專利名稱：一種含有abcb1基因3′utr序列和報(bào)告基因的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)控靶基因的microRNA的篩選，具體地說，是一種含有ABCBl基因3' UTR序列和報(bào)告基因的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法和用途。
背景技術(shù)：
對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是當(dāng)今腫瘤治療的一大難題。腫瘤的多藥耐藥(mult1-drug resistance, MDR)是指腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸某一化療藥物,不僅對(duì)此種化療藥物產(chǎn)生耐藥性,而且對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象。自從化療藥物開始應(yīng)用于腫瘤的治療后，就一直伴隨著多藥耐藥的發(fā)生，因此怎樣逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥一直以來(lái)都被認(rèn)為是與臨床結(jié)合最為密切的研究方向。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，復(fù)雜的腫瘤耐藥機(jī)制研究已由單純的病理生理學(xué)轉(zhuǎn)向分子病理學(xué)范疇，耐藥基因的表達(dá)增加已經(jīng)被肯定 與腫瘤的耐藥性有明顯的關(guān)系。研究表明ABCBl (MDRl)基因編碼的P糖蛋白(P-glucoprotein, P-gp)在多藥耐藥中起著主要作用，主要作用機(jī)理是能量依賴性地將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出腫瘤細(xì)胞，減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，導(dǎo)致MDR。P-gp是一種分子量為170kd的跨膜糖蛋白，由1280個(gè)氨基酸殘基組成，具有12個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)細(xì)胞內(nèi)ATP連結(jié)點(diǎn)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸抗癌藥物時(shí)，ABCBl基因被誘導(dǎo)擴(kuò)增，P-gp被大量表達(dá)，當(dāng)腫瘤藥物再次與P-gp結(jié)合時(shí)，其ATP結(jié)合點(diǎn)上連接的ATP水解后釋放的能量能將抗癌藥物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)蓄積藥物減少，減少作用靶點(diǎn)部位的藥物濃度，導(dǎo)致化學(xué)治療的效果下降乃至消失。人ABCBl基因位于7號(hào)染色體的7q21.1，含有28個(gè)外顯子，其cDNA全長(zhǎng)4.5kb，含有一個(gè)開放閱讀框架(ORF)，基因啟動(dòng)子包含:CAAT盒的同感序列、GC盒樣序列、Y-box (反向CCAAT元件)、HSE (熱休克元件)、P53元件、AP-1元件、TCF元件、類固醇異種生物受體元件、C/ΕΒΡ元件和起始元件。此外,還含有增強(qiáng)子等元件與hmdrl基因的組織特異性表達(dá)有關(guān)，但無(wú)TATA盒。ABCBl表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，與大多數(shù)細(xì)胞和病毒無(wú)TATA盒啟動(dòng)子的基因調(diào)控相似，與ABCBl轉(zhuǎn)錄起始序列GC盒、Y盒、CCAAT盒、HSE和AP-1等結(jié)合的轉(zhuǎn)錄。非編碼小RNA (microRNA，miRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為22-28個(gè)核苷酸，廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，是最大的基因家族之一，約占整個(gè)基因組的1%-4%。目前，人類基因組中確認(rèn)的miRNA約500個(gè)，至少有200多種與癌癥的發(fā)生有關(guān)，不少miRNA可能扮演著癌基因和抑癌基因的角色。由于miRNA作用靶點(diǎn)是基因的3’ UTR區(qū)域，因此基因的3’ UTR的改變程度能夠直接指示該基因受到miRNA的調(diào)控程度。有研究發(fā)現(xiàn)，不同miRNA對(duì)多藥耐藥基因3’ UTR區(qū)域的影響也不同，而多藥耐藥基因3’ UTR區(qū)域mRNA的變化又直接影響該基因的改變程度，最終該耐藥基因的變化直接影響耐藥性。因此通過修復(fù)microRNAs的表達(dá)，改變耐藥基因的表達(dá)，已成為通過基因調(diào)控逆轉(zhuǎn)耐藥的重要方向之一。然而，由于microRNAs的發(fā)現(xiàn)始于本世紀(jì)初,而microRNAs與MDR的研究更是尚處于起步階段，一些問題仍限制其應(yīng)用和發(fā)展。例如:如何準(zhǔn)確預(yù)測(cè)調(diào)控靶基因的microRNAs，如何提高microRNAs檢測(cè)的靈敏度和特異性等，這對(duì)于基因調(diào)控逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物研發(fā)具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種含有上述質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一的目的是，提供一種上述質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種上述質(zhì)粒載體的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是: 一種質(zhì)粒載體，所述的質(zhì)粒載體是在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體的第6832-7349bp區(qū)段內(nèi)插入了人ABCBl基因的Y UTR序列。
優(yōu)選的，所述的人ABCBl基因的3' UTR序列插入在pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體的sacl和xhol限制性酶切位點(diǎn)之間。
