以及嵌合體的檢測(cè)方法，其檢測(cè)方法包括以下步驟：a)從樣品中提取DNA作為模板；b)設(shè)定根據(jù)權(quán)利要求1中所述的PCR引物的退火溫度，并對(duì)所述PCR引物進(jìn)行標(biāo)記；c)將標(biāo)記的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；d)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行分析，確定具有差異的基因標(biāo)志。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，將PCR引物與熒光標(biāo)記DNA片段分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合，創(chuàng)出供受者區(qū)分率高、操作簡(jiǎn)捷快速、結(jié)果分析準(zhǔn)確的整套嵌合率檢測(cè)分析系統(tǒng)，該方法克服了傳統(tǒng)方法中主觀影響，分辨率高結(jié)果精確，且操作簡(jiǎn)單快捷，干凈無(wú)毒。
【專利說明】基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物、試劑盒及其應(yīng)用以及嵌合體的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種基于STR基因標(biāo)志基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率供者嵌合比率的PCR引物、試劑盒及其應(yīng)用的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞移植后的植入情況主要依賴供者嵌合率的檢測(cè)，早期用以檢測(cè)供者嵌合率的方法包括表型檢測(cè)、性染色體核型分析、以及HLA分型等。這些方法對(duì)部分病例可獲得客觀植活的證明，但均有一定的應(yīng)用限制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增并分析供受體的基因型，可方便快捷地進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。用以擴(kuò)增分析的基因多態(tài)性分子標(biāo)志包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、小衛(wèi)星DNA(minisatellite DNA)，微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)等。其中微衛(wèi)星DNA又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandemrepeats, STR)，是由2~7bp為核心單位，多次重復(fù)并串聯(lián)而成的DNA序列，具有高度的多態(tài)性。無(wú)關(guān)個(gè)體間12個(gè)STR位點(diǎn)完全相同的概率為10_14，同胞之間完全相同概率也僅為10_4。顯然以STR作為鑒別不同個(gè)體DNA的基因標(biāo)志，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并結(jié)合片段分析可以定量監(jiān)測(cè)移植患者體內(nèi)供者細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)臨床具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。
[0003]當(dāng)前的嵌合體檢測(cè)的主要方法仍 然是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離供受者STR基因的擴(kuò)增片段，利用凝膠成像儀測(cè)量片段光密度相對(duì)定量分析供者嵌合比例。該方法也是法醫(yī)學(xué)利用基因標(biāo)志鑒定個(gè)體身份的經(jīng)典方法。但該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)、主觀誤差明顯、精確度低。常用的STR引物因退火溫度不同在對(duì)供受者初步分型時(shí)必須使用不同的擴(kuò)增程序，不能合理配置資源和時(shí)間。聚丙烯酰胺凝膠配制使用試劑較多，程序繁瑣而且難以保證每次配制凝膠的品質(zhì)相同。電泳過程耗時(shí)2-3小時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的電泳產(chǎn)生熱量會(huì)使凝膠因受熱不均影響電泳質(zhì)量。凝膠在染色過程中也會(huì)因每次使用的銀染、定容試劑的差異，溫度的變化導(dǎo)致背景的差異影響判斷。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率較高，擴(kuò)增產(chǎn)生的非特異性條帶常會(huì)對(duì)真實(shí)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生巨大影響。光密度定量屬于相對(duì)定量，誤差較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物，所述PCR引物的基因序列包括:
[0005]D5F(SEQ ID N0.1), D5R(SEQ ID N0.2)；
[0006]D7F(SEQ ID N0.3), D7R(SEQ ID N0.4)；
[0007]D8F (SEQ ID N0.5), D8R(SEQ ID N0.6)；
[0008]TF (SEQ ID N0.7)，TR (SEQ ID N0.8)；
[0009]FF (SEQ ID N0.9)，F(xiàn)R (SEQ ID N0.10)；
[0010]D13F(SEQ ID N0.11), D13R(SEQ ID N0.12)；[0011]SRYF (SEQ ID N0.13)，SRYR (SEQ ID N0.14)；
[0012]D16F(SEQ ID N0.15), D16R(SEQ ID N0.16)；
[0013]D18F(SEQ ID N0.17)，D18R(SEQ ID N0.18)。
[0014]本發(fā)明還提供了一種基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物在檢測(cè)嵌合體中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明保護(hù)了一種基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒，具體地，所述試劑盒含有根據(jù)上述實(shí)施例所述的PCR引物。
