專利名稱：體外慢病毒介導(dǎo)bmp-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種軟骨分化的方法，特別是一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
:近些年來，使用滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行半月板軟骨修復(fù)是關(guān)節(jié)外科的熱點(diǎn)問題。經(jīng)典的組織工程學(xué)方法是將體外增殖誘導(dǎo)干細(xì)胞形成種子細(xì)胞，種植種子細(xì)胞在生物支架上，將支架移回生物體并添加各種細(xì)胞因子進(jìn)行修復(fù)。既往許多研究者選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-dervied mesenchymalstem cells, BMSCs)作為種子細(xì)胞。但是當(dāng)De Barii發(fā)現(xiàn)了滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovium-dervied mesenchymal stem cells, SMSCs)后，其迅速取代了 BMSCs。原因在于:盡管SMSCs在細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、集落形成能力和分化潛能方面和BMSCs相似，但其具有更強(qiáng)的軟骨分化潛能；此外，生理上當(dāng)半月板出現(xiàn)損傷時(shí)，滑膜作為SMSCs的儲(chǔ)存器，會(huì)移行定植到損傷處，和局部細(xì)胞一起，完成修復(fù)過程。所以選擇SMSCs，更符合生理過程，并有更專一的軟骨分化潛能。目前為止，有個(gè)案報(bào)道研究者采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子3(TGF-0 3)和骨形成蛋白2(BMP-2)作為介導(dǎo)SMSCs向軟骨分化的誘導(dǎo)因子。Sakaguchii1、Shirasawaiii和HorieMiv等利用TGF-β 3、BMP-2和地塞米松(Dex)，成功誘導(dǎo)SMSCs向纖維軟骨分化。但這一過程中仍存在諸多問題:誘導(dǎo)所需的BMP-2濃度需要非常高(50 200g/L甚至更高)，且時(shí)間很長(zhǎng)，這就導(dǎo)致SMSCs有向骨分化的可能。且體外反復(fù)應(yīng)用細(xì)胞因子存在降解失活的可能，并大大增加培養(yǎng)費(fèi)用。所以在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，采用慢病毒介導(dǎo)兔BMP-2基因轉(zhuǎn)染SMSCs，并加入EGFP基因作為報(bào)告基因，從而為應(yīng)用組織工程學(xué)方法進(jìn)行軟骨修復(fù)提供新思路和新方法
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，所述的這種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中體外誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的方法成功率低、而且時(shí)間和成本高的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，包括一個(gè)將滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)的步驟，還包括一個(gè)構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2的步驟，一個(gè)制備轉(zhuǎn)染慢病毒的病 毒液的步驟，一個(gè)將轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟，在所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，首先根據(jù)BMP-2基因設(shè)計(jì)引物，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)擴(kuò)增BMP-2基因，將已經(jīng)包含EGFP報(bào)告基因的pFUGW質(zhì)粒和BMP-2基因重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制備轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液的步驟中，利用所述的重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2加上包裝質(zhì)粒，共同構(gòu)建轉(zhuǎn)染慢病毒，然后再加入緩沖液培養(yǎng)、孵育、移去上清、過濾后得到轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液，在所述的將轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞和解凍的轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液混合，將混合物離心、培養(yǎng)40-52小時(shí)，然后將上述的培養(yǎng)物加入不完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)，誘導(dǎo)14天以上即可獲得軟骨細(xì)胞。進(jìn)一步的，在所述的制備轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液的步驟中，首先擴(kuò)增重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2、包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G，提純濃縮；其次將293T細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)至IO7,放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)含有DMEM培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中還包含有青霉素G、鏈霉素、小牛血清、聚賴氨酸，所述的青霉素G在DMEM培養(yǎng)基中的濃度為100U/ml、所述的鏈霉素在DMEM培養(yǎng)基中的濃度為100 μ g/ml、所述的小牛血清在DMEM培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為10%、所述的聚賴氨酸DMEM培養(yǎng)基中的濃度為5%，將293T細(xì)胞于培養(yǎng)瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的緩沖液，孵育、移去上清、過濾后得到轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液。