專利名稱：復(fù)合材料固定化赤霉菌制備煙酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用復(fù)合材料固定化產(chǎn)腈水解酶的赤霉菌CA3-1 {GibberelIaintermedia, CGMCC N0.4903)制備煙酸的方法，屬于生物工程應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙酸的生產(chǎn)主要是采用化學(xué)合成法和生物催化法，目前在工業(yè)上，仍然主要采用化學(xué)合成的方法進(jìn)行生產(chǎn)，如高錳酸鉀氧化法、硝酸氧化法、氣相氧化法、臭氧氧化法、氨氧化法、電解氧化法等，合成條件苛刻，如高溫高壓，能耗較大，易產(chǎn)生大量的廢氣廢渣等，而且合成效率較低，普遍存在著污染大、工藝復(fù)雜、成本高等缺點。違背了現(xiàn)價段可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略和建設(shè)環(huán)境友好型社會的要求，不符合原子經(jīng)濟(jì)性和綠化化學(xué)的發(fā)展方向。生物法生產(chǎn)煙酸條件溫和，催化效率較高，對環(huán)境的影響小，反應(yīng)過程易于控制，底物選擇性強(qiáng)，與化學(xué)合成法相比，生物法制備煙酸具有非常大的優(yōu)勢，適合現(xiàn)代應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。腈水解酶具有極為廣泛的底物譜，這也使得其在食品、制藥、化工等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，利用腈水解酶降解腈類化合物制備有機(jī)酸必將成為未來化工生產(chǎn)中的一個不可或缺的工藝。從已有研究成果來看，腈水解酶在腈類化合物中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用具有較高潛力，研究其細(xì)胞固定化過程和固定 化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化工藝具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活力因受到固定化過程的影響而有所降低，但固定化細(xì)胞的優(yōu)勢在于:固定化細(xì)胞容易回收重復(fù)利用，有利于產(chǎn)物的分離純化，而且降低了生產(chǎn)成本，提高了單位利用效率。因此，選擇合適的固定方法和固定化材料制備殘留活性高、能多次重復(fù)利用、儲存和操作穩(wěn)定性好的固定化細(xì)胞前景值得期待。腈類物質(zhì)對于產(chǎn)腈水解酶的微生物來說，都會有或強(qiáng)或弱的毒性。微生物細(xì)胞經(jīng)過固定化后，被包埋在生物材料里面，避免了與腈類化合物的直接接觸，減弱了腈類化合物毒性對微生物的傷害，使微生物細(xì)胞能夠長時間的保存轉(zhuǎn)化能力。產(chǎn)腈水解酶的微生物在固定化以后，能夠增強(qiáng)對產(chǎn)物和底物的耐受性，提高持續(xù)轉(zhuǎn)化能力。復(fù)合材料固定化細(xì)胞的優(yōu)勢在于，不同的材料混合使用，集合不同材料的優(yōu)勢，彌補(bǔ)單一材料的不足。單一材料固定化時，固定化細(xì)胞難以同時兼有良好機(jī)械強(qiáng)度和高的殘留活力。將具有較高活力的固定化材料和具有較好機(jī)械強(qiáng)度的固定化材料復(fù)合使用，這樣的復(fù)合材料就比較好的解決了這個的問題。本專利采用殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合材料固定化赤霉菌CA3-1，既彌補(bǔ)了殼聚糖固定化小球機(jī)械強(qiáng)度差的劣勢，也彌補(bǔ)了聚乙烯醇固定化小球活力低的缺點。至今為止，從未有利用復(fù)合材料固定化產(chǎn)腈水解酶的絲狀真菌并且用于腈類化合物生物轉(zhuǎn)化的任何專利及文獻(xiàn)報道。而目前國內(nèi)在這方面的研究仍處于空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種復(fù)合材料固定化赤霉菌CA3-1 {Gibberella intermedia,CGMCC N0.4903)制備煙酸的方法。該菌株為赤霉菌((JiMereJJa intermedia) H\，級藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.4903，保藏日期為2011年5月24日。本發(fā)明的技術(shù)方案為:赤霉菌CA3-1通過液體培養(yǎng)獲得菌液，經(jīng)過離心分離獲得濕菌體，用生理鹽水離心洗滌數(shù)次后重懸于生理鹽水中，加入聚乙烯醇和殼聚糖的混合包埋材料溶液，混合均勻后用注射器平穩(wěn)的注入到多聚磷酸鈉和飽和硼酸混合固化溶液中固化，得到的固定化小球經(jīng)過濾、用PBS洗去表面未固定的細(xì)胞和固化溶液。取定量的固定化小球參與反應(yīng)，加入PBS緩沖液，加底物3-氰基吡啶，在一定溫度、一定pH值的條件下反應(yīng)一定時間后，得到產(chǎn)物煙酸。上述過程中，赤霉菌CA3-1的液體培養(yǎng)基(g/L)為:磷酸二氫鉀2.72，硫酸亞鐵
