專利名稱：特應(yīng)性皮炎標記物及其利用技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特應(yīng)性皮炎標記物及其利用技術(shù)。
背景技術(shù)：
特應(yīng)性皮炎因遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素而引發(fā)疾病，其機理尚不明確。目前因特應(yīng)性皮炎主要通過肉眼觀察進行診斷，在臨床醫(yī)學上帶有主觀意識，因此缺乏客觀性。特別是在特應(yīng)性皮炎中，要判斷決定治療方法的皮疹的嚴重度是非常難的課題。還因為社會上對常用于特應(yīng)性皮炎治療的巨大支柱類固醇外用劑的忌諱潮流日趨強烈，所以希望有適合的治療方法及合適的藥量。因此，探索作為病情惡化、改善指標、治療效果的表現(xiàn)的可將特應(yīng)性皮炎嚴重度分類的特應(yīng)性皮炎標記物是十分重要的課題。目前,特應(yīng)性皮炎標記物使用IgE。但是,顯示IgE的抗體效價上升的疾病除特應(yīng)性皮炎以外，還有支氣管哮喘、肝硬化等，所以即使IgE的抗體值呈現(xiàn)高值，也未必就一定與特應(yīng)性皮炎有關(guān)。最近有一新見解，指出因SCCAl在特應(yīng)性皮炎患者的皮膚、血液中表達增高，所以可作為新型生物標記物(非專利文獻I)。還有關(guān)于NGF、P物質(zhì)(Substance P)、IL-16等作為特應(yīng)性皮炎患者的血清標記物非常有效的報道(非專利文獻2及3)。此外還有使用特應(yīng)性皮炎的炎癥部位和非炎癥部位的皮膚，對特應(yīng)性皮炎的生物標記物進行全面調(diào)查的方法。例如，基于使用DNA微陣列的基因表達分析，鑒定特應(yīng)性皮炎關(guān)連基因的疾病標記物已申請了專利(專利文獻I及2)。另外，還有如下報道，培養(yǎng)從特應(yīng)性皮炎患者的皮膚組織中獲取的表皮角化細胞、纖維芽細胞后，從細胞中提取蛋白質(zhì)，通過二維電泳分離后，用質(zhì)譜儀鑒定特應(yīng)性皮炎標記物(非專利文獻4及5)。但是，至今為止還沒有使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠皮膚組織中的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)組分析的先例。且對人體的特應(yīng)性皮炎進行的蛋白質(zhì)組分析，是從皮膚采集細胞，在初代培養(yǎng)后進行蛋白質(zhì)組分析，所以很難說能立即反映人體的特應(yīng)性皮炎的狀況。專利文獻1:日本特開2005-110602號公報專利文獻2:國際公開第W O 01-065259號pamphlet非專利文獻1: Clin.Exp.Allergy2005 ; 35:1327-1333非專利文獻2: Br.J.Dermatol.2002Jul; 147 (I):71-79非專利文獻3:Br.J.Dermatol.2006Jun; 154 (6): 1112-1117
非專利文獻 4: Proteomics2004,4，3446-3455非專利文獻 5:Proteomics2006，6，1362-1370
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供作為特應(yīng)性皮炎的客觀性標記物而在診斷及治療中有效的物質(zhì)。且本發(fā)明的目的還是提供利用特應(yīng)性皮炎標記物，篩選對特應(yīng)性皮炎的預(yù)防或治療有效的成分的方法。本發(fā)明者對特應(yīng)性皮炎模型小鼠(NC/Nga小鼠)涂布半抗原，人為誘發(fā)特應(yīng)性皮炎。同時進行已知抑制特應(yīng)性皮炎的乳鐵蛋白處理來抑制炎癥。使用此時的皮膚組織測定因特應(yīng)性皮炎發(fā)病而發(fā)生變化的蛋白質(zhì)。分析方法為使用二維電泳(2-DE)和質(zhì)譜(MS)進行蛋白質(zhì)組分析，對于經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)進一步用免疫印跡法確認其變化。其結(jié)果，作為伴隨特應(yīng)性皮炎發(fā)病其表達增加的蛋白質(zhì)，鑒定出FABP-5、載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、波形蛋白(Vimentin)、Rho GDI等。另外,作為伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達減少的蛋白質(zhì)，鑒定出半乳糖凝集素-1、-3、-4、-7、-8 (Galectin-1、-3、-4、-7、-8)等的半乳糖凝集素(Galectin)類、為細胞骨架蛋白的結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、還有膜聯(lián)蛋白II (Annexin II)、烯醇酶I (Enolasel)、FABP-4、PARK7、HSP70、HSP90等。這些蛋白質(zhì)的大多數(shù)在進行半抗原處理后再進行乳鐵蛋白處理時顯示出相反的變化，表明特應(yīng)性皮炎有無發(fā)病與表達的增減有良好的相關(guān)性。而且，為分析如前所述發(fā)現(xiàn)的特應(yīng)性皮炎標記物與人體特應(yīng)性皮炎炎癥程度之間的相關(guān)性，從特應(yīng)性皮炎發(fā)病者及健康的志愿者身上使用可非侵襲地、安全、簡便地采集角質(zhì)層的角質(zhì)測試儀(checker)采集角質(zhì)層，從中提取蛋白質(zhì),通過Western印跡法測定特應(yīng)性皮炎標記物的表達。其結(jié)果，證實了伴隨特應(yīng)性皮炎炎癥程度的增加，血清白蛋白(Serum albumin)、免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G)、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP_5、烯醇酶 I (Enolasel)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)的表達也增加。