進(jìn)一步的，在所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，將oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel雙酶切，同時(shí)，將已經(jīng)包含EGFP報(bào)告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，然后加入T4DNA反應(yīng)得到pFUGW-oBMP-2重組質(zhì)粒。進(jìn)一步的，在擴(kuò)增BMP-2基因的過程中，所述的5’端的引物序列如SEQ IDNO:1所示，所述的3’端的引物序列如SEQ ID N0:2所示。進(jìn)一步的，所述的不完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)液是一個(gè)含TGF-P3、地塞米松、2-磷酸-抗壞血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀 釋的ITS+Premix溶液的H-DMEM培養(yǎng)液；其中，在所述的H-DMEM培養(yǎng)液中，TGF- β 3的濃度為10ng/mL、地塞米松的濃度為I X IO^mol/L、2-磷酸-抗壞血酸的濃度為50μ g/mL、脯氨酸的濃度為40 μ g/mL、丙氨酸的濃度為lOOyg/mL、所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸、牛血清白蛋白、亞油酸，在所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中，胰島素的濃度為6.25 μ g/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為6.25μ g/mL、亞硒酸的濃度為6.25ng/mL、牛血清白蛋白的濃度為
1.25mg/mL、亞油酸的濃度為5.35mg/mL。盡管SMSCs和BMSCs在細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、集落形成、分化潛能方面均類似，但SMSCs具有更強(qiáng)的軟骨分化潛能，所以本發(fā)明選用SMSCs作為軟骨修復(fù)的種子細(xì)胞。目前被認(rèn)定可以促進(jìn)SMSCs向軟骨分化的細(xì)胞因子包括=TGF-P 1、BMP_2、IGF-1、DEX。TGF-β I可以增強(qiáng)SMSCs的擴(kuò)增，并抑制其向骨和脂的分化，TGF-β I的作用機(jī)理通過ERK1/2MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。ΒΜΡ-2被公認(rèn)為最強(qiáng)的成骨因子。但是近年來的研究認(rèn)為其亦可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化。盡管目前對(duì)其機(jī)理知之甚少，但是其應(yīng)用卻日漸增廣。但其應(yīng)用過程中，仍然存在諸多問題:ΒΜΡ-2的制造工藝非常復(fù)雜，產(chǎn)量很低；且新陳代謝很快，誘導(dǎo)時(shí)間較短；且作為外來蛋白，當(dāng)大量應(yīng)用時(shí)可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害作用。一些研究者嘗試?yán)弥Ъ艽钶d緩釋?duì)ⅵ?2，但ΒΜΡ-2對(duì)材料高度敏感，當(dāng)置于支架上，其活性會(huì)降低。所以為解決上述問題，采用將ΒΜΡ-2基因?qū)肼《?，并轉(zhuǎn)染SMSCs，從而使得BMP-2蛋白隨SMSCs增殖而生成。有趣的是，在的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，BMP-2可能是誘導(dǎo)SMSCs向軟骨分化的關(guān)鍵因子。相比于其他的病毒載體，慢病毒載體不僅可以轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞，還可以轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞。且目的基因的表達(dá)穩(wěn)定、長(zhǎng)效。EGFP，作為報(bào)告基因，可以直接被觀測(cè)到。其在470nm處吸收可見光，并在510nm處發(fā)出綠色熒光。只要表達(dá)足夠強(qiáng)烈，其可直接在活體觀察。不同于其他熒光標(biāo)記物，例如LacZ> Luc、β -galactosidase,其應(yīng)用中無需再添加其他因子。所以，在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，使用了已經(jīng)包含EGFP基因的pFUGW來轉(zhuǎn)染SMSCs，從而使得觀察變得簡(jiǎn)單明了。轉(zhuǎn)染后，免疫熒光和Western blot結(jié)果均證實(shí)有BMP-2蛋白生成。被轉(zhuǎn)染后的SMSCs，其安全性尤為重要，因?yàn)槠錄Q定了是否可以被用作種子細(xì)胞。相關(guān)的生長(zhǎng)曲線表明細(xì)胞數(shù)量在第7天趨于穩(wěn)定，表明其分化能力非無限制的。流式細(xì)胞儀被用于測(cè)定DNA含量，結(jié)果提示無假二倍體細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的SMSCs均為正常的二倍體細(xì)胞。此外，核型分析顯示SMSCs中含44條染色體。致瘤性試驗(yàn)表明其無致瘤性。這些結(jié)果都證實(shí)了SMSCs是安全的，可以被用作種子細(xì)胞。之后將安全的SMSCs放在不完全成軟骨培養(yǎng)基上。發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞形態(tài)從梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)為多邊形細(xì)胞。通過RT PCR可檢測(cè)到I型膠原、2型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達(dá)。間接免疫熒光結(jié)果亦表明有I型膠原和2型膠原生成。在正常的軟骨發(fā)育不全病例中，可見MicroRNA_130a表達(dá)缺失。其在軟骨形成過程中表達(dá)逐漸減少。其靶基因Runx3在軟骨發(fā)育不全病例中亦表達(dá)缺失。Micro-145，作為正常關(guān)節(jié)軟骨中Sox9的直接調(diào)節(jié)者，其通過結(jié)合3’ -UTR的特定結(jié)合位點(diǎn)而下調(diào)了 Sox9的表達(dá)。在人軟骨表型中，Micix)-145非常重要。當(dāng)其水平升高時(shí)，會(huì)降低特異性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)基因(C0L2A1和聚集蛋白聚糖)和組織特異小RNA (miR-675and miR-140)的表達(dá)，同時(shí)升高RUNX2和MMP13的表達(dá)，后兩者在骨性關(guān)節(jié)炎病例中多見。所有上述的結(jié)果均顯示BMP-2可誘導(dǎo)SMSCs向軟骨分化。本發(fā)明提供了一種用于半月板修復(fù)的新的種子細(xì)胞。經(jīng)plentiV6-oBMP-2轉(zhuǎn)染的SMSCs足夠安全，為正常的二倍體細(xì)胞，無致瘤性，且在體外可自發(fā)向軟骨分化。