0.0139，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化鈉1.16，己內(nèi)酰胺3.39，pH值為7.0。培養(yǎng)條件為:500mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)基在30°C，220rpm，往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)60h。離心分離所得菌體重懸于生理鹽水中，獲得1 0g/L的菌懸液，聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，殼聚糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，多聚磷酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，在0°C固化時間8h。形成的固定化小球用紗布過濾，用PBS緩沖液洗滌。轉(zhuǎn)化反應(yīng)時，PBS緩沖液的加入量為7mL，pH值為9.0，底物3-氰基吡啶的濃度為IOOmM 7mL，溫度為40°C，反應(yīng)時間為30min。
具體實施例方式下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例一
1、腈水解酶產(chǎn)生菌-赤霉菌CA3-1菌液的制備
液體培養(yǎng)基配方:磷酸二氫鉀2.72g，硫酸亞鐵0.0139g，葡萄糖10g，酵母粉7.5g，氯化鈉1.16g，己內(nèi)酰胺3.39g，加水至1L，充分溶解后調(diào)pH值為7.0。培養(yǎng)方法:從斜面菌種中用接種環(huán)挑取真菌菌絲，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝50mL液體培養(yǎng)基，在30°C，220rpm條件下，培養(yǎng)60h。實例二
1、赤霉菌CA3-1的固定化
殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合材料固定化細(xì)胞的方法:將制備的菌液經(jīng)離心分離獲得濕菌體，用生理鹽水離心洗滌后，取0.05g菌體重懸于生理鹽水中，制備成10g/L的菌懸液，向其加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的聚乙烯醇溶液和4%的殼聚糖溶液，充分混合均勻后用注射器平穩(wěn)注入到濃度為10% (w/v)多聚磷酸鈉和飽和硼酸的混合溶液中，(TC下固化8h，得到固定化小球經(jīng)過紗布過濾后用PBS緩沖液洗去未固定的細(xì)胞和混合固化溶液，固化結(jié)束后小球保存于生理鹽水中。固定化小球呈亮白色,直徑1.8mm左右。單一材料殼聚糖的固定化方法為:將制備的菌液經(jīng)離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌數(shù)次后，同樣取0.05菌體重懸于生理鹽水中，制備成10g/L的菌懸液，向其加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的殼聚糖溶液，充分混合均勻后用注射器平穩(wěn)注入到濃度為10% (w/v)多聚磷酸鈉溶液中，0°C下固化8h，得到固定化小球經(jīng)過紗布過濾后用PBS緩沖液洗去未固定的細(xì)胞和多聚磷酸鈉溶液，固化結(jié)束小球保存于4°C生理鹽水中。單一材料聚乙烯醇的固定化方法為:將制備的菌液經(jīng)離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌數(shù)次后，同樣取0.05菌體重懸于生理鹽水中，制備成10g/L的菌懸液，向其加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚乙烯醇溶液，充分混合均勻后用注射器平穩(wěn)注入到飽和硼酸溶液中，(TC下固化8h，得到固定化小球經(jīng)過紗布過濾后用PBS緩沖液洗去未固定的細(xì)胞和飽和硼酸溶液，固化結(jié)束小球保存于4°C生理鹽水中。將上述制備的三種固定化小球分別取4mL用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度測試(測定結(jié)果見表1)，對三種固定化細(xì)胞進(jìn)行活力測定(數(shù)據(jù)見表I)。由數(shù)據(jù)可知，殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合材料制備的固定化小球機(jī)械強(qiáng)度要優(yōu)于殼聚糖固定化小球，其活力比聚乙烯醇固定化細(xì)胞高，與殼聚糖固定化細(xì)胞活力持平。殼聚糖小球?qū)H比較敏感，并且機(jī)械強(qiáng)度低；聚乙烯醇小球韌性大,機(jī)械強(qiáng)度好，但是內(nèi)部結(jié)構(gòu)致密，具有較大的傳質(zhì)阻力。而殼聚糖-聚乙烯醇固定化小球呈亮白色，韌性大，活力高。表I復(fù)合材料與單一材料固定化小球機(jī)械強(qiáng)度對比
權(quán)利要求
