黃瓜黑色果刺基因b連鎖的ssr標記引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明“黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記引物及其應(yīng)用”，涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域。黃瓜黑色果刺基因B緊密連鎖的SSR標記引物，其特征在于：SSR07209-F/SSR07209-R:CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA；所述SSR標記引物擴增的與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶為192bp，核苷酸序列如Seq?IDNo.1；所述SSR標記引物擴增的與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶為178bp，核苷酸序列如和Seq?ID?No.2所示；采用本發(fā)明獲得的SSR標記，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行嫩果黑色果刺材料的剔除，具有高效、限制少的優(yōu)點，為選育白色果刺黃瓜提高了效率，縮短了育種周期。
【專利說明】黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域，特別是黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記及其在黃瓜育種材料選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其風(fēng)味清香、口感脆爽,深受各國消費者的喜愛。隨著消費水平的提高，人們對黃瓜品質(zhì)的重視程度與日俱增。品質(zhì)育種已成為黃瓜育種的重點之一。黃瓜果實品質(zhì)包括外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)。通常說的品質(zhì)性狀主要指商品性即外觀品質(zhì)，包括瓜色、瓜長、果刺多少、果刺顏色、果瘤大小、果色均勻度、光澤度等。果刺顏色作為重要的商品性狀之一，對商品銷售影響很大。一般來說，市場上需求白色果刺的黃瓜。研究黃瓜果刺顏色的遺傳規(guī)律及分子標記，對于選育符合市場需求的黃瓜新品種具有重要意義。
[0003]關(guān)于控制黃瓜果刺顏色的基因，已報道的有四個黑刺基因，分別為B、B-2、B-3、B-4。前人對于果刺顏色的遺傳規(guī)律進行了多項研究。本世紀初Wellington首次報道了了控制黃瓜黑色果刺的基因(B)，黑刺(B)對白刺(b)為顯性。Strong (1931)和Tkachenko(1935)的研究也表明，黃瓜黑刺或棕刺對白刺為顯性。1971年，Shanmugasundarum等(1971a)報道了不同于B基因的第二個黑色果刺基因B-2，該基因與B互作，F(xiàn)2后代分離比為 15 (黑):1 (白)。Cowen and Helsel (1983)利用 LJ90430 和 MSU41 為試材，證實了存在于野生黃瓜LJ90430兩個黑色果刺基因B-3和B-4，且兩基因存在互作，F(xiàn)2后代分離比為9(黑):7 (白)。 [0004]目前，有關(guān)黃瓜果刺顏色分子水平的研究，所見報道不多。Kennard等(1994)利用黃瓜栽培種與野生種雜交獲得F2群體，構(gòu)建了一個70位點的分子連鎖圖，包括61個RFLP標記,5個同工酶標記(Mp1-1> ldh、pgm-1、pep-pap和per)、2個形態(tài)標記(F和B)和2個抗病標記(dm和Ccu)，獲得了與黑色果刺基因B連鎖的RFLP標記Csp130，遺傳距離為5cM。Heang等(2008)獲得了一個與B基因連鎖距離為14.5cM的AFLP標記ECACMCTC150。苗晗等(2011)將果刺顏色作為數(shù)量性狀來研究，并在Chr4和Chr5上均檢測到主效QTL位點，并將 B 定位在了 Chr4 上 SSR02697-SSR19256 內(nèi)和 Chr.5 上 SSR15818-SSR06003 內(nèi)?？梢姡侥壳盀橹?，與質(zhì)量性狀基因B緊密連鎖的SSR標記尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于上述領(lǐng)域的空白，提供了與黃瓜黑色果刺基因B緊密連鎖的SSR標記，并提供了其在選擇黃瓜果刺顏色種質(zhì)資源上的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]黃瓜黑色果刺基因B緊密連鎖的SSR標記引物，其特征在于:
[0008]SSR07209-F/SSR07209-R:
[0009]CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA ；[0010]所述SSR標記引物擴增的與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶為192bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；
[0011]所述SSR標記引物擴增的與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶為178bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2所示。
[0012]上述SSR標記引物在篩選具有白色果刺基因b的黃瓜種質(zhì)資源中的應(yīng)用，其步驟如下:
[0013](I)采用上述SSR標記引物對待選黃瓜品種的基因組DNA分別進行PCR擴增；
[0014](2)對擴增結(jié)果進行凝膠電泳檢測；