:圖1是轉(zhuǎn)染前貼壁后I天光鏡下(100X) SMSCs的形態(tài)學(xué)照片，光鏡顯示為梭形細(xì)胞。圖2是轉(zhuǎn)染前貼壁后14天光鏡下(100X) SMSCs的形態(tài)學(xué)照片，光鏡顯示為梭形細(xì)胞。圖3是轉(zhuǎn)染前貼壁后14天電鏡SMSCs的形態(tài)學(xué)照片，電鏡顯示核質(zhì)比大。圖4是免疫熒光試驗(yàn)。A、B、C、D依次為為綠色熒光顯示波形蛋白生成；綠色熒光顯示a -SMA生成；紅色熒光顯示有0ct4表達(dá)；紅色熒光顯示有Sox9表達(dá)。圖5 是流式細(xì)胞儀結(jié)果。A、B、C、D、E 依次為 CD44(98.25%)、CD90 (98.75%)、CD29 (99.14%)、CD34 (幾乎無)、CD45 (幾乎無)。圖6是多向分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A、B、C依次為成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo)?？梢夾KP染色(+)、油紅染色(+)、堿性甲苯胺藍(lán)染色顯示有胞外基質(zhì)GAG生成。圖7顯示慢病毒轉(zhuǎn)染后的圖；其中A為流式細(xì)胞儀顯示轉(zhuǎn)染率超過80% ；B為對(duì)應(yīng)熒光圖(100X)。圖8顯示轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)(200 X)的照片。A為在不完全成軟骨培養(yǎng)基上，細(xì)胞由梭形細(xì)胞變?yōu)槎噙呅渭?xì)胞；B為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中細(xì)胞形態(tài)幾乎無變化。圖9顯示RT-PCR結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組表達(dá)I型膠原、2型膠原等，且2型膠原更多；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組少量表達(dá)I型膠原和2型膠原等；空白對(duì)照組不表達(dá)。圖10顯示免疫熒光染色和甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)(200 X)的照片。紅色熒光顯示有I型膠原生成，綠色熒光顯示有2型膠原生成，實(shí)驗(yàn)組被甲苯胺藍(lán)染色，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組均無染色。圖11顯示MiCT0RNA分析。A為在實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、完全對(duì)照組、基線組中M1-130a的表達(dá)，B為在實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、完全對(duì)照組、基線組中M1-145的表達(dá)。
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1:SMSCs的獲取、分離和鑒定1.1 獲取 SMSCs準(zhǔn)備了 6只3月齡的新西蘭大白兔(SPF級(jí)，Slack實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國科學(xué)院，http://www.slaccas.com)(平均體重2.1±0.3kg,雌雄不限)。固定麻醉后，取館旁直切口，逐層打開至關(guān)節(jié)囊，用組織剪取髕上囊滑膜組織。將取得的滑膜剪碎，37°C下用2型膠原酶(0.2%, Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)消化 3 小時(shí),經(jīng) 200-lm濾網(wǎng)(佳寶公司，http://www.caiRou.com.cn/c20931)過濾后獲取組織塊，并培養(yǎng)于含20%FBS (Hyclone 公司 http: //www.hyclone.com)的 DMEM (GibcolBRL 公司，http: //www.gel company, com/products/gibco~brl)中。上述所有過程均在超凈臺(tái)(Sff_CJ_lF,佳寶公司，http: //www.caigou.com, cn/c20931)內(nèi)完成。隨后保存于 5%C02 孵箱中(CCL-170A-8,ESCO公司，http://escoglobal.com/home, php)中孵育14小時(shí)。隨后再次剪碎、過濾后保存于含10%PBS的60mm培養(yǎng)皿中。每24小時(shí)換液以去除未貼壁的細(xì)胞。1.2SMSCs的分離 和純化培養(yǎng)皿中包含多種細(xì)胞?；陉幮苑蛛x法原理分離SMSCs。向細(xì)胞群中加入了含有CD14 的戴諾磁珠(111-49D, Dynabeads CD14,卓康牛.物科技公司，http://www.caigou.com.cn/c42082),隨后經(jīng)過磁珠分選儀(KingFisher,安諾生物科技公司，http://ww.hbzhan.com/st31204/product 1832042.html)即得到純化的 SMSCs。將這些細(xì)胞按照 IOOcells/cm2的密度培養(yǎng)14天后凍存于_80°C下作為Pl代。1.3形態(tài)學(xué)鑒定每天都通過倒置相差顯微鏡觀察Pl代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。將細(xì)胞消化成懸液后，隨機(jī)選取100個(gè)視野，測(cè)量所見細(xì)胞的直徑。同時(shí)，還進(jìn)行了電鏡觀察。將P2代細(xì)胞用0.25%Trypsin/EDTA (YW003,宜滕生物公司，http://www.yitbi0.com)消化后,使用2.5%戍二醒和鋨酸(帝科化工公司，http://www.whdic0.com/index, htm)固定90分鐘。再用70%酒精飽和醋酸液鈾染色,經(jīng)酒精和丙酮脫色后包埋于環(huán)氧樹脂618中(博偉化工公司，http://cqtnbw.qjyl68.com)。隨后切成90nm超薄切片，再經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后，于透射電鏡(H-7650，HITACHI公司，http://www.hitach1.c0.jp)下鏡檢。結(jié)果:貼壁后2天，已經(jīng)有一些梭形細(xì)胞；14天后，細(xì)胞幾乎均為梭形細(xì)胞。此外，透射電鏡顯示核質(zhì)比較大，核仁較大而細(xì)胞質(zhì)卻不發(fā)達(dá)(圖1、2、3)，符合干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。
