專利名稱：微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌和最小殺菌濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種測定微量抗菌物質(zhì)最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，特別是適用于陽離子抗菌肽測定的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是動物體內(nèi)一大類具有抗菌活性和免疫功能的生物活性物質(zhì)。抗菌肽具有廣譜抗菌活性和豐富的作用機制。不僅和傳統(tǒng)抗菌活性物質(zhì)一樣，具有胞內(nèi)作用機制，包括:與核酸物質(zhì)結(jié)合，阻斷DNA復(fù)制、RNA合成；影響蛋白質(zhì)合成；抑制隔膜、細胞壁合成，阻礙細胞分裂；抑制胞內(nèi)酶的活性?？咕挠绕涫顷栯x子抗菌肽有膜作用機制，目前認(rèn)為存在:“桶板”模型、“毯式”模型，“環(huán)形孔”模型和“凝聚”模型等理論。由于抗菌肽的來源天然和作用機制特殊，不易產(chǎn)生耐藥性，對人和動物的副作用小，所以備受關(guān)注，是抗生素的理想替代品。研究其菌株耐藥性、殺菌效果及其殺菌機制則尤為重要，而最小抑菌濃度和最小殺菌濃度是評價抗菌物質(zhì)抗菌效果和進一步實驗的基礎(chǔ)指標(biāo)。由于陽離子抗菌肽攜帶有正電荷，一般檢測方法使用的抗生素敏感測定培養(yǎng)基中的陽離子濃度以及所用器皿的吸附作用對檢測會造成較大影響。加之一般抗菌肽的待測樣品量微少，不能滿足一般檢測方法的需求量。所以找到一種能夠適用于陽離子抗菌肽的，檢測干擾小、微量樣品即可操作，并且在實驗過程中根據(jù)需要可以相應(yīng)調(diào)節(jié)的方法，顯得尤為迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種干擾小、微量、方便、快捷的測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法。為了解決上述 技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法，包括以下步驟:
O試劑配制
MHBCMueller Hinton Broth)培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末溶于I L蒸餾水中，121°C滅菌20 min，室溫冷卻，4 °C保存?zhèn)溆谩＂贛HB瓊脂培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末、15 g瓊脂粉溶于I L蒸餾水中，121 V滅菌20 min，倒入無菌培養(yǎng)皿中，以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底部為宜，室溫冷卻凝固，4°C保存?zhèn)溆?。③藥劑儲存?準(zhǔn)確稱取2 mg待測藥劑，用無菌水溶解至4 mg/ml,4 °C保存?zhèn)溆谩?)細菌懸液制備
①選取-80 °C保存的測試菌種的甘油菌，室溫解凍后混懸，用接種環(huán)劃線MHB瓊脂培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)12 hr，待長出單菌落后，4 °C保存?zhèn)溆?。②用接種環(huán)挑取步驟2)①中的單菌落，接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C>250rpm培養(yǎng)12 hr，待菌液渾濁后，4 °C保存?zhèn)溆?。③混懸步驟2)②中的菌液，移取50 μ I接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C >250rpm培養(yǎng)約2 hr ο④測定步驟2)③中菌液的0D600值，0D600值約為0.5時可使用。0.6〈0D600〈1.0
時，可用MHB培養(yǎng)基稀釋至適宜范圍。⑤將步驟2)④中的菌液與MHB培養(yǎng)基以30 μ 1:30 ml混合制成細菌懸液，制備好的細菌懸液應(yīng)在30 min內(nèi)使用完畢。3)細菌懸液計數(shù)
①步驟2)⑤中的細菌懸液與MHB培養(yǎng)基以10 μ 1:90 μ I混合稀釋，連續(xù)4次，分別得到10、10~2、10~3和 10~4倍稀釋細菌懸液。②取I塊MHB瓊脂培養(yǎng)基(提前2 hr在37 °C培養(yǎng)箱中緩解)，記號筆在底部外側(cè)畫十字分為4個相等扇區(qū)。從步驟3)①中的10、10~2、10~3和10~4等4個濃度稀釋梯度細菌懸液中移10 μ I滴加在MHB瓊脂培養(yǎng)基標(biāo)記好的對應(yīng)扇區(qū)，每個梯度3個重復(fù)。③待步驟3)②中的細菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr，選取3個重復(fù)菌落總數(shù)為3(Γ200的扇區(qū)計數(shù)，計算CFU=3個重復(fù)菌落總數(shù)/30 X稀釋倍數(shù)X 1000，CFU值在0.5 lX10~6/ml 為宜。4)藥劑稀釋