另外，作為伴隨特應(yīng)性皮炎炎癥程度的增加其表達減少的蛋白質(zhì)，鑒定出精氨酸酶 I (Arginase I)、尿卩密唳 DNA 糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase)。本發(fā)明的主要內(nèi)容如下。1.判定特應(yīng)性皮炎的方法，其包括測定皮膚細胞及/或皮膚組織中下述特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達，所述方法中，所述特定蛋白質(zhì)伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變。特定蛋白質(zhì)有以下23種:(I)從半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素_3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4(Galectin_4)、半乳糖凝集素_7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)所組成的Galectin組中選擇的蛋白質(zhì)，(2)從HSP70、HSP90所組成的HSP組中選擇的蛋白質(zhì)，(3)從波形蛋白(Vimentin)、Rho⑶1、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)所組成的細胞骨架蛋白組中選擇的蛋白質(zhì)，(4)從FABP-4、FABP-5所組成的FABP組中選擇的蛋白質(zhì)，(5)此外還有血清白蛋白(Serum albumin)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、載脂蛋白 Al (Apolipoprotein Al)、烯醇酶 I (Enolase I)、PARK7、精氨酸酶 I (Arginase I)、尿卩密唳 DNA 糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)。2.1.中所述的方法，其中，皮膚細胞及/或皮膚組織是用角質(zhì)測試儀采集的皮膚的角質(zhì)層。3.1.中所述的方法，其在蛋白質(zhì)水平上測定特定蛋白質(zhì)的表達。4.1.中所述的方法，其在RNA水平上測定特定蛋白質(zhì)的基因表達。5.用于判定特應(yīng)性皮炎的試劑盒，其包含對于皮膚細胞及/或皮膚組織中的下述特定蛋白質(zhì)，測定伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的所述特定蛋白質(zhì)的表達的試劑。特定蛋白質(zhì)有以下23種:(I)從半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素_3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4(Galectin_4)、半乳糖凝集素_7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)所組成的Galectin組中選擇的蛋白質(zhì)，(2)從HSP70、HSP90所組成的HSP組中選擇的蛋白質(zhì)，(3)從波形蛋白(Vimentin)、Rho⑶1、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)所組成的細胞骨架蛋白組中選擇的蛋白質(zhì)，(4)從FABP-4、FABP-5所組成的FABP組中選擇的蛋白質(zhì)，(5)此外還有血清白蛋白(Serum albumin)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、載脂蛋白 Al (Apolipoprotein Al)、烯醇酶 I (Enolase I)、PARK7、精氨酸酶 I (Arginase I)、尿卩密唳 DNA 糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)。6.5.中所述的試劑盒，其具備用于采集皮膚細胞及/或皮膚組織的角質(zhì)測試儀。7.5.中所述的試劑盒，其中，試劑為可特異性識別伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的抗體。8.5.中所述的試劑盒，其中，試劑為可與伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的mRNA特異性雜交的核酸探針。9.5.中所述的試劑盒，其中，試劑為可與伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的mRNA特異性雜交的核酸引物、及可與以所述mRNA為模板合成的cDNA特異性雜交的核酸引物所組成的I對核酸引物。10.鑒定對治療及/或預(yù)防特應(yīng)性皮炎有作用的物質(zhì)的方法，其包括以下工序:(a)使皮膚細胞及/或皮膚組織與被測物質(zhì)接觸的工序，(b)在規(guī)定時間內(nèi)培養(yǎng)工序(a)中與被測物質(zhì)接觸過的皮膚細胞及/或皮膚組織的工序，(C)測定工序(b)中培養(yǎng)的皮膚細胞及/或皮膚組織中下述特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達的工序，所述工序中，所述特定蛋白質(zhì)伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變，以及(d)通過比較工序(C)中測定的特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達和對照的皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達，評價被測物質(zhì)對于皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達的作用的工序。特定蛋白質(zhì)有以下23種:(I)從半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素_3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4(Galectin_4)、半乳糖凝集素_7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)所組成的Galectin組中選擇的蛋白質(zhì)，