1.一種利用固定化赤霉菌CA3-1(編號CGMCC N0.4903)細(xì)胞制備煙酸的方法，其特征在于將腈水解酶產(chǎn)生菌經(jīng)過液體培養(yǎng)得到菌液，分別利用聚乙烯醇、殼聚糖和聚乙烯醇-殼聚糖復(fù)合材料進(jìn)行赤霉菌CA3-1的全細(xì)胞固定化，并用于煙酸的生物轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，聚乙烯醇固定化的特征是腈水解酶產(chǎn)生菌經(jīng)過液體培養(yǎng)得到菌液，經(jīng)過離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌后重懸于生理鹽水中，得到濃度為8-12g/L的菌懸液；取3-8mL菌懸液加入3_8mL 4-10%聚乙烯醇溶液，混合均勻后用注射器平穩(wěn)的注入到含有飽和硼酸固化溶液中，于-4-10°C下，固化2-8h，得到的固定化小球經(jīng)過濾、洗去表面未固定的細(xì)胞和混合固化溶液，最后將固定化細(xì)胞保存在0-10°C的生理鹽水中，以備用于生物轉(zhuǎn)化制備煙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，殼聚糖固定化其特征是腈水解酶產(chǎn)生菌經(jīng)過液體培養(yǎng)得到菌液，經(jīng)過離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌后重懸于生理鹽水中，得到濃度為8-12g/L的菌懸液；取3-8mL菌懸液加入3_8mL 2-8%殼聚糖溶液中，混合均勻后用注射器平穩(wěn)的注入到質(zhì)量體積比為10%的多聚磷酸鈉固化溶液中，于-4-10°C下，固化2-8h，得到的固定化小球經(jīng)過濾、洗去表面未固定的細(xì)胞和混合固化溶液，最后將固定化細(xì)胞保存在0-10°C的生理鹽水中，以備用于生物轉(zhuǎn)化制備煙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，聚乙烯醇-殼聚糖固定化其特征是腈水解酶產(chǎn)生菌經(jīng)過液體培養(yǎng)得到菌液，經(jīng)過離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌后重懸于生理鹽水中，得到濃度為8-12g/L的菌懸液；取3-8mL菌懸液加入3_8mL 0.5-6%聚乙烯醇溶液和1-6%的殼聚糖溶液的混合溶液，混合均勻后用注射器平穩(wěn)的注入到含有飽和硼酸和6-15%的多聚磷酸鈉的混合固化溶液中，于-4-10°C下，固化2-8h，得到的固定化小球經(jīng)過濾、洗去表面未固定的細(xì)胞和混合固化溶液，最后將固定化細(xì)胞保存在0-10°C的生理鹽水中，以備用于生物轉(zhuǎn)化制備煙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，分別取2-12mL的固定化小球參與反應(yīng)，加入3-8mLpH值6.0-10.0的PBS緩沖液，加50-150mM底物3-氰基吡啶3_8mL，在30_50°C、pH值為6.0-10.0的條件下反應(yīng)20-45min，得到產(chǎn)物煙酸和副產(chǎn)物煙酰胺的混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征是腈水解酶產(chǎn)生菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖6-12g,酵母粉5-10g,磷酸二氫鉀l_5g,氯化鈉l_6g,硫酸亞鐵0.01-0.1g,己內(nèi)酰胺l_5g，加水至1L，pH為7.0 ;培養(yǎng)條件為500mL三角瓶裝液30-60mL，于25-35°C、180-220rpm 搖床培養(yǎng) 36_72h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法， 其特征是用于固定化的腈水解酶產(chǎn)生菌是編號為CGMCC N0.4903 的赤霉菌 CA3-1。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種將產(chǎn)腈水解酶的赤霉菌CA3-1(CGMCC No. 4903)用殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合材料固定化并用于制備煙酸的方法。具體是將赤霉菌CA3-1固定化，加入適量的3-氰基吡啶，選擇固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)條件，得到產(chǎn)物煙酸。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖-聚乙烯醇固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活力比聚乙烯醇小球高，重復(fù)利用性也優(yōu)于殼聚糖固定化小球。這種固定化細(xì)胞可以重復(fù)利用多次，具有較高的底物耐受性，能夠提高單位菌體的生產(chǎn)能力。為生物轉(zhuǎn)化法制備煙酸提供了前提，為赤霉菌CA3-1(CGMCC No. 4903)在由3-氰基吡啶制備煙酸的工業(yè)化應(yīng)用做好鋪墊。
文檔編號C12R1/645GK103103228SQ201310063189
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者史勁松, 李恒, 楊濤, 龔勁松, 許正宏, 孫文敬, 周強(qiáng) 申請人:江南大學(xué), 江西省德興市百勤異Vc鈉有限公司