1.4免疫突光分析將P3代細(xì)胞種植于玻片上，用4%多聚甲醛固定，然后浸入2%BSA/PBS中10分鐘。一抗包含 0ct4 (羊抗，1:50, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)、波形蛋白和 a-SMA (均來源于鼠抗，1:200, Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)和 Sox_2 (鼠抗，1:400, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)。培養(yǎng) 24小時(shí)后，加入二抗，二抗包含 FITC-羊抗鼠 IgG (1:100, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)、Cy3_ 羊抗鼠 IgG 和 Cy3_ 驢抗羊 IgG (均為 1:150, KPL 公司，http: //www.kpl.com)ο隨后DAPI染色觀察。結(jié)果:免疫熒光分析顯示P3代細(xì)胞表達(dá)了波形蛋白和a -SMA，此二者為SMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)志物。此外，0ct4和Sox2表達(dá)也很強(qiáng)烈(圖4)，尤其是0ct4，表明細(xì)胞有多向分化潛能。所以可以認(rèn)為P3代細(xì)胞基本都為間充質(zhì)干細(xì)胞了，并且有多向分化潛能。1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)將P3代細(xì)胞使用0.25%Trypsin/EDTA消化。隨后選取I X IO5細(xì)胞，加入多種熒光標(biāo)記抗體，有 CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD44-FITC (均來源于晶美生物公司，http://www.jinRme1.com)和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體,混合均勻后避光室溫靜置20分鐘。隨后加入2mlPBS，離心5分鐘，移去上清，加入300 μ 1PBS,再次離心，上機(jī)檢測(cè)(FACSCalibur type, Becton Dickinson 公司，http: //www.bd.com)計(jì)數(shù)陽件細(xì)胞百分比，所有數(shù)據(jù)通過配套的CellQuest軟件分析(Becton Dickinson)。結(jié)果:流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示上述細(xì)胞表達(dá)了 SMSCs的分子標(biāo)記物，例如⑶44(98.25%)、CD29 (99.14%)、CD90 (98.75%)。而造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記物CD34、CD4卻幾乎沒有表達(dá)(圖5)。上述結(jié)果證實(shí)了擴(kuò)增的細(xì)胞為SMSCs。1.6細(xì)胞多向分化潛能測(cè)定為了成脂，細(xì)胞被培養(yǎng)在含0.5 μ M地塞米松、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤、50 μ M吲
哚美辛的成脂培養(yǎng)基上。4天后0.3%油紅染色觀察。為了成骨，細(xì)胞被培養(yǎng)在含IOOnM地塞米松、IOmM β -甘油磷酸鹽、50 μ M抗壞血酸的成骨培養(yǎng)基上。21天后,使用他171^1 法(研晶公司，111^0://￥￥￥.yjbi0.com)分析堿性磷酸酶的表達(dá)。為了成軟骨，細(xì)胞被培養(yǎng)在含500ng/ml的BMP-2、10ng/ml TGF-β 3、1(Γ7Μ地塞米松、50ug/ml2-磷酸-抗壞血酸、40ug/ml脯氨酸、100ug/ml丙氨酸，以及I比100稀釋的 ITS+Premix (含 6.25ug/ml 胰島素，6.25ug/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白，6.25ng/ml 亞砸酸，1.25mg/mlBSA,以及5.35mg/ml亞油酸)的DMEM培養(yǎng)基上。顆粒包埋切片后用甲苯胺藍(lán)染色。成骨誘導(dǎo)的AKP染色顯示兔SMSCs為陽性，陽性細(xì)胞中可見棕黃色的染色顆粒。成脂誘導(dǎo)，可見有大滴脂肪被油紅染色。成軟骨誘導(dǎo)可見細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)為多角形，堿性甲苯胺藍(lán)染色顯示有胞外基質(zhì)GAG成分(圖6 )。上述結(jié)果證實(shí)兔SMSCs具有多向分化潛能。實(shí)施例2載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

2.1引物設(shè)計(jì)兔BMP-2 的 GenBank 編號(hào)為 ΝΜ_0010826507，閱讀框?yàn)?70_1257bp。據(jù)此利用 S⑶^#(http://www.yeastgenome.0rg/cgi—bin/web—primer) 十弓I奪勿。弓I物設(shè)計(jì)為 5，端:5’-CTAGCTAGCTGGAGGCTCTTTCAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)。GCTAGC 為限制性內(nèi)切酶 Nhel 的酶切位點(diǎn)，ATG為終止密碼子；3’端:5’-GGGTTTACCGGTAAAGCAAAAACAAACCAA-3’ (SEQ ID NO:2)。ACCGGT 為限制性內(nèi)切酶Agel的酶切位點(diǎn)，AAG為終止密碼子。2.2BMP-2 擴(kuò)增使用Trizol (Gibco 公司，http://zh.1nvitrogen.com)來抽提兔肝臟的總 RNA,使用5IU MMLV (業(yè)力公司，http://www.業(yè)力bio, cn)講行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。經(jīng)70°C下反應(yīng)5分鐘，37 °C下反應(yīng)60分鐘，95 °C下反應(yīng)5分鐘的循環(huán)后，cDNA即被合成。使用PCR(TC9600-G-230V,Labnet 公司，http://www.labnet.net)將 oBMP-2 擴(kuò)增至 1.2kb。反應(yīng)條件為:94°C下2分鐘；94°C下5秒、58°C下45秒、72°C下45秒、每30秒后一次循環(huán)；72°C下5分鐘。2.3PlentiV6-oBMP2 包裝將Agel 和 Nhel (TakaRa 公司，http: //www.takara.com, cn)從 IOunits/ μ L 稀釋到lunit/μ L。再將oBMP-2的cDNA雙酶切，并于70°C下滅活10分鐘。IOOV電泳后從1%瓊脂糖膠上的1.2kb條帶處割膠。同時(shí)，將已經(jīng)包含EGFP報(bào)告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，靜置2小時(shí)。