(2)從HSP70、HSP90所組成的HSP組中選擇的蛋白質(zhì)，(3)從波形蛋白(Vimentin)、Rho⑶1、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)所組成的細胞骨架蛋白組中選擇的蛋白質(zhì)，(4) FABP-4、FABP-5所組成的FABP組中選擇的蛋白質(zhì)，(5)此外還有血清白蛋白(Serum albumin)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、載脂蛋白 Al (Apolipoprotein Al)、烯醇酶 I (Enolasel)、PARK7、精氨酸酶 I (Arginase I)、尿卩密唳 DNA 糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)。通過本發(fā)明，可確立特應(yīng)性皮炎的診斷及測定其嚴重度的評價系統(tǒng)。使用此評價系統(tǒng)，與以往方法相比，可更客觀地判定特應(yīng)性皮炎的嚴重度及發(fā)病風險。此外，本發(fā)明還提供用于判定特應(yīng)性皮炎的嚴重度及發(fā)病風險的試劑盒及鑒定具有抑制特應(yīng)性皮炎炎癥作用的成分的方法。


圖1表示使用4種實驗條件((I)半抗原(_)/乳鐵蛋白㈠、(2)半抗原(_)/乳鐵蛋白(+)、⑶半抗原(+)/乳鐵蛋白(_)、⑷半抗原(+)/乳鐵蛋白(+))的小鼠皮膚的狀態(tài)。圖2(a)表示使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠的皮膚組織進行二維電泳的結(jié)果(半抗原(_)/乳鐵蛋白(_)及半抗原(+)/乳鐵蛋白(_)的實驗條件)。圖2(b)表示使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠的皮膚組織進行二維電泳的結(jié)果(半抗原(_)/乳鐵蛋白(+)及半抗原(+)/乳鐵蛋白(+)的實驗條件)。圖3表示特應(yīng)性皮炎模型小鼠的皮膚組織中半乳糖凝集素的表達變化。圖4表示特應(yīng)性皮炎模型小鼠的皮膚組織中細胞骨架蛋白及HSP蛋白質(zhì)的表達變化。圖5表示特應(yīng)性皮炎模型小鼠的皮膚組織中蛋白質(zhì)的表達變化。圖6表示對特應(yīng)性皮炎發(fā)病的樣品中表達增加的蛋白質(zhì)使用質(zhì)譜儀(MALDIT0F-MS)鑒定的結(jié)果。圖7表示特應(yīng)性皮炎患者的皮膚組織中蛋白質(zhì)的表達變化。圖8(a) (b)表示特應(yīng)性皮炎患者的嚴重度與蛋白質(zhì)表達量的相關(guān)關(guān)系。圖9 (a) (b)表示按患者的嚴重度不同將對烯醇酶I (Enolasel)、FABP_5、SCCA2、載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、血清白蛋白(Serum albumin)的各5種標記物蛋白質(zhì)在各樣品中的表達強度定量的結(jié)果進行歸納。圖10(a)_(f)表不健康者和有特應(yīng)性皮炎病史的人中經(jīng)皮水分喪失量與標記物表達量之間的相關(guān)關(guān)系。圖ll(a)_(f)表示健康者和有特應(yīng)性皮炎病史的人中角質(zhì)細胞面積與標記物表達量之間的相關(guān)關(guān)系。
具體實施例方式以下更詳細地說明本發(fā)明的實施方式。本發(fā)明提供一種判定特應(yīng)性皮炎的方法，其包括測定皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達。特定蛋白質(zhì)伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變。“表達發(fā)生改變”的方式可以是蛋白質(zhì)及/或其基因的表達的有無發(fā)生改變、表達量發(fā)生增減等。特定蛋白質(zhì)優(yōu)選從載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP-4、FABP-5、波形蛋白(Vimentin)、Rho GD1、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、烯醇酶 I (Enolase I)、半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)、PARK7、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、HSP70、HSP90、血清白蛋白(Serumalbumin)、免疫球蛋白G (Immunoglobulin G)、精氨酸酶I (Arginase I)及尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase)所組成的組中選擇。選擇的蛋白質(zhì)可以是I種，也可以是多種。上述23種的特定蛋白質(zhì)如下所示:(I)從半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素_3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素_7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)所組成的半乳糖凝集素(Galectin)組中選擇的蛋白質(zhì)，(2)從HSP70、HSP90所組成的HSP組中選擇的蛋白質(zhì)，(3)從波形蛋白(Vimentin)、Rho⑶1、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)所組成的細胞骨架蛋白組中選擇的蛋白質(zhì)，(4)從FABP-4、FABP-5所組成的FABP組中選擇的蛋白質(zhì)，(5)此外還有血清白蛋白(Serum albumin)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、載脂蛋白 Al (Apolipoprotein Al)、烯醇酶 I (Enolase I)、PARK7、精氨酸酶 I (Arginase I)、尿卩密唳 DNA 糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)。