取I塊未經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，第I列每孔加入32 μ I步驟I)③中的藥劑儲存液和168 μ I無菌水，終濃度為640 μ g/ml。第2 10列每孔加入100 μ I無菌水。從第I列起移取100 μ I加入次列，如此逐級等比稀釋至第10列，第10列移去100μ I。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10個濃度梯度，每孔100 μ 1，現(xiàn)用現(xiàn)配。5)最小抑菌濃度(MIC)的測定
①取I塊未經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，每行作為I個測試，第f 10列每孔加入90 μ I細菌懸液，第11列加入100 μ I細菌懸液作為有菌對照，第12列加入100μ I MHB培養(yǎng)基作為無菌對照。②從步驟4)中的藥劑稀釋板移取10 μ I稀釋藥劑加入步驟5)①中96孔板對應(yīng)的孔中，終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25和0.125 μ g/ml以及有菌和無菌對照，終體積100 μ I。每種藥劑對每種細菌進行3次重復(fù)測試。③步驟5)②中的96孔板用保鮮膜包好，放入濕盒(置于容器中覆蓋濕潤紗布即可)，37 °C培養(yǎng)12 hr。肉眼無可見細菌沉淀的孔所對應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小抑菌濃度(MIC)。6)最小殺菌濃度(MBC)的測定
①MHB瓊脂培養(yǎng)基提前2 hr在37 °C培養(yǎng)箱中緩解，記號筆在底部外側(cè)畫十字分為4個相等扇區(qū)。②從步驟5)③中最小抑菌濃度對應(yīng)的孔起，向高濃度選取4個濃度梯度，每個濃度梯度取 ο μ I滴加在步驟6)①中MHB瓊脂平板對應(yīng)扇區(qū)，做好標(biāo)記，每個梯度3個重復(fù)。待細菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr。肉眼無菌落生長的扇區(qū)所對應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小殺菌濃度(MBC)。
作為本發(fā)明的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法的改進:1)使用非陽離子調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，或者說是低陽離子培養(yǎng)基。作為本發(fā)明的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法的改進:4)和5)使用未經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板。本發(fā)明中，待測藥劑是各類具有抗菌活性的物質(zhì)，特別是陽離子抗菌肽。本發(fā)明方法的檢測結(jié)果表明:測試方法能夠滿足微量抗菌活性物質(zhì)的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定的需求，結(jié)果重復(fù)性好。本發(fā)明具有如下有益效果:
I可以微量測定，滿足抗菌活性物質(zhì)樣品少時的測定需求，2 mg即可測定，且節(jié)約試 劑。2可以測定陽離子抗菌肽，排除了反應(yīng)體系中陽離子的干擾，以及96孔板對陽離子抗菌肽的吸附作用。3本方法操作簡便，所用設(shè)備簡單常見，所用試劑經(jīng)濟實惠，方法簡單易行。


圖1是細菌懸液計數(shù)滴板培養(yǎng)后培養(yǎng)皿照片。圖2是藥劑稀釋及與細菌懸液混合鋪96孔板的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步的說明。實施例1
2012年9月18日，測定抗菌肽PR-39和抗生素金霉素、新霉素及硫酸粘菌素對大腸桿菌CMCC 44103和ATCC 25922的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。)試劑配制
①MHB培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末(BD Difco，貨號275730 )溶于I L蒸餾水中，121°C滅菌20 min，室溫冷卻，4 °C保存?zhèn)溆?。②MHB瓊脂培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末、15 g瓊脂粉溶于I L蒸餾水中，121 V滅菌20 min，倒入無菌培養(yǎng)皿中，以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底部為宜，室溫冷卻凝固，4°C保存?zhèn)溆谩＂鬯巹﹥Υ嬉?準(zhǔn)確稱取2 mg待測藥劑，用無菌水溶解至4 mg/ml,4 °C保存?zhèn)溆谩?細菌懸液制備