優(yōu)選的，所 述的質(zhì)粒載體是通過以下方法構(gòu)建的:a)克隆或人工合成兩端帶sacl和xhol限制性酶切位點(diǎn)的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性內(nèi)切酶雙酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體，回收大片段； c)使用連接酶連接步驟a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步驟b)所述的大片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。
所述的人ABCBl基因的3' UTR序列包含下述核苷酸序列: a)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列；和/或 b)與SEQID N0.3所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是: 一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞包含有如上任一所述的質(zhì)粒載體。
優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞是人腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT116/L-0HP。
為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是: 一種如上所述的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，所述的方法包括下列步驟:a)克隆或人工合成兩端帶sacl和xhol限制性酶切位點(diǎn)的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性內(nèi)切酶雙酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體，回收大片段； c)使用連接酶連接步驟a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步驟b)所述的大片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。
為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是: 如上任一所述的質(zhì)粒載體在篩選調(diào)控人ABCBl基因3 ^ UTR序列的microRNA中的用途； 如上任一所述的質(zhì)粒載體在篩選抑制人P糖蛋白表達(dá)的microRNA中的用途；如上任一所述的質(zhì)粒載體在篩選多藥耐藥相關(guān)microRNA中的用途。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明成功構(gòu)建了含有人ABCBl基因3’UTR序列和雙熒光報(bào)告基因的質(zhì)粒載體，將人ABCBl基因3’UTR序列插入到luc2基因的下游區(qū)段，使得人ABCBl基因3’UTR序列能直接影響luc2基因的表達(dá)。因此將該載體連同待測(cè)試microRNA共轉(zhuǎn)染多藥耐藥細(xì)胞株，觀察雙熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)情況，可以確定待測(cè)試microRNA對(duì)人ABCBl基因3’ UTR序列的作用，進(jìn)而用于篩選調(diào)控人ABCBl基因3’ UTR表達(dá)的microRNA。因此，本發(fā)明為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)調(diào)控人ABCBl基因3’UTR表達(dá)的microRNA提供了一種快速、高效、簡(jiǎn)單易行的方法，進(jìn)而為提高miCToRNA檢測(cè)的靈敏度和特異性，以及研發(fā)和檢測(cè)通過基因調(diào)控逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的藥物開辟了新的途徑。


圖1是PMD18T載體圖譜。
圖2為ABCBl基因3’UTR序列的克隆其PCR產(chǎn)物的電泳圖譜，其中Maker為DL2000,1 和 2 均為 ABCBl 基因的 3’ UTR 片段(379bp)。
圖3是pmirGLO Dual-Luciferase-promoter雙突光報(bào)告基因載體圖譜。
圖4 為 pmirGL0-ABCBl-3’ UTR-promoter 重組質(zhì)粒的 seal 和 xhol 雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜，其中 Maker 為 DL10000，1、2、3 均為 pmirGLO-ABCBl-3’ UTR-promoter 雙酶切產(chǎn)物。
圖5 為 pmirGL0-ABCBl-3’ UTR-promoter 重組質(zhì)粒 3’ UTR 片段測(cè)序結(jié)果與 NCBI 公布的ABCBl基因的3’ UTR序列進(jìn)行Blast分析的序列比對(duì)圖。
圖6是在細(xì)胞中檢測(cè)microRNA minics對(duì)于ABCBl基因3’ UTR影響獲得的雙熒光素酶活性柱狀圖。每組中數(shù)字含義為:1.轉(zhuǎn)染microRNA mimics的對(duì)照組,2.hsa_miR-200amimics/ 質(zhì)粒組,3.hsa-miR-497 mimics/ 質(zhì)粒組,4.hsa_miR-200c mimics/ 質(zhì)粒組。
圖7是篩選出的對(duì)于ABCBl基因有抑制作用的microRNA minics的westernblot雜交圖譜。圖中，I為空白對(duì)照組，2為轉(zhuǎn)染microRNA mimics的對(duì)照組，3為hsa-miR-497mimics 組,4 為 hsa_miR-200c mimics 組。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。
實(shí)施例1構(gòu)建含ABCBl基因3’ UTR序列和報(bào)告基因的重組T載體 一、材料 1.質(zhì)粒 PMD18T載體質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，其載體圖譜如圖1所示。