載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)是分子質(zhì)量為30，778Da的分泌蛋白質(zhì),對促進膽固醇從組織中的流出或膽固醇向肝臟的反向輸送起作用。已知其是大量存在于乳糜微粒、血漿高密度脂蛋白(plasma HDL)中的分泌蛋白質(zhì)，在皮膚組織中，在干癬(以表皮的規(guī)則性肥厚和角化不全為特征)中表達?；蛐蛄行畔?Apolipoprotein Al,Nucleic AcidsRes.11:2827-2837(1983)，P02647)。氨基酸序列信息(Apolipoprotein Al, Biochem.Biophys.Res.Commun.80:623-630 (1978)，M27875)。FABP-5 (脂肪酸結(jié)合蛋白-5:Fatty acid binding protein-5)是分子質(zhì)量為15, 033Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，是主要存在于表皮中的蛋白質(zhì)，因在干癬(以表皮的規(guī)則性肥厚和角化不全為特征)的組織中表達升高而被鑒定。是與脂肪酸(油酸)、疏水性配基結(jié)合的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，參與脂肪酸的攝取、輸送、代謝，還參與細胞的增殖、分化等。增殖過程中表皮角化細胞的FABP-5表達少，但通過分化誘導可增加到約2倍。與在干癬中高表達的S100A7(鈣依賴性信號蛋白)結(jié)合，定位于表皮角化細胞分化階段中的粘著斑(focal adhesion)樣結(jié)構(gòu)中?；蛐蛄行畔?Fatty acid binding protin5, J.1nvest.Dermatol.99:299-305 (1992), BC070303)。氨基酸序列信息(Fatty acid-bindingprotein, epidermal,Biochem.J.302:363-371(1994)，Q01469)。波形蛋白(Vimentin)是分子質(zhì)量為53，520Da的細胞骨架蛋白，是組成classIII型中間絲的蛋白質(zhì)。在許多間葉細胞內(nèi)大范圍網(wǎng)狀分布，賦予細胞強度以應(yīng)對外界機械壓力。通過磷酸化調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)。還已知存在網(wǎng)蛋白、聯(lián)絲蛋白(synemin)的結(jié)合蛋白質(zhì)。基因序列信息(Vimentin, Nucleic Acids Res.18:6692-6692 (1990), M14144)。氛基酸序列信息(Vimentin, Electrophoresis 18:588-598 (1997)，P08670)。Rho GDI (Rho GDP 解離抑制因子 I) (Rho GDP-dissociation inhibitor I)是分子質(zhì)量為23，207Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，在表皮角化細胞分化時高表達，抑制性調(diào)節(jié)Rho蛋白質(zhì)從⑶P型向GTP型的轉(zhuǎn)換。因此，通過使Rho⑶I在細胞內(nèi)強制表達，使應(yīng)力纖維、粘著斑等消失，細胞內(nèi)的肌動蛋白骨架系統(tǒng)崩潰。基因序列信息(Rho⑶P-dissociationInhibitorl, Exp.Cell Res.209:165-174(1993)，X69550)。氨基酸序列信息(RhoGDP-dissociation inhibitor, P52565)。膜聯(lián)蛋白II (Annexin II )是分子質(zhì)量為38，473Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，據(jù)報道，其一部分向細胞外分泌。其是受鈣控制的膜結(jié)合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)結(jié)合兩個鈣離子，定位于細胞膜附近。2組膜聯(lián)蛋白(annexin)重復(fù)子中I個與鈣結(jié)合，I個與磷脂結(jié)合。此蛋白質(zhì)或與細胞膜上磷脂結(jié)合的肌動蛋白、細胞骨架蛋白交聯(lián)，或通過tPA(組織型纖溶酶原激活劑:tissue plasminogen activator)激活纖維蛋白溶酶原?；驂A基序列信息(Annexin A2，Gene95:243-251 (1990)，BC015834)。氨基酸序列信息(Annexin A2, J.Biol.Chem.266:5169-5176(1991), P07355)。烯醇酶I (Enolase I)是分子質(zhì)量為47，038Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，具有2_磷酸-D-甘油酸=憐酸烯醇式丙酮酸 +H2O(2-phospho_D-glycerate=phosphoenolpyruvate+H2O)的酶活性，在糖酵解系統(tǒng)中起作用。據(jù)報道，其一部分與細胞增殖、過敏有關(guān)。在白血球、神經(jīng)中，控制細胞表面的纖維蛋白溶酶原的活化，參與纖維蛋白的形成。具有穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)時需要鎂。