[0015](3)從檢測結(jié)果中選出出現(xiàn)與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶的材料，去掉出現(xiàn)與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶的材料。
[0016]所述PCR反應(yīng)體系為:7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5 μ L Go Taq ?GreenMaster Mix,加雙蒸水至 IOul。
[0017]所述PCR擴增程序為:94 V預(yù)變性4分鐘；94 V變性15秒，55 °C退火15秒，72 °C延伸30秒，35個循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
[0018]所述凝膠電泳檢測:指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。 [0019]本試驗以白色果刺自交系Gyl4和黑色果刺自交系NC76為親本構(gòu)建F1' F2群體，對黃瓜黑色果刺基因B進行了遺傳規(guī)律分析。以F2群體為作圖材料，利用BSA法和SSR技術(shù)，實現(xiàn)B基因的染色體定位，并獲得緊密連鎖標記SSR標記引物SSR07209，與B的遺傳距離為2.2cM。所述SSR標記引物擴增的與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶為192bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述SSR標記引物擴增的與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶為178bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2所示。
[0020]本發(fā)明通過利用重組自交系(RIL)群體156個株系驗證，SSR07209用于分子標記輔助選擇的正確率為95.5%。
[0021]本試驗不僅為黃瓜黑色果刺基因B的精細定位和分子克隆奠定基礎(chǔ)，同時也為利用分子標記輔助選育白色果刺黃瓜新品種提供了高效的途徑。本發(fā)明基于選出的SSR標記引物提供用于輔助篩選具有白色果刺基因的黃瓜新品種的方法，該方法中，采用SSR07209標記引物擴增待測品種的DNA，然后對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，擴增產(chǎn)物可能出現(xiàn)三種情況:第一種是僅僅出現(xiàn)一條192bp條帶，這種為隱型純合材料；另一種是192bp條帶和178bp條帶都出現(xiàn),這種是隱型雜合材料,第三種是僅僅出現(xiàn)178bp條帶,選出第一種條帶對應(yīng)的材料，去掉第二種和第三種情況對應(yīng)的材料。通過本發(fā)明提供的方法，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行黑色果刺的篩選剔除，具有高效、限制少、準確的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1.是SSR標記SSR07209對黃瓜親本材料Gyl4 (P1)7NCTe (P2)7F1世代單株及F2群體隨機單株的檢測結(jié)果:
[0023]第一至三泳道分別為Gyl4 (白色果刺)、NC76 (黑色果刺XF1世代單株。第4~15泳道為F2群體隨機單株。
[0024]圖2.利用PI183967 X 93IRIL群體對與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記驗證?！揪唧w實施方式】
[0025]材料與方法
[0026]本研究所用的試驗材料為Gyl4 (P1)jNCie (P2)0
[0027]Gyl4是美國加工類型黃瓜自交系，生長勢較強，葉片深綠色，果皮深綠和白色相間，刺瘤稀少，白色果刺，果瘤中等大小。為現(xiàn)有已知品種。在Yi Ren等于2009年《PL0SONE》第四期發(fā)表的文章《An Integrated Genetic and Cytogenetic Map of the CucumberGenome》一文中也有記載。本實驗室有保存，保證自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗證實驗。
[0028]NC76是美國加工類型黃瓜自交系，生長勢中等，葉片黃綠色，果皮綠色，黑色果刺，刺中等密度，瘤極小?，F(xiàn)有已知品種，在Todd C.Wehner等于2008年《J.AMER.SOC.H0RT.SC1.》第 2 期發(fā)表的文章《A Single Dominant Gene Ch for Chilling Resistance inCucumber Seedlings》中也有記載。本實驗室有保存,保證自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗證實驗。
[0029]SSR引物來自國際黃瓜基因組計劃(CUGI)，共2112對(Ren et al.，2009)。詳細結(jié)果可以參見Ren等在PloS 0ne2009年第4期在線發(fā)表的文章《An inteGrated Geneticand Cytoenetic map of the cucumber Genome〉〉。PCR 實驗使用 Shanghai PromeGa 公司的GoTaq Green Master Mix ;凝膠電泳使用盈信陽光公司的40%非變性聚丙烯酰胺,將其稀釋至6%后使用。
[0030]實施例1.黃瓜黑色果刺基因B連鎖的SSR標記篩選 [0031]步驟1.黃瓜果刺顏色性狀鑒定