將雙酶切好的載體和割下的膠帶按照1:3的比例在16°C下反應(yīng)I小時(shí)，期間加入T4DNA (業(yè)力公司，http: //www.yelibi0.cn)。即得到pFUGW_oBMP-2重組質(zhì)粒。隨后，擴(kuò)增重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2，包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G (Didier Tro實(shí)驗(yàn)室，http://www.lentiweb.com);提純濃縮至I μ g/ μ L備用。轉(zhuǎn)染的前I天，先將293Τ細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)細(xì)胞密度調(diào)制107，再放入75ml培養(yǎng)瓶中，瓶?jī)?nèi)含DMEM培養(yǎng)基，包含有青霉素G( 100 U/ml )、鏈霉素(100 μ g/ml )、10%FBS、聚賴氨酸。將培養(yǎng)瓶保存于37°C下的5%C02 孵箱中 24 小時(shí)。另小心加入 pFUGW-oBMP-231 μ g、psPAX29 μ g、pMD2.GlO μ g 到雙餾水中，將總?cè)萘空{(diào)至1600 μ L，再加入150 μ LCaCl2 (2.5mol/L)和1750 μ LBES (業(yè)力公司，http://www.yelibi0.cn),混合均勻后室溫下放置20分鐘。然后逐滴將上述混合物加入含293T細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶再次保存于37°C下的5%C02孵箱中16小時(shí).然后移去上清，用0.45 μ m濾紙濾過。將所得的病毒液凍存于-80°C下備用。同樣做了對(duì)照組，除去不包含oBMP-2，其余所有步驟同上述相同。2.4plentiV6-oBMP-2轉(zhuǎn)染SMSCs及其轉(zhuǎn)染效率分析取P3代SMSCs，消化和計(jì)數(shù)后，選取5 X 104細(xì)胞和解凍的病毒液混合。將混合物離心(2500r/min)3小時(shí)后，重植回12孔板上。每孔加入Iml含10%FBS的L-DMEM，每2天更換培養(yǎng)基。每次更換培養(yǎng)基時(shí)，均使用熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況。當(dāng)混合物培養(yǎng)24小時(shí)后，通過熒光相差顯微鏡觀察是否有綠光。每次更換培養(yǎng)基時(shí)，均使用熒光相差顯微鏡觀察綠色熒光，取相同視野的熒光相和自然光相做比較，從而確定轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)還使用了流式細(xì)胞儀分析陽性率。此外，還進(jìn)行了 Western blot檢測(cè)。取培養(yǎng)轉(zhuǎn)然后SMSCs的上清液，用3%PBS固定細(xì)胞3小時(shí)后，加入oBMP-2抗體和FITC-羊抗兔IgG，反應(yīng)小時(shí)后，加入10mlNBT/BCIP,避光反應(yīng)15分鐘后行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果:因?yàn)閜lentiV6-oBMP-2內(nèi)含EGFP報(bào)告基因，所以可以直接在熒光顯微鏡下觀察。被成功轉(zhuǎn)染的SMSCs細(xì)胞可發(fā)出綠色熒光，而未成功轉(zhuǎn)染的則無熒光。實(shí)時(shí)觀察表明48小時(shí)后EGFP表達(dá)的綠色熒光達(dá)到最高峰，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示此時(shí)表達(dá)率約為80%(圖 7)。選取培養(yǎng)SMSCs的上清液做SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)膠做Western blot。實(shí)驗(yàn)組在40000處有條帶顯出，而對(duì)照組則無。說明被plentiV6-oBMP-2轉(zhuǎn)染后的SMSCs可表達(dá)BMP-2蛋白。實(shí)施例3轉(zhuǎn)染后SMSCs安全性鑒定3.1細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)分析將轉(zhuǎn)染后的SMSCs按50Cells/Cm2的密度種植于24孔板后，放入CO2孵箱中。每天選取3孔，用200 μ L0.25%Trypsin/EDTA消化后，用移液槍反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。直到取完所有孔，之前培養(yǎng)基均不更換。每天每孔中的細(xì)胞數(shù)量都被計(jì)數(shù)后取均值記錄。按照數(shù)值，依據(jù)方程繪制生長(zhǎng)曲線并依次計(jì)算倍增時(shí)間。使用到的方程為TD=tlog2/log(N/N0)(t:從開始培養(yǎng)到被計(jì)數(shù)日的時(shí)間，單位小時(shí)；N:時(shí)間T時(shí)的細(xì)胞計(jì)數(shù)；N0:細(xì)胞總數(shù))。結(jié)果:計(jì)數(shù)了 7天的細(xì)胞數(shù)，然后據(jù)此繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。按照相關(guān)公式，計(jì)算了細(xì)胞倍增時(shí)間，約為30.2±2.4小時(shí)。曲線顯示細(xì)胞數(shù)量呈S行分布，到第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量幾乎保持穩(wěn)定。結(jié)果說明SMSCs的生長(zhǎng)并非無限制倍增的。3.2核型分析 首先制備了轉(zhuǎn)染后SMSCs的染色體樣本。SMSCs被加入到含0.1 μ g/ml秋水仙堿的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時(shí)，隨后用0.25%Trypsin/EDTA消化，用移液槍反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。再用PBS洗滌2次后，離心混合液并取其沉淀物。隨后用0.075M氯化鉀低滲液重懸后，放置在37°C下30分鐘，再次離心(IOOOrpm)，取其沉淀，用甲醇/冰醋酸(3:1)重懸固定15分鐘。將細(xì)胞懸液從20cm高處逐滴滴在冰玻片上，過火3次，再用Giemsa染色10分鐘。最后使用光鏡觀察計(jì)數(shù)染色體。然后使用流式細(xì)胞儀分析DNA含量。用PBS洗滌SMSCs3次，隨后用0.25%Trypsin/EDTA消化，用移液槍反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。經(jīng)離心分離后，取其細(xì)胞沉淀用75%酒精重懸固定，放置在-20°C環(huán)境下24小時(shí)。之后用75%酒精和PBS洗滌細(xì)胞3次，再加入100100 μ g/ml核糖核酸酶。37°C下30分鐘后，用40 μ g/ml碘化丙啶染色。同時(shí)，選取了兔股骨骨髓細(xì)胞，去除紅細(xì)胞后作為同型對(duì)照。