雖然定位于細胞質(zhì)內(nèi)，而只有同源二聚體存在于細胞膜中。α-烯醇酶(a-enolase)在大部分的組織中表達，β _烯醇酶(β-enolase)只在肌肉組織中表達，Y-烯醇酶(Y-enolase)只在神經(jīng)組織中表達?；蛐蛄行畔?Alpha enolase, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.83:6741-6745 (1986), M14328)。氛基酸序列信息(Alpha enolase,Enzyme Protein48:37-44(1995)，P06733)。半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)是分子質(zhì)量為14，585Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，也向細胞外分泌，存在于心臟、胃、骨骼肌、神經(jīng)、胸腺、腎臟、胎盤等中。與β_半乳糖苷、⑶45、CD3、C D4等結(jié)合。已知其影響細胞的增殖促進作用、細胞死亡的誘導及免疫應(yīng)答。此外，與層粘蛋白、整合素等的細胞外基質(zhì)的組成成分、細胞受體特異性結(jié)合，對細胞粘附、移動產(chǎn)生很大的影響。基因序列信息(Galectin-1, J.Biol.Chem.264:1310-1316 (1989),BT006775)。氨基酸序列信息(Galectin-1，J.Biochem.104:1-4 (1988)，P09382)。半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)是分子質(zhì)量為35，678Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，是與IgE結(jié)合的半乳糖特異性凝集素，主要表達可見于大腸的上皮、活化巨噬細胞中。據(jù)報道，半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)由表皮角化細胞產(chǎn)生，存在于皮膚的胰島細胞表面，與IgE結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。基因序列信息(Galectin-3, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.87:7324-7328(1990)，AB006780)。氨基酸序列信息(Galectin-3, P17931)。半乳糖凝集素-4(Galectin_4)是分子質(zhì)量為35，941Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。半乳糖凝集素-4(Galectin-4)從結(jié)腸癌細胞株T84中分離，存在于細胞和基質(zhì)間的粘著部位、細胞間的粘著部位。基因序列信息(Galectin-4, Eur.J.Biochem.248:225-230 (1997),AB006781)。氨基酸序列信息(Galectin-4，P56470)。半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)是分子質(zhì)量為14，944Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。一般來說，在細胞之間、細胞和細胞外基質(zhì)間控制細胞的增殖，是與細胞凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)，控制JNK的活性、細胞色素C的釋放。也向細胞質(zhì)、核、細胞外分泌。是在人體表皮最早被克隆的半乳糖凝集素亞家族的成員，從培養(yǎng)表皮角化細胞的研究中得知，半乳糖凝集素7 (Galectin-7)不受角質(zhì)化程度的影響，在所有的表皮細胞中表達?；蛐蛄行畔?Galectin-7, Dev.Biol.168:259-271(1995)，L07769)。氨基酸序列信息(Galectin-7,J.Biol.Chem.270:5823-5829，1995，P47929)。半乳糖凝集素-8(Galectin-8)是分子質(zhì)量為35，539Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。半乳糖凝集素-8(Galectin-8)在肝臟、心臟、肌肉、腎臟、腦等很多組織中表達，且在前列腺癌中特異性表達，不存在于正常前列腺、良性前列腺肥大部中。基本不存在于胚胎中，但在成熟的各組織中有非常高的表達?；蛐蛄行畔?Galectin-8，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.93:7252-7257 (1996)，X91790)。氨基酸序列信息(Galectin-8, 000214)。PARK7是分子質(zhì)量為19，891Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。PARK7是作為與帕金森氏病有關(guān)的蛋白質(zhì)而被鑒定，但其后還證實其參與皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的再上皮化作用(re-epithelialization)。且從其立體結(jié)構(gòu)來看，也說明其可能作為蛋白酶起作用?；蛐蛄行畔?Parkinson disease7, Biochem.Biophys.Res.Commun.231:509-513 (1997),BC008188)。氨基酸序列信息(DJ-1 protein, Q99497)。結(jié)蛋白(Desmin)是分子質(zhì)量為53，405Da的細胞骨架蛋白，是在保持細胞結(jié)構(gòu)、強度中起作用的classIII型中間絲的一種。是纖維狀多肽的聚合體，存在于平滑肌、橫紋肌中。基因序列信息(Desmin, Gene 78:243-254 (1989), U59167)。氛基酸序列信息(Desmin,P17661)。埃茲蛋白(Ezrin)是分子質(zhì)量為69，268Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。