專利名稱：一種檢測K-ras基因突變的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種用于定量檢測組織、尿液、血清或血漿中是否含有K-ras突變型基因的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
K-ras的突變激活是人類多種腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要原因之一，有如分子開關(guān)，正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；發(fā)生異常時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，并阻止細(xì)胞自我毀滅。K-ras基因突變多發(fā)生在第12、13密碼子，這種異常在胰腺癌(75%-95%)、結(jié)直腸癌(40%-50%)和肺癌(20%-30%)等腫瘤組織中發(fā)生率較高，在這些腫瘤患者的血清或血漿中也常能檢測到K-ras基因突變。目前，靶向治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的重要手段。大量臨床證據(jù)表明，K-ras基因發(fā)生突變的結(jié)直腸癌患者在接受西妥昔單抗、帕尼單抗等靶向藥物治療時(shí)效果很差，而K-ras野生型患者對這些靶向藥物表現(xiàn)出良好的療效。目前K-ras基因檢測已被寫入《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》，要求所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)，并且只有K-ras野生型患者才建議接受西妥昔單抗和帕尼單抗治療。臨床工作中并不是所有的病人都能獲得腫瘤標(biāo)本，尤其是一些復(fù)發(fā)和初發(fā)時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或者是處于癌癥晩期、不能耐受手術(shù)的癌癥患者，血清或血漿K-ras基因突變檢測可為其提供用藥指導(dǎo)。Gerlinger等(2012)對腫瘤異質(zhì)性的專門研究表明，腫瘤組織不同部位的體細(xì)胞基因突變譜并不相同，提示血清或血漿K-ras基因突變檢測有可能比采用単一的腫瘤活檢組織進(jìn)行檢測更具有臨床指導(dǎo)意義。越來越多的研究也表明，癌癥病人的血清或血漿中能否檢測到癌細(xì)胞逸出的突變DNA，以及分析血清或血漿中腫瘤基因含量的變化，可以為腫瘤的療效監(jiān)測及預(yù)后提供重要的參考。這種方法的優(yōu)點(diǎn)包括低侵襲性，方便在不同時(shí)間點(diǎn)獲取樣本，沒有空間抽樣偏差。不論是采用腫瘤組織檢測還是采用血清或血漿檢測，K-ras基因突變檢測的是來源于腫瘤組織的體細(xì)胞突變，不同于檢測一般性的遺傳突變；在腫瘤組織中尤其在血清或血漿中存在大量野生型DNA，相當(dāng)一部分患者其血清或血漿的K-ras基因突變比例低于1%。目前臨床上仍大都采用測序法等靈敏度>5%的檢測手段，突變基因特異擴(kuò)增PCR法(ARMS)的檢測靈敏度一般也在1%_5%之間，不能很好地適用于血清或血漿K-ras基因突變檢測。在2012年6月的Nature雜志上，分別來自意大利和美國的兩個(gè)研究小組報(bào)告稱，相當(dāng)一部分結(jié)直腸癌的靶向藥物耐藥是與患者腫瘤組織本就存在K-ras基因突變有關(guān)，只是由于這些患者腫瘤組織的K-ras基因突變率較低，因此測序法等常規(guī)手段難以檢出
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明g在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種高靈敏度、操作簡便、定量檢測患者的腫瘤組織、血清或血漿中是否攜帯K-ras基因突變的試劑盒及方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，包括如下成分:擴(kuò)增引物對，TaqMan-MGB探針和PNA ；其中，所述擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述TaqMan-MGB探針序列如SEQ ID NO: 3所示；所述PNA 序列 SEQ ID NO:4 所示。另外，所述TaqMan-MGB探針5’端連接有FAM標(biāo)記的熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端連接有MGB標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)。ー種應(yīng)用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測K-ras基因突變的方法，包括如下步驟:(1)提取待測樣本DNA ；(2) K-ras野生型及其突變型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備采集含有K-ras野生型DNA及其突變型DNA的樣品，提取野生型DNA和突變型DNA，K-ras野生型DNA的序列如SEQ ID NO:5所示，所述K_ras突變型DNA為SEQ ID N0:6 SEQ ID NO: 12所示序列中的任意一種；野生型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為:
權(quán)利要求
1.一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下成分: 擴(kuò)增引物對，TaqMan-MGB探針和PNA ； 其中，所述擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示; 所述TaqMan-MGB探針序列如SEQ ID NO: 3所示； 所述PNA序列SEQ ID NO:4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述TaqMan-MGB探針5’端連接有FAM標(biāo)記的熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端連接有MGB標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)。