其余所有操作均相同。使用流式細(xì)胞儀分析DNA含量。結(jié)果:使用流式細(xì)胞儀確定了 DNA含量?？梢奊2-M期、GO-Gl期的曲線較為平滑，表明沒有假二倍體。SMSCs在GO-Gl期、G2-M期、S期的分布為87.41%,0.00%、12.59%，表明SMSCs為正常的干細(xì)胞。3.3致瘤性分析將P3代的2 X IO7SMSCs注射到N0D/SCID小鼠(n=3)的左側(cè)腹股溝皮下(SPF級(jí)，Slack實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國科學(xué)院，http://www.slaccas.com)。觀察3個(gè)月看是否有腫瘤生成。結(jié)果:每周觀察被注射了的N0D/SCID小鼠，共計(jì)3個(gè)月，并未發(fā)現(xiàn)任何腫瘤生成。表明被轉(zhuǎn)染的SMSCs無致瘤性。上述結(jié)果共同證實(shí)被轉(zhuǎn)染的SMSCs為正常的二倍體細(xì)胞，非無限增殖，且無致瘤型，是安全的，因而可作為種子細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)染后的SMSCs向軟骨定向分化4.1RT PCR分析基因表達(dá)后續(xù)的所有實(shí)驗(yàn)中，均設(shè)置了以下3組，分別為實(shí)驗(yàn)組:經(jīng)plentiV6-oBMP_2轉(zhuǎn)染的SMSCs，記為plentiV6-oBMP-2(+);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組:經(jīng)plentiV6轉(zhuǎn)染，但不包含oBMP-2的，記為plentiV6-oBMP-2(_);空白對(duì)照組:未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SMSCs。將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞放置在DMEM上培養(yǎng)，含5mlFBS、5 μ L地塞米松(lmol/L)、5OyLTGF-0 3(lOyg/ml)。14天后，于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。此外，利用RT PCR分析I型膠原、2型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的聚集蛋白聚糖的mRNA等的表達(dá)。結(jié)果:SMSCs在非完全成軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了很大改變，原本的梭形細(xì)胞逐漸變成了類似軟骨細(xì)胞的多邊形，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組形狀并未改變(圖8)(空白對(duì)照組無需觀察)。使用Trizol 抽提總 RNA 后凍存在-70°C下。Oligo dT-Adaptor 引物(Bio-Rad 實(shí)驗(yàn)室，http: //www.biorad, com)、Rase Free dH20 (浩然生物公司，http:// www.haoranbi0.com)、dNTP 混合物(Promega 公司，http: //www.promega.com.cn)> RNase 抑制劑(浩然生物公司，http://www.haoranbi0.com)、M-MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega 公司,http: //www.promega.com, cn)等被用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)如下:I 型膠原(正義鏈:5’ -AGGTCCACATGGCCCCGTGG-3’ (SEQ ID NO:3))，反義鏈:5’ -AAAGGGGCCCAGAGGTCTTCCT-3’ (SEQ ID NO:4))；2 型膠原(正義鏈:5’ -AACACTGCCAACGTCCAGAT-3’ (SEQ ID NO: 5))，反義鏈:5’-AGTGGATATCGGCTA GACG-3’ (SEQ ID N0:6))；兔BMP-2 (正義鏈:5’ -TTGCTGGACACCCGGCTGAT-3’ (SEQ ID NO:7)，反義鏈:5’ -AGACCCTTACTGGTCACCTT-3’ (SEQ ID N0:8))；RhoA (正義鏈:5，-AAAAGGAACAGATTTAAGAAGT-3，(SEQ ID NO:9)，反義鏈:5’-TTTTGGAGTTCCCCTCACAGTC-3’ (SEQ ID NO:10))；Sox9 (正義鏈:5’-TTCCGTGACGTGGACATCGGC-3’ (SEQ ID NO: 11)，反義鏈:5， -AGCCTGACCCCCCTGGGGACCAG-3’ (SEQ ID NO:12));GAPDH (正義鏈:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’ (SEQ ID NO: 13)，反義鏈:5’ -GAGGCATTGCTGATGATCTTG-3’ (SEQ ID NO:14))。合成過程在FASMAC (Fasmac 公司，http: //www.fasmac.c0.jp)中完成。使用IOXRNAPCRBuffer (博光生物公司，http://shiadingQ6545.11467.com)、dNTP混合物、Taq酶(TakaRa公司，http://www.takara.com, cn),以及上述提及的引物一起，在RT PCR中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。結(jié)果:培養(yǎng)14天后，通過RT PCR結(jié)果，可見實(shí)驗(yàn)組明顯表達(dá)軟骨細(xì)胞特有的I型膠原、2型膠原，以及軟骨分化信號(hào)分子的RhoA和Sox-9，此外還明顯表達(dá)BMP-2蛋白。而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組表達(dá)不明顯(圖9)。表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞正在向軟骨分化。