下述膜突蛋白(Moesin)、根蛋白(Radixin)是同族分子。主要起連接細胞骨架蛋白和細胞膜的作用。定位于細胞膜的被稱為微絨毛(micixwilli)的絲狀突起的內(nèi)側(cè)，構(gòu)成腸上皮細胞的微絨毛(microvilli),由酪氨酸激酶磷酸化。基因序列信息(Ezrin, J.Biol.Chem.264:16727-16732(1989) ,X51521)。氨基酸序列信息(Ezrin, Biochem.Biophys.Res.Commun.224:666-674(1996)，P15311)。根蛋白(Radixin)是分子質(zhì)量為68，564Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。主要起連接細胞骨架蛋白和細胞膜的作用。基因序列信息(Radixin, Genomics 16:199-206 (1993)，L02320)。氨基酸序列信息(Radixin, P35241)。膜突蛋白(Moesin)是分子質(zhì)量為67，689Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。主要起連接細胞骨架蛋白和細胞膜的作用。據(jù)報道，在異常分化的表皮角化細胞中表達降低?；蛐蛄行畔?Moesin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.88:8297-8301 (1991)，M69066)。氨基酸序列信息(Moesin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.88:8297-8301(1991)，P26038)。FABP_4(脂肪酸結(jié)合蛋白 _4:Fatty acid-binding protein-4)是分子質(zhì)量為14，588Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。具有向脂肪細胞輸送脂質(zhì)的作用，主要與細胞內(nèi)的脂肪酸、視黃酸結(jié)合，依賴脂肪細胞的分化階段表達增加，與FABP-5具有高的同源性?；蛐蛄行畔?Fatty acid-binding protein, adipocyte, Biochemistry28:8683-8690 (1989),BT006809) o 氨基酸序列信息(Fatty acid-binding protein, adipocyte, P15090)。HSP70(熱休克蛋白70:Heat shock protein70)是分子質(zhì)量為70，052Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，通常在細胞內(nèi)作為分子伴侶起作用，參與蛋白質(zhì)的折疊、輸送、聚集和降解等。且HSP70在線粒體、ER中的作用是使蛋白質(zhì)正常轉(zhuǎn)移，還與HSP90協(xié)同參與細胞內(nèi)的信號傳遞?；蚝盎蛄行畔?Heat shock70kDa proteinlA, Immunogenetics32:242-251 (1990),BC002453) ο 氛基酸序列信息(Heat shock70kDa proteinl, P08107)。HSP90(熱休克蛋白:Heat shock protein90)是分子質(zhì)量為85，453Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。細胞遭遇高溫時，HSP90改變結(jié)構(gòu)，作為防止其他蛋白質(zhì)的不可逆變性的分子伴侶起作用。也有如下報道，在某種細胞中參與信號傳遞?；驂A基序列信息(Heat shockprotein90, Nucleic Acids Res.17:7108-7108 (1989)，X15183)氨基酸序列信息(Heatshock protein 90, J.Biol.Chem.264:2431-2437(1989), P07900) 血清白蛋白(Serum albumin)是在血清中大量含有的分子質(zhì)量為69，367Da的分泌蛋白質(zhì)。血清白蛋白(Serum albumin)的基本功能是血液的膠體滲透壓的維持和種種物質(zhì)的運送?；蛐蛄行畔?Serum albumin, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.79:71-75 (1982).，V00494)。氨基酸序列信息(Serum albumin, FEBS Lett.58:134-137 (1975).，P02768)。IgG:免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)是分子質(zhì)量為42，632Da的分泌蛋白質(zhì)，占人體總免疫球蛋白的75%。IgG的生理活性有補體的活化、巨噬細胞攝取的增強、胎盤通過性等。另外，免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)是免疫球蛋白IgG的大亞單位(H鏈)，通過基因的類別轉(zhuǎn)換表達。在血清中大量存在，半衰期長，與輕鏈(L鏈)一起形成多種抗體分子，在免疫反應(yīng)中起中心作用?；蛐蛄行畔?Immunoglobulin gamma, Nucleic AcidsRes.16:11824-11824 (1988).，X14356)。氨基酸序列信息(Immunoglobulin gamma, ProteinSc1.13:2819-2824(2004).，P12314)。