[0016]本發(fā)明還提供了一種基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒在檢測(cè)嵌合體中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明提供了一種嵌合體的檢測(cè)方法，包括以下步驟:a)從樣品中提取DNA作為模板山)設(shè)定根據(jù)權(quán)利要求1中所述的PCR引物的退火溫度，并對(duì)所述PCR引物進(jìn)行標(biāo)記；
c)將標(biāo)記的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；d)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行分析，確定具有差異的基因標(biāo)志。
[0018]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，
[0019]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在所述步驟b)中，所述標(biāo)記為FAM熒光標(biāo)記。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述FAM熒光標(biāo)記在所述PCR引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述PCR的擴(kuò)增條件為:95 V 5min ；95 V 30s,60°C 25s，72。。30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 4min。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在步驟d)中，對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因標(biāo)志片段進(jìn)行分析的方法采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳。
[0024]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，將PCR引物與熒光標(biāo)記基因片段分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合，創(chuàng)出供受者區(qū)分率高、操作簡(jiǎn)捷快速、結(jié)果分析簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的整套嵌合率檢測(cè)分析系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單快捷，干凈無(wú)毒，并且分辨率高、結(jié)果精確、客觀。
[0025]具體而言，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例PCR引物的與現(xiàn)有的引物序列相比，退火溫度統(tǒng)一，擴(kuò)增延伸時(shí)間均大幅度縮短。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的操作方法相t匕，由于摒棄了配制聚丙烯酰胺凝膠及電泳、銀染成像的過程，使得整個(gè)檢測(cè)過程更加簡(jiǎn)單快速，容易操作。
[0026]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，由于不必再使用有毒的試劑配制凝膠，不必為成像進(jìn)行銀染顯像，使得有毒試劑的使用大大減少，保護(hù)了操作者及操作環(huán)境的安
全，干凈無(wú)毒。
[0027]采用熒光標(biāo)記基因片段分析技術(shù)分辨率可以達(dá)到I個(gè)堿基差異，與同樣具有相同分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)相比，由于后者受限于背景噪音、非特異擴(kuò)增及技術(shù)人員的主觀因素使得前者較凝膠成像方法有更好的重復(fù)性和更高的準(zhǔn)確度。
[0028]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，相比于凝膠成像方法操作程序及結(jié)果分析的復(fù)雜， 該方法具有更好的可操作性，普通技術(shù)人員經(jīng)過簡(jiǎn)單的培訓(xùn)即可進(jìn)行操作并分析結(jié)果。[0029]傳統(tǒng)的對(duì)于凝膠成像方法的結(jié)果分析最大的缺點(diǎn)是會(huì)因分析人員的不同而發(fā)生變化，甚至相同人員不同時(shí)間得出的結(jié)果都有可能不同。而熒光片段分析因其結(jié)果由儀器在掃描同時(shí)計(jì)算得出，其結(jié)果不會(huì)因分析人員的不同而發(fā)生變化，因此，其檢測(cè)結(jié)果更為客觀、準(zhǔn)確。
[0030]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的受者D13基因位點(diǎn)擴(kuò)增片段掃描圖；
[0032]圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的供者D13基因位點(diǎn)擴(kuò)增片段掃描圖；
[0033]圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的移植后受者D13基因位點(diǎn)擴(kuò)增片段掃描圖；
[0034]圖4是根據(jù)傳統(tǒng)檢測(cè)方法得到的基因位點(diǎn)凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的 ，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例描述根據(jù)本發(fā)明的嵌合體的檢測(cè)方法。
[0037]一、實(shí)驗(yàn)方法:
[0038]1、從樣品中提取DNA作為模板(利用英俊公司DNA提取試劑盒提取供受者DNA標(biāo)本)。
[0039]2、PCR引物標(biāo)記:重新設(shè)計(jì)引物統(tǒng)一不同基因標(biāo)志引物的退火溫度，并在PCR引物的5’端標(biāo)記FAM熒光。
[0040]3、將標(biāo)記的PCR弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0041]4、對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因標(biāo)志片段進(jìn)行分析，確定具有差異的基因標(biāo)志。
[0042]二、PCR的反應(yīng)體系
[0043]所述PCR的反應(yīng)體系為:
[0044]

2X Premix (英俊公司) 12.5 μ I
標(biāo)記引物上游ΙμL 10 μ M
引物下游ΙμL 10 μΜ
雙蒸水9.5 μ I
DNA 樣本IOOng I μ I。
[0045]三、PCR的擴(kuò)增條件