2.主要試劑 限制性內(nèi)切酶seal和xhol，以及DNA Ligation Kit (DNA連接試劑盒)購(gòu)自TaKaRa公司。DL2000 maker購(gòu)自上海MajorBio公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KenReal公司。質(zhì)粒提取試劑盒和DNA片段回收試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。
二、方法與結(jié)果 1.血樣采集和基因組DNA抽提 米集健康志愿者外周血5mL,置于EDTA抗凝的玻璃試管,I&存于-40°C冰箱備用。按照標(biāo)準(zhǔn)苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，置于4°C冰箱備用。
2.ABCBl 基因的 PCR 擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì):根據(jù)人ABCBl基因的3’UTR序列(NCBI的gene ID: 5243)設(shè)計(jì)兩端引物:引物I和引物2。
引物I為上游5’端引物，其中包含27個(gè)ABCBl基因的3’UTR序列互補(bǔ)堿基，一個(gè)seal識(shí)別位點(diǎn)，6個(gè)保護(hù)堿基；引物2為下游3’端引物，其中包含28個(gè)ABCBI基因的3’ UTR序列互補(bǔ)堿基，一個(gè)xhol識(shí)別位點(diǎn)，6個(gè)保護(hù)堿基。具體引物序列如下:
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒載體，其特征在于，所述的質(zhì)粒載體是在pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體的第6832_7349bp區(qū)段內(nèi)插入了人ABCBl基因的3' UTR序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于，所述的人ABCBl基因的3'UTR序列插入在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體的sacl和xhol限制性酶切位點(diǎn)之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒載體，其特征在于，所述的質(zhì)粒載體是通過以下方法構(gòu)建的: a)克隆或人工合成兩端帶sacl和xhol限制性酶切位點(diǎn)的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性內(nèi)切酶雙酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體，回收大片段； c)使用連接酶連接步驟a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步驟b)所述的大片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的質(zhì)粒載體，其特征在于，所述的人ABCBl基因的3' UTR序列包含下述核苷酸序列: a)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列；和/或 b)與SEQID N0.3所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
5.—種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞包含有如權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是人腸癌多藥耐藥細(xì)胞株 HCT116/L-0HP。
7.—種權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的方法包括下列步驟: a)克隆或人工合成兩端帶sacl和xhol限制性酶切位點(diǎn)的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性內(nèi)切酶雙酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體，回收大片段； c)使用連接酶連接步驟a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步驟b)所述的大片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1-3任一所述的質(zhì)粒載體在篩選調(diào)控人ABCBl基因3'UTR序列表達(dá)的microRNA中的用途。
9.權(quán)利要求1-3任一所述的質(zhì)粒載體在篩選抑制人P糖蛋白表達(dá)的microRNA中的用途。
10.權(quán)利要求1-3任一所述的質(zhì)粒載體在篩選多藥耐藥相關(guān)microRNA中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體，所述的質(zhì)粒載體是在pmirGLODual-Luciferase-promoter質(zhì)粒載體的第6832-7349bp區(qū)段內(nèi)插入了人ABCB1基因的3′UTR序列。本發(fā)明還涉及含有上述載體的宿主細(xì)胞、上述載體的構(gòu)建方法及其在篩選多藥耐藥相關(guān)microRNA中的用途。本發(fā)明為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)調(diào)控人ABCB1基因表達(dá)的microRNA提供了一種快速、高效、簡(jiǎn)單易行的方法，進(jìn)而為提高microRNA檢測(cè)的靈敏度和特異性，以及研發(fā)和檢測(cè)通過基因調(diào)控逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的藥物開辟了新的途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173481SQ201310065889
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者朱惠蓉, 李琦, 隋華, 殷佩浩, 王炎, 潘樹芳, 靳寶輝, 孫建, 王一斐, 范忠澤 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院, 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院