精氨酸酶I (Arginase I)是分子質(zhì)量為34，735Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，是使L-精氨酸水解為L-鳥氨酸和尿素的單向反應(yīng)酶。定位于肝臟中，在腎臟、腦、乳腺、皮膚中也有極微量存在。欠缺時會引起精氨酸血癥，精神發(fā)育遲緩、痙攣性四肢麻痹?；蛐蛄行畔?Arginase typel, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84:412-415 (1987).，AY074488)。氨基酸序列信息(Arginase-1, P05089)。尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase)是分子質(zhì)量為34，645Da的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。DNA中的胞嘧啶脫氨基形成尿嘧啶時，會與腺嘌呤形成堿基對誘導突變。為防止此現(xiàn)象，尿嘧啶DNA糖基化酶水解脫氨基作用中生成的脫氧尿苷的N-糖苷鍵。存在2種亞型。亞型I在細胞內(nèi)定位于線粒體，作為組織分布定位于肌肉中。亞型II在增殖的組織細胞核中大量表達。基因序列信息(Uracil-DNA glycosylase, EMBO J.8:3121-3125 (1989).，X15653) ο 氨基酸序列信息(Uracil-DNA glycosylase, EMBO J.8:3121-3125 (1989).,P13051)。上述蛋白質(zhì)可以是前體蛋白，也可以是成熟蛋白，可以是切割型，也可以是不切割型。前體蛋白可以是前蛋白、前原蛋白。前蛋白、前原蛋白等中，有的也具有信號肽。本發(fā)明的方法，可以測定皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達，也可以測定其基因表達。例如，可用Northern印跡法、RT-PCR法、Western印跡法、免疫組織化學分析法、ELISA法、抗體芯片、cDNA微陣列、突光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET; Fluorescence resonanceenergy transfer)測定法等測定。為在蛋白質(zhì)水平測定特定蛋白質(zhì)的表達，可使用特異性識別作為測定對象的蛋白質(zhì)的抗體?？贵w可以是單克隆抗體、多克隆抗體中的任一種。這些抗體可用公知方法制造，也可為市售品。用Western印跡法測定時,抗體可用125I蛋白質(zhì)標記物A、過氧化物酶結(jié)合的IgG等進行二次檢測。用免疫組織化學分析法測定時，抗體可用熒光色素、鐵蛋白、酶等
T 己 O為在RNA水平測定特定蛋白質(zhì)的基因表達，可使用可與作為測定對象的蛋白質(zhì)的mRNA特異性雜交的核酸探針(用Northern印跡法測定時)，或也可使用可與作為測定對象的蛋白質(zhì)的mRNA特異性雜交的核酸引物、及可與以所述mRNA為模板合成的cDNA特異性雜交的核酸引物所組成的一對核酸引物(用PCR法測定時)。核酸探針及核酸引物可根據(jù)作為測定對象的蛋白質(zhì)的基因信息設(shè)計。核酸探針通常以約15 1500堿基為宜。核酸探針可用放射性元素、熒光色素、酶等標記。核酸引物通常以約15 30堿基為宜。本發(fā)明中，可以檢測皮膚細胞及/或皮膚組織中有無特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達，也可以測定表達量。有無蛋白質(zhì)及/或其mRNA的表達，可通過在規(guī)定位置有無出現(xiàn)斑點、條帶來確認。蛋白質(zhì)及/或其mRNA的表達量可通過斑點、條帶的染色強度來測定?；蛞部蓪Φ鞍踪|(zhì)及/或其mRNA定量。為了同時檢測多數(shù)基因表達、多數(shù)蛋白質(zhì)表達，可優(yōu)選使用DNA陣列(將探針固定在基板上)(NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME1，DECEMBER2002,951-960)蛋白質(zhì)芯片(將抗體固定在基板上)(NATURE REVIEWS, DRUGDISCOVERY, VOLUME I, SEPTEMBER2002，683-695)、流式點陣儀(Luminex) (NATURE REVIEWS,DRUG DISCOVERY, VOLUME I, JUNE 2002,447-456)等的檢測方法。 皮膚細胞及皮膚組織可以來自成為判定對象的被測體，被測體的生物種可以是人、豬、猴、大猩猩、狗、 牛、兔、大鼠、小鼠等的哺乳動物等。通過本發(fā)明的方法，為判定特應(yīng)性皮炎，可使用皮膚活檢樣品或從中獲得的皮膚培養(yǎng)細胞、皮膚培養(yǎng)組織等。皮膚活檢樣品可如后述實施例中所述，使用將皮膚的角質(zhì)層用膠帶(角質(zhì)測試儀)采集的樣品。皮膚細胞可列舉為表皮角化細胞、皮膚纖維芽細胞、胰島細胞、黑色素細胞、肥胖細胞、內(nèi)皮細胞、皮脂細胞、毛乳頭細胞、毛母細胞等。皮膚細胞可通過公知的方法從皮膚采集[(用于分子生物學研究的新細胞培養(yǎng)實驗法，P57-71，羊土社，1999)[日語原名:「分子生物學研究O tz ^ O新細胞培養(yǎng)実験法，p57-71，羊土社，1999 J ]]。皮膚組織可列舉為皮膚的角質(zhì)層、表皮、真皮等。皮膚組織可通過公知的方法從皮月夫米集(Acta.Derm.Venereol.，85, 389-393, 2005)。皮膚活檢樣品可以是細胞，也可以是組織。皮膚活檢樣品，如后述實施例中所述，可使用角質(zhì)測試儀等的膠帶采集的皮膚角質(zhì)層等。角質(zhì)測試儀一直以來被用于采集角質(zhì)層樣品，該角質(zhì)層樣品用于測定角質(zhì)層的角化不全度和細胞面積、評價肌膚的粗糙程度和角質(zhì)層的更新速度[(化妝品的有用性.評價技術(shù)的進步和未來展望，日本化妝品技術(shù)者會，藥事日報社，P95-96)[日語原名:「化粧品O有用性 評価技術(shù)O進歩i將來展望，日本化粧品技術(shù)者會，薬事日報社，P95-96)」]]。作為可在咨詢(counseling)店、自家內(nèi)簡單、安全地采集角質(zhì)層樣品、從角質(zhì)層非侵襲地獲得蛋白質(zhì)的方法非常有效。