[0032]試驗于2012年春季和秋季在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬采花齊研究所實驗基地進彳丁，以Gyl4 (P1WPNCTe (P2)為父母本進行正反交、自交，獲得FpF2群體。秋季利用實驗大棚種植P1^ P2和F1' F/各10株，三次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。種植F2群體201株。株距25cm，行距55cm，按常規(guī)田間管理。在開花結(jié)果期，調(diào)查群體各單株上商品瓜(開花后7~IOd)的果刺顏色。計算分離比，使用Microsoft Excel2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,使用SAS8.0對結(jié)果進行卡方測驗。
[0033]結(jié)果顯示:無論正反交后代F1果刺均表現(xiàn)為黑色；在F2群體中，黑色果刺與白色果刺植株的分離比例為152:49，經(jīng)卡方測驗符合3:1。由此可知，黑色果刺性狀是由I對核基因控制的，黑色果刺(B)對白色果刺(b)為顯性。
[0034]步驟2.DNA提取和SSR分析
[0035]取黃瓜植株的嫩葉，用改良的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取親本及群體各單株的基因組DNA。
[0036]PCR反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系10uL，3yL DNA (2.5ng.μ L-1)，正向和反向引物(50ng.μ L-1)各 I μ L, 5 μ L Go Taq ? Green Master Mix (Promega 公司產(chǎn)品)。
[0037]引物使用黃瓜全基因測序升及tf」SSR引物(Ren et al.,2009 ；Cavagnaro et al.,2010)。
[0038]PCR 擴增程序為:94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，35個循環(huán)；72°C保溫 5min, 16°C forever?[0039]擴增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳緩沖液為0.5 X TBE, 150V恒功率電泳分離1.5h，電泳后銀染顯色，統(tǒng)計帶型。
[0040]步驟3.SSR標記篩選、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及連鎖圖構(gòu)建
[0041]主要包括4步:(1)篩選在父母本間表現(xiàn)多態(tài)的SSR標記；(2)在F2群體中選取黑色果刺、白色果刺單株的DNA各7個，根據(jù)BSA法構(gòu)建黑色果刺和白色果刺2個基因池，用池篩選多態(tài)性引物；(3)利用獲得的多態(tài)性引物分析F2群體各單株基因型；(4)利用JoinMap4.0軟件進行連鎖圖的繪制。
[0042]共顯性標記的統(tǒng)計方法:與母本(Gyl4) —致的帶型記為a，與父本(NC76) —致的帶型記為b，雜合的帶型記為h。
[0043]顯性標記的統(tǒng)計方法:若母本為顯性標記，則分離群體中和母本帶型一致的單株記為d，和父本帶型一致的記為b ;若父本為顯性標記，則分離群體中和母本帶型一致的單株記為a，和父本帶型一致的記為C，未擴增出的或模糊不清的記為U。
[0044]結(jié)果顯示:
[0045]用2112對SSR引物對Pl(GyH)和P2 (NC76)進行篩選，其中在兩個親本間表現(xiàn)多態(tài)的引物有359對，多態(tài)率17.0%。
[0046]結(jié)合BSA法建池，進一步篩選得到了 12個SSR多態(tài)性標記。
[0047]利用篩選出的多態(tài)性標記對Gyl4XNC76組合的F2群體進行分析，結(jié)合調(diào)查性狀數(shù)據(jù)利用Joinmap4.0構(gòu)建連鎖圖。結(jié)果12個標記和B被定位在同一連鎖群上(LOD=IO),其中SSR07209與B的遺傳距離為2.3cM。
[0048]將本試驗得到的連鎖圖與已發(fā)表的黃瓜遺傳圖譜(Ren et al.,2009 ；Miao etal，2011)比較，發(fā)現(xiàn)本連鎖群與第4染色體上共有9個共有標記，據(jù)此將B基因定位在第4染色體上。
[0049]步驟4.PCR擴增所得差異片段的回收純化及測序
[0050](I)目的片段的回收
[0051]采用煮沸法。具體操作為:先從膠上將目標條帶挖下來裝入1.5mL的Eppendorf管內(nèi)，向管內(nèi)加入100 μ L超純水，加水量視膠帶顏色深淺而定；常溫下浸泡24h，轉(zhuǎn)入95°C水浴鍋(或PCR儀)中煮30min后,5000rpm離心3min。產(chǎn)物即可取上清3 μ L做模板進行PCR擴增，剩余產(chǎn)物置_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0052](2)目的片段的純化
[0053]用PCR產(chǎn)物直接純化方法。在PCR產(chǎn)物中加入2倍體積的無水乙醇，_20°C過夜放置，I, 2000rpm離心5min就可以得到純化產(chǎn)物。
[0054](3)目的片段與載體的連接
[0055]反應(yīng)體系為10 μ L:PMD18-T Vectorl.0yL ；Ligation buffer I 5.0 μ L ;目的片段 4.0μ L。
[0056]在超凈工作臺上加樣，混勻反應(yīng)物，短暫離心，16°C連接約lh，過夜也不影響連接效率。
[0057](4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0058]I)取出感受態(tài)細胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；