[0046]PCR 的擴(kuò)增條件為:95°C 5min ；95°C 30s，60。。25s，72。。30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 4min。
[0047]采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳的具體方法為:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.5 μ I或Ladderl μ I加入21 μ I上樣液(去離子甲烯胺20 μ 1+Rox500內(nèi)標(biāo)1.0 μ I)，95°C變性5分鐘后立即冰浴至少 5 分鐘，ABI310 遺傳分析儀米用 P0P4 (Perforance Optimized Polymer 4)膠及 36cm長(zhǎng)毛細(xì)管進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管電泳及片段分析。
[0048]四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0049]通過儀器自帶軟件作圖，通過片段大小判斷并明確供受者有區(qū)別基因型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1至圖4所示，其中，圖1表示受者D13基因位點(diǎn)擴(kuò)增片段掃描圖，D13兩等位基因擴(kuò)增片段大小相差4個(gè)堿基；圖2表示供者D13基因位點(diǎn)擴(kuò)增片段掃描，D13兩等位基因擴(kuò)增片段大小相差8個(gè)堿基；圖3表示移植后受者D13基因位點(diǎn)擴(kuò)增片段掃描圖顯示為混合嵌合。圖4為某患者各基因位點(diǎn)凝膠電泳圖，非特異擴(kuò)增多，供受者區(qū)分主觀因素影響大，精確度低。
[0050]五、結(jié)果分析 [0051]通過上述實(shí)施例以及圖1至圖3的結(jié)果可以看出，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，將PCR引物與熒光標(biāo)記基因片段分析技術(shù)有機(jī)結(jié)合，創(chuàng)出供受者區(qū)分率高、操作簡(jiǎn)捷快速、結(jié)果分析簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的整套嵌合率檢測(cè)分析系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的嵌合體的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單快捷，干凈無(wú)毒，并且分辨率高、結(jié)果精確、客觀。
[0052]在本說明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0053]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種基于STR基因標(biāo)志鑒定供者DNA嵌合比率基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的基因序列包括:
D5F(SEQ ID N0.1)，D5R(SEQ ID N0.2)；
D7F(SEQ ID N0.3)，D7R(SEQ ID N0.4)；
D8F (SEQ ID N0.5)，D8R(SEQ ID N0.6)；
TF (SEQ ID N0.7)，TR (SEQ ID N0.8)；
FF (SEQ ID N0.9)，F(xiàn)R (SEQ ID N0.10)；
D13F(SEQ ID N0.11), D13R(SEQ ID N0.12)；
SRYF(SEQ ID N0.13)，SRYR(SEQ ID N0.14)；
D16F(SEQ ID N0.15), D16R(SEQ ID N0.16)；
D18F(SEQ ID N0.17)，D18R(SEQ ID N0.18)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于STR基因標(biāo)志鑒定供者DNA嵌合比率基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的PCR引物在檢測(cè)嵌合體中的應(yīng)用。
3.一種基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1所述的PCR引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于STR基因標(biāo)志用于鑒定供者DNA嵌合比率的試劑盒在檢測(cè)嵌合體中的應(yīng)用。
5.一種嵌合體的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: a)從樣品中提取DNA作為模板； b)設(shè)定根據(jù)權(quán)利要求1中所述的PCR引物的退火溫度，并對(duì)所述PCR引物進(jìn)行標(biāo)記； c)將標(biāo)記的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； d)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行分析，確定具有差異的基因標(biāo)志。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合體的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述步驟b)中，所述標(biāo)記為FAM突光標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合體的檢測(cè)方法，其特征在于，所述FAM熒光標(biāo)記在所述PCR引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合體的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR的擴(kuò)增條件為:.950C 5min ；95°C 30s, 60°C 25s，72°C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 4min。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合體的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟d)中，對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因標(biāo)志片段進(jìn)行分析的方法采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004820SQ201310060981
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月27日
【發(fā)明者】艾輝勝, 孫學(xué)東 申請(qǐng)人:北京紐賽爾生物科技有限公司