4.2間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和甲苯胺藍(lán)染色轉(zhuǎn)染后14天，取細(xì)胞用PBS洗滌3次后，用4%多聚甲醛固定30分鐘。然后加入一抗(I 型膠原和 2 型膠原，均來自于 Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)培養(yǎng)24小時(shí)，再加入二抗(FITC-羊抗鼠IgG (1:100 )、Cy3_羊抗鼠IgG (1:500 ))觀察。細(xì)胞僅加入二抗的作為對(duì)照組。此外，還進(jìn)行了甲苯胺藍(lán)染色。將細(xì)胞用PBS洗滌3次后，用丙酮固定15分鐘。然后再次洗滌，并用0.1%甲苯胺藍(lán)染色。使用酒精和對(duì)二甲苯梯度脫水后光鏡下觀察。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的SMSCs在不完全軟骨培養(yǎng)基中誘導(dǎo)14天后表達(dá)1、II型膠原，且II型膠原更多，更偏向于纖維軟骨，和RT-PCR結(jié)果類似；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組由于培養(yǎng)基中仍有部分成軟骨因子，因而表達(dá)部分1、II型膠原，但表達(dá)量明顯較實(shí)驗(yàn)組少；空白對(duì)照組未表達(dá)1、II型膠原。而堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了軟骨分化過程中特有的GAG,細(xì)胞形態(tài)上也更趨向于軟骨樣細(xì)胞的多邊形，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組則沒有GAG表達(dá)，空白對(duì)照組亦無表達(dá)。說明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具備軟骨細(xì)胞特異的分泌特性。而未經(jīng)誘導(dǎo)的SMSCs則不分泌GAG (圖10)。4.3Real-Time PCR 分析 MicroRNA用Trizol抽提了 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總RNA后，培養(yǎng)10天。逆轉(zhuǎn)錄體系包含:Iyg總RNA,dNTP 混合物 2 μ I,RTlOXBuffer2 μ 1、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(λ 5 μ I 和 RNasin0.5 μ I (均來源于 Promege 公司，http://www.promega.com.cn)。弓I物設(shè)計(jì)如下:Mi 130a:5’ -GTCGTATCCAGTGCGCUCUUUUACAUUCUCUAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’ (SEQ IDNO:15)，Mi 145:
5’ -GTCGTATCCAGTGCGCAGUUUCCAGGAAUCCCUUAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’ (SEQID NO: 16).所有反應(yīng)在 Gene Amp PCR System9700 (Applied Biosysytem 公司，http://www.appliedbiosystems, com)中完成，U6 作為內(nèi)參照。29 μ L Real-Time PCR 的反應(yīng)系統(tǒng)包含:25 μ L2 X Real qPCR MasterMix (包含 Modified DNA 聚合酶、SYBR Green 1、Optimized PCR buffer,5mM MgCI2、包含 dUTP的 dNTP 混合物。均來自于 Genencor 公司，http://www.genencor.com), I μ L 正引物、IuL 逆引物(Mil30a:F5，-CGGGGCAGTGCAAATGTTAAAA-3’ (SEQ ID NO: 17)，Mil45:F5’ -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC-3’ (SEQ IDNO:18)，common:R5’ -AGTGCGAACTGTGGCGAT-3’(SEQ ID N0:19)和 2yL cDNA 模板。使用 ABISt印one Plus Real-Time PCR (ABI 公司，http: / / www.appliedbiosy stems, com)來計(jì)算 Ct 值(循環(huán)閾值)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以取得Ct平均值。差別用雙側(cè)的方差分析。組間比較采用Bonferroni法，當(dāng)P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述統(tǒng)計(jì)過程利用SAS8.02軟件完成。結(jié)果:Real-Time PCR結(jié)果提示被plentiV6-oBMP_2轉(zhuǎn)染后，SMSCs中與軟骨分化相關(guān)的MicroRNA，M1-130a和M1-145的含量均顯著升高(圖11)。對(duì)于Mi_130a，以空白對(duì)照組的SMSCs作為基線，實(shí)驗(yàn)組為plentiV6-oBMP-2 (+)，而陰性對(duì)照組為plentiV6-oBMP-2(-)0完全對(duì)照組取自正常兔半月板組織。從結(jié)果圖上可見，實(shí)驗(yàn)組為基線的7.8倍，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為1.2倍，完全對(duì)照組為15.5倍。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明F值為5822.03(P〈0.001)，表明各組間存在有差異，進(jìn)一步的Bonfeironi分解顯示，實(shí)驗(yàn)組和基線組差別小于0.05，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和基線組差別大于0.05。
對(duì)于M1-145，實(shí)驗(yàn)組為基線組的4倍，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為1.2倍，完全對(duì)照組為4.7倍。F值為135.52 (P〈0.001)，表明組間存在差異，進(jìn)一步的Bonferroni分解顯示，實(shí)驗(yàn)組和基線組差別小于0.05，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和基線組差別大于0.05。上述兩結(jié)果顯示，被plentiV6-oBMP-2轉(zhuǎn)染后，SMSCs內(nèi)的MicroRNA含量接近正常半月板組織，未轉(zhuǎn)染BMP-2組和基線組幾乎都無差別。提示BMP-2可能在向軟骨分化的過程中起關(guān) 鍵性作用。
權(quán)利要求