[0059]2)感受態(tài)(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 預(yù)冷去離子水;[0060]3)用冷卻的無菌槍頭將上述懸浮液分裝到1.5mL離心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，輕旋混勻；
[0061]4) 42°C水浴熱激90s，注意不要晃動離心管；
[0062]5)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻3~5min ；
[0063]6)加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基。在37°C，150rpm搖床上預(yù)培養(yǎng)Ih ；
[0064]7)將菌液涂布到含有 100 μ g.Hir1Amp、25 μ g ?mL^IPTG 和 40 μ g ?mL^X-GAL 的 LB固體培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻棒輕輕的將菌液均勻涂開，置于室溫直至液體被吸收；
[0065]8)倒置平板，37°C培養(yǎng)12~16h。
[0066](5)重組質(zhì)粒的藍白斑篩選
[0067]經(jīng)37°C培養(yǎng)后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出現(xiàn)少量藍色菌落和較多的白色菌落，其中白色菌落為重組克隆子。挑取白色單菌落涂抹在劃好方格的LB液體培養(yǎng)基中，37°C,150rpm過夜培養(yǎng)。
[0068](6)菌落PCR的檢測
[0069]吸取I μ L菌液作為模板進行PCR擴增。取4 μ L PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與PCR Marker 標準分子量相比較檢測插入片段的大小，與插入目的片段大小一致的克隆即為陽性克隆。
[0070](7)克隆后載體的測序與分析
[0071]取3個陽性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存兩份，一份-20°C保藏，一份送去測序。
[0072]其中SSR標記引物SSR07209擴增出的與黃瓜果實白色果刺b連鎖的片段的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；與黃瓜果實黑色果刺B連鎖的片段的核苷酸序列如Seq IDN0.2所示。
[0073]實施例2.B基因連鎖標記的驗證
[0074]利用本課題構(gòu)建的PI183967X931的Fltl代RIL群體156個不同果刺顏色類型的黃瓜材料，對實施例1獲得的與B基因連鎖的標記SSR07209進行驗證，以確定該標記用于分子標記輔助選擇的準確性:這156個株系中有黑色果刺株系35個，白色果刺株系121個。經(jīng)和所選材料的田間表現(xiàn)型相比，標記在156個株系中共有，149個株系的帶型反映的表型數(shù)據(jù)與田間調(diào)查結(jié)果一致，經(jīng)計算正確率為95.5%。其中35個黑色果刺株系均擴增出黑色果刺特征條帶，部分株系的電泳圖見圖2。
[0075]本研究中構(gòu)建了黃瓜黑色果刺基因的SSR連鎖圖，所獲得的SSR標記(SSR07209)與B的遺傳距離2.3cM，這個與黃瓜黑色果刺基因連鎖的SSR標記為分子標記輔助選擇育種篩選白色果刺新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。為建立一套快速準確鑒定黃瓜白色果刺的方法提供了理論依據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.黃瓜黑色果刺基因B緊密連鎖的SSR標記引物，其特征在于:
SSR07209-F/SSR07209-R:
CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA ； 所述SSR標記引物擴增的與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶為192bp，核苷酸序列如 Seq ID N0.1 所示； 所述SSR標記引物擴增的與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶為178bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述SSR標記引物在篩選具有白色果刺基因b的黃瓜種質(zhì)資源中的應(yīng)用，其步驟如下: (1)采用上述SSR標記引物對待選黃瓜品種的基因組DNA分別進行PCR擴增； (2)對擴增結(jié)果進行凝膠電泳檢測； (3)從檢測結(jié)果中選出出現(xiàn)與黃瓜白色果刺基因b連鎖的特征條帶的材料，去掉出現(xiàn)與黃瓜黑色果刺基因B連鎖的特征條帶的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述PCR反應(yīng)體系為:7.5ng DNA模板，正向和反向引物各 50ng,5yL Go Taq ? Green Master Mix,加雙蒸水至 IOul。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2~4任一所述的應(yīng)用:所述凝膠電泳檢測:指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004749SQ201310061177
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月27日
【發(fā)明者】張圣平, 顧興芳, 苗晗, 劉書林, 王燁 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所