①選取-80 °C保存的甘油菌，室溫解凍后混懸，用接種環(huán)劃線MHB瓊脂培養(yǎng)基，37 V培養(yǎng)12 hr，待長出單菌落后，4 °C保存?zhèn)溆?。②用接種環(huán)挑取步驟2)①中的單菌落，接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C>250rpm培養(yǎng)12 hr，待菌液渾濁后，4 °C保存?zhèn)溆?。③混懸步驟2)②中的菌液，移取50 μ I接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C >250rpm培養(yǎng)約2 hr ο④測定步驟2)③中菌液的0D600值，大腸桿菌CMCC 44103的0D600值為0.456，大腸桿菌A細胞培養(yǎng)C 25922的0D600值為0.476。⑤將步驟2)④中的菌液與MHB培養(yǎng)基以30 μ 1:30 ml混合制成細菌懸液，制備好的細菌懸液應(yīng)在30 min內(nèi)使用完畢。)細菌懸液計數(shù)
①步驟2)⑤中的細菌懸液與MHB培養(yǎng)基以10 μ 1:90 μ I混合稀釋，連續(xù)4次，分別得到10、10~2、10~3和10~4倍稀釋細菌懸液。②取I塊MHB瓊脂培養(yǎng)基(提前2 hr在37 °C培養(yǎng)箱中緩解)，記號筆在底部外側(cè)畫十字分為4個相等扇區(qū)。從步驟3)①中的10、10~2、10~3和10~4等4個濃度稀釋梯度細菌懸液中移10 μ I滴加在MHB瓊脂培養(yǎng)基標(biāo)記好的對應(yīng)扇區(qū)，每個梯度3個重復(fù)。方法如圖1所示。③待步驟3)②中的細菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr，選取3個重復(fù)菌落總數(shù)為3(Γ200的扇區(qū)計數(shù)，計算CFU=3個重復(fù)菌落總數(shù)/30 X稀釋倍數(shù)X 1000，CFU值在
0.5 I X 10~6/ml為宜。結(jié)果如下表I所示:
表 I _____
權(quán)利要求
1.一種微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法，其特征在于，包括以下步驟: `1)試劑配制:配制MuellerHinton Broth培養(yǎng)基； `2)細菌懸液制備:培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期，制備細菌懸液； `3)細菌懸液計數(shù):倍比稀釋所述的步驟2)中的細菌懸液后滴板計數(shù)； `4)陽離子抗菌肽稀釋:倍比稀釋陽離子抗菌肽至不同測試濃度梯度； `5)測定最小抑菌濃度:將所述的步驟4)中的不同測試濃度梯度的陽離子抗菌肽與步驟2)中制備的細菌懸液混合后培養(yǎng)，觀察是否有肉眼可見的細菌沉淀，無肉眼可見細菌沉淀的孔對應(yīng)的最小濃度即為最小抑菌濃度； `6)測定最小殺菌濃度:將所述的步驟5)中有抑菌效果的測試滴板后培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長無菌落 生長扇區(qū)對應(yīng)的最小濃度即為最小殺菌濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟I)中的試劑配制過程如下: `1.1)MHB培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末溶于I L蒸餾水中，121 °C滅菌20 min，室溫冷卻，4 1:保存?zhèn)溆茫? `1.2)MHB瓊脂培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末、15 g瓊脂粉溶于I L蒸餾水中，121 V滅菌20 min，倒入無菌培養(yǎng)皿中，以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底部為宜，室溫冷卻凝固，4°C保存?zhèn)溆茫? `1.3)藥劑儲存液:準(zhǔn)確稱取2mg待測藥劑，用無菌水溶解至4 mg/ml, 4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟2)中細菌懸液制備過程如下: `2.1)選取-80 °C保存的測試菌種的甘油菌，室溫解凍后混懸，用接種環(huán)劃線MHB瓊脂培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)12 hr，待長出單菌落后，4 1:保存?zhèn)溆茫? `2.2)用接種環(huán)挑取步驟2.1)中的單菌落，接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C>250rpm培養(yǎng)12 hr，待菌液渾濁后，4 1:保存?zhèn)溆茫? `2.3)混懸步驟2.2)中的菌液，移取50 μ I接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C >250rpm培養(yǎng)約2 hr ； `2.4)測定步驟2.3)中菌液的0D600值，0D600值約為0.5時可使用，0.6<0D600<1.0時，可用MHB培養(yǎng)基稀釋至適宜范圍； `2.5)將步驟2.4)中的菌液與MHB培養(yǎng)基以30 μ 1:30 ml混合制成細菌懸液，制備好的細菌懸液應(yīng)在30 min內(nèi)使用完畢。