3.ー種應(yīng)用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測K-ras基因突變的方法，包括如下步驟: (1)提取待測樣本DNA； (2)K-ras野生型及其突變型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采集含有K-ras野生型DNA及其突變型DNA的樣品，提取野生型DNA和突變型DNA，K-ras野生型DNA的序列如SEQ ID NO:5所示，所述K_ras突變型DNA為SEQ ID N0:6 SEQ ID NO: 12所示序列中的任意一種；野生型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為: 原料名稱終濃度 含 Mg2’PCR bufferIx dNIPs0.15 mMSEQ ID NO:1 所示引物0.4 pM SEQ ID NO:2 所示引物0.4Taq熱啟動_2.5U DNA 模板1-5 |iL加去離了水后的總體IR50 nL PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95° C 30s ；95° C 5s, 75° C20s，52° C 30s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)；突變型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的引物對及SEQ ID NO: 4所示PNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為: 原料名稱終濃度PCE buffer(.含 Mg2i)IxdNTPs0.15 mMSEQ ID NCH所示引物0.4 _SEQ IDNO:2所示弓丨物0.4 pM PNA0.1 _Taq 熱動酶2.5U DNA 校 K1-5 pLM1-)<離f水G的總體積50 pL PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95° C 30s ；95° C 5s, 75° C20s，52° C 30s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)；通過瓊脂糖凝膠電泳切膠回收DNA片段，并進(jìn)行純化，制備成濃度為3X 101°拷貝數(shù)/UL的野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒；將野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別倍比稀釋至104、103、IO2UO1和10° ;將突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒以1:100的拷貝數(shù)比例混合成1%突變比例混合質(zhì)粒; (3)檢測K-ras基因突變 以稀釋至IO3的野生型質(zhì)粒為陰性對照，ddH20為空白対照，1%突變比例混合質(zhì)粒為陽性對照，對待測樣本DNA進(jìn)行熒光PCR檢測，測定CT值；PCR反應(yīng)體系中未加入PNA的CT值記為CT_pna，反應(yīng)體系中加入PNA的CT值記為CT+pna，A CT=CT+pna-CT_pna ;其中，要求稀釋至IO3的野生型質(zhì)粒和空白對照管的CT+pna > 37或無CT值顯示，1%突變比例混合質(zhì)粒的A CT< 8 ； (4)檢測K-ras基因突變 的定性判斷 若待檢樣本DNA的CT+pna>37或無CT值顯示，則判斷為突變陰性； 若待檢樣本DNA的CT+PNA≤37，則計(jì)算其ΔCT;若Δ CT>10，判斷為突變陰性；若Δ CT〈8，判斷為突變陽性；8 ≤ ΔCT≤10，判斷為突變可疑，再次檢測其CT_PNA和CT+PNA，若Δ CT仍< 10，則判斷為突變陽性，否則判斷為突變陰性； (5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及突變定量分析 以稀釋至104、103、102和IO1的野生型質(zhì)粒作為模板，按照測定CT_PNA時(shí)的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，得到4種濃度模板的CT_pna值，以CT_pna值為縱坐標(biāo)，以野生型質(zhì)粒濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和經(jīng)步驟(4)定性判斷標(biāo)準(zhǔn)定為陽性突變的樣本DNA的CT_pna值、CT+pna值求得CT_pna值、CT+pna值分別對應(yīng)的拷貝數(shù)，計(jì)算K-ras基因突變率，K-ras基因突變率=CT+pna對應(yīng)的拷貝數(shù)/CT_pna對應(yīng)的拷貝數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述加入PNA的PCR反應(yīng)體系為:
5.一種擴(kuò)增K-ras基因的引物對，其特征在于，所述引物對序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示。
6.ー種TaqMan-MGB探針，其特征在于，所述TaqMan-MGB探針序列如SEQ ID NO: 3所/Jn o
7.如權(quán)利要求6所述 的TaqMan-MGB探針，其特征在于，所述TaqMan-MGB探針5’端連接有FAM標(biāo)記的熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端連接有MGB標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)。
8.ー種PNA，其特征在于，所述PNA序列如SEQ ID N0:4所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測K-ras基因突變的試劑盒及其檢測方法。所述試劑盒包括擴(kuò)增引物對，TaqMan-MGB探針和PNA；所述擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述TaqMan-MGB探針序列如SEQ ID NO:3所示；所述PNA序列SEQ ID NO:4所示。所述檢測方法包括提取待測樣本DNA，K-ras野生型及其突變型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備，檢測K-ras基因突變，檢測K-ras基因突變的定性判斷和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及突變定量分析等幾個(gè)步驟。本發(fā)明具有快速、簡便、高靈敏、高通量的特點(diǎn)，可用于組織、尿液、血清或血漿臨床標(biāo)本的K-ras基因突變的定性或定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103114146SQ201310063260
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者張戈 申請人:張戈