1.一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，包括一個(gè)將滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)的步驟；其特征在于:還包括一個(gè)構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGff-oBMP-2的步驟，一個(gè)制備轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液的步驟，一個(gè)將轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟，在所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，首先根據(jù)BMP-2基因設(shè)計(jì)引物，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)擴(kuò)增BMP-2基因，將已經(jīng)包含EGFP報(bào)告基因的pFUGW質(zhì)粒和BMP-2基因重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制備轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液的步驟中，利用所述的重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2加上包裝質(zhì)粒，共同構(gòu)建轉(zhuǎn)染慢病毒，然后再加入緩沖液培養(yǎng)、孵育、移去上清、過濾后得到轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液，在所述的將轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞和解凍的轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液混合，將混合物離心、培養(yǎng)40-52小時(shí)，然后將上述的培養(yǎng)物加入不完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)，誘導(dǎo)14天以上即可獲得軟骨細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于:在所述的制備轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液的步驟中，首先擴(kuò)增重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2、包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G，提純濃縮；其次將293T細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)至107，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)含有DMEM培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中還包含有青霉素G、鏈霉素、小牛血清、聚賴氨酸，所述的青霉素G在DMEM培養(yǎng)基中的濃度為100U/ml、所述的鏈霉素在DMEM培養(yǎng)基中的濃度為100 μ g/ml、所述的小牛血清在DMEM培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為10%、所述的聚賴氨酸DMEM培養(yǎng)基中的濃度為5%，將293T細(xì)胞于培養(yǎng)瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的緩沖液，孵育、移去上清、過濾后得到轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于:在所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，將oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel雙酶切，同時(shí)，將已經(jīng)包含EGFP報(bào)告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，然后加入T4 DNA反應(yīng)得到pFUGW-oBMP-2重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于: 在擴(kuò)增BMP-2基因的過程中，所述的5’端的引物序列如SEQID NO:1所示,所述的3’端的引物序列如SEQ ID NO:2所示。
5.如權(quán)利要求1所述的一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于:所述的不完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)液是一個(gè)含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸-抗壞血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀釋的ITS+Premix溶液的H-DMEM培養(yǎng)液；其中，在所述的H-DMEM培養(yǎng)液中，TGF-β 3的濃度為10 ng/mL、地塞米松的濃度為I X 1(Τ mol/L、2-磷酸-抗壞血酸的濃度為50 μ g/mL、脯氨酸的濃度為40 μ g/mL、丙氨酸的濃度為100 μ g/mL、所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸、牛血清白蛋白、亞油酸，在所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中，胰島素的濃度為6.25 μ g/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為6.25 μ g/mL、亞硒酸的濃度為6.25 ng/mL、牛血清白蛋白的濃度為1.25 mg/mL、亞油酸的濃度為5.35 mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明一種體外慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，包括一個(gè)將滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)的步驟，一個(gè)構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2的步驟，一個(gè)制備轉(zhuǎn)染慢病毒病毒液的步驟，一個(gè)利用轉(zhuǎn)染慢病毒病毒液轉(zhuǎn)染滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟，在制備轉(zhuǎn)染慢病毒病毒液的步驟中，利用重組質(zhì)粒pFUGW-oBMP-2和包裝質(zhì)粒共同構(gòu)成轉(zhuǎn)染慢病毒，在利用轉(zhuǎn)染慢病毒病毒液轉(zhuǎn)染滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，和轉(zhuǎn)染慢病毒的病毒液混合，然后加入不完全成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)后得到軟骨細(xì)胞。本發(fā)明證明經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染的SMSCs足夠安全，在體外可自發(fā)向軟骨分化。
文檔編號(hào)C12N15/867GK103146755SQ201310065020
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者符培亮, 張雷, 丁喆如, 吳海山, 吳宇黎, 叢銳軍, 陳松 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)