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟3)中細菌懸液計數(shù)過程如下: `3.1)所述的2.5)中的細菌懸液與MHB培養(yǎng)基以10 μ 1:90 μ I混合稀釋，連續(xù)4次，分別得到10、10~2、10~3和10~4倍稀釋細菌懸液； `3.2)取I塊MHB瓊脂培養(yǎng)基，記號筆在底部外側(cè)畫十字分為4個相等扇區(qū)，從步驟3.1)中的10、10~2、10~3和10~4等4個濃度稀釋梯度細菌懸液中移10 μ I滴加在MHB瓊脂培養(yǎng)基標(biāo)記好的對應(yīng)扇區(qū)，每個梯度3個重復(fù)； `3.3)待步驟3.2)中的細菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr，選取3個重復(fù)菌落總數(shù)為3(Γ200的扇區(qū)計數(shù)，計算CFU=3個重復(fù)菌落總數(shù)/30 X稀釋倍數(shù)X 1000，CFU值在·0.5 lX10~6/ml 為宜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟4)中藥劑稀釋過程如下: 取I塊未經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，第I列每孔加入32 μ I步驟1.3)中的藥劑儲存液和168 μ 1無菌水，終濃度為640 μ g/ml ;第2 10列每孔加入100 μ I無菌水-J人第I列起移取100 μ 1加入次列，如此逐級等比稀釋至第10列，第10列移去100μ I ;得至IJ 640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 共 10 個濃度梯度，每孔 100 μ 1，現(xiàn)用現(xiàn)配。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟5)中最小抑菌濃度的測定過程如下: 5.1)取I塊未經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，每行作為I個測試，第f 10列每孔加入90 μ I細菌懸液，第11列加入100 μ I細菌懸液作為有菌對照，第12列加入100μ I MHB培養(yǎng)基作為無菌對照； 5.2)從步驟4)中的藥劑稀釋板移取10 μ I稀釋藥劑加入步驟5.1)中96孔板對應(yīng)的孔中，終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25和0.125 μ g/ml以及有菌和無菌對照，終體積100 μ I ;每種藥劑對每種細菌進行3次重復(fù)測試； 5.3)步驟5.2)中的96孔板用保鮮膜包好，放入濕盒(置于容器中覆蓋濕潤紗布即可)，37 °C培養(yǎng)12 hr，肉眼無可見細菌沉淀的孔所對應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小抑菌濃度(MIC)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟6)中最小殺菌濃度的測定過程如下: 6.1) MHB瓊脂培養(yǎng)基提前2 hr在37 1:培養(yǎng)箱中緩解，記號筆在底部外側(cè)畫十字分為4個相等扇區(qū)； 6.2)從步驟5.3)中最小抑菌濃度對應(yīng)的孔起，向高濃度選取4個濃度梯度，每個濃度梯度取10 μ I滴加在步驟6.1)中MHB瓊脂平板對應(yīng)扇區(qū)，做好標(biāo)記，每個梯度3個重復(fù)；待細菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr ;肉眼無菌落生長的扇區(qū)所對應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小殺菌濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟4)和步驟4) 5)使用未經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微量測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法，包括以下步驟1)試劑配制配制MHB培養(yǎng)基；2)細菌懸液制備復(fù)蘇細菌至對數(shù)生長期，制備濃度一定的細菌懸液；3)細菌懸液計數(shù)倍比稀釋步驟2)中的細菌懸液后滴板計數(shù)；4)藥劑稀釋倍比稀釋藥劑至不同測試濃度梯度；5)測定最小抑菌濃度將步驟4)中稀釋好的藥劑與步驟2)中制備的細菌懸液混合后培養(yǎng)，觀察是否有肉眼可見的細菌沉淀；6)測定最小殺菌濃度將步驟5)中有抑菌效果的測試滴板后培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長。采用該方法測定陽離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度具有干擾小、微量、方便、快捷的特點。
文檔編號C12Q1/18GK103173517SQ20131006581
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者汪以真, 李治學(xué), 韓菲菲, 黃霞, 劉丹 申請人:浙江大學(xué)