作為本發(fā)明的例子之一，特應(yīng)性皮炎可用以下標準判定。如使用實施例1(圖8)所示的烯醇酶UEnolase I)、FABP-5、SCCA2、載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、白蛋白(Albunin)及膜聯(lián)蛋白II (Annexin II)等的各種抗體的分析例所示，從特應(yīng)性皮炎發(fā)病的志愿者身上獲取皮膚樣品，測定多種標記物蛋白質(zhì)的表達量或其基因的表達量，揭示病狀與表達量的關(guān)系。從特應(yīng)性皮炎發(fā)病者的發(fā)病部位(分析樣品)和非發(fā)病部位(發(fā)病者對照樣品)及特應(yīng)性皮炎非發(fā)病者的相同部位(非發(fā)病者對照樣品)的表達量的比較中，判定分析樣品特應(yīng)性皮炎癥狀的程度、發(fā)病原因。如此，標記物蛋白質(zhì)的分析結(jié)果可對呈現(xiàn)多種癥狀的特應(yīng)性皮炎的診斷、治療起作用。本發(fā)明也提供用于判定特應(yīng)性皮炎的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含對于皮膚細胞及/或皮膚組織中的特定蛋白質(zhì)，測定伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的所述特定蛋白質(zhì)表達的試劑。例如，本發(fā)明的試劑盒中包含可特異性識別伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的抗體的試劑。特定蛋白質(zhì)優(yōu)選從載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP-4、FABP-5、波形蛋白(Vimentin)、Rho GD1、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、烯醇酶 I (Enolase I)、半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)、PARK7、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、HSP70、HSP90、血清白蛋白(Serumalbumin)、免疫球蛋白G (Immunoglobulin G)、精氨酸酶I (Arginase I)及尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)所組成的組中選擇。試劑盒中還可包含用于采集皮膚組織的膠帶、免疫化學方法檢測膠帶上的蛋白質(zhì)的全套試劑、使用說明書等。使用說明書中除記載試劑盒的使用方法以外，還可記載特應(yīng)性皮炎的判定標準等。另外還有一例，例如，本發(fā)明的試劑盒包含作為試劑的可與伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的mRNA特異性雜交的核酸探針。特定蛋白質(zhì)優(yōu)選從載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP-4、FABP-5、波形蛋白(Vimentin)、Rho GD1、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、烯醇酶 I (Enolase I)、半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)、PARK7、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、HSP70、HSP90、血清白蛋白(Serumalbumin)、免疫球蛋白G (Immunoglobulin G)、精氨酸酶I (Arginase I)及尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)所組成的組中選擇。試劑盒中還可包括用于采集皮膚組織的膠帶、用于從膠帶上的皮膚組織中提取RNA的試劑類、用Northern印跡法分析RNA的試劑類、使用說明書等。使用說明書中，除記載試劑盒的使用方法以外，還記載特應(yīng)性皮炎的判定標準等。還有一例，本發(fā)明的試劑盒包含作為試劑的可與伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的mRNA特異性雜交的核酸引物、及可與以所述mRNA為模板合成的cDNA特異性雜交的核酸引物所組成的一對核酸引物。
特定蛋白質(zhì)優(yōu)選從載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP-4、FABP-5、波形蛋白(Vimentin)、Rho GD1、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、烯醇酶 I (Enolase I)、半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)、PARK7、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、HSP70、HSP90、血清白蛋白(Serumalbumin)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)、精氨酸酶I (Arginase I)及尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)所組成的組中選擇。試劑盒中還可包括用于采集皮膚組織的膠帶、用于從膠帶上的皮膚組織中提取RNA的試劑類、用RT-PCR法分析RNA的試劑類、使用說明書等。使用說明書中，除記載試劑盒的使用方法以外，還記載特應(yīng)性皮炎的判定標準等。本發(fā)明還提供鑒定具有治療及/或預(yù)防特應(yīng)性皮炎作用的物質(zhì)的方法，此方法包括以下工序:(a)使皮膚細胞及/或皮膚組織與被測物質(zhì)接觸的工序，(b)在規(guī)定時間內(nèi)培養(yǎng)工序(a)中與被測物質(zhì)接觸過的皮膚細胞及/或皮膚組織的工序，(C)測定工序(b)中培養(yǎng)的皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達的工序，所述工序中，所述特定蛋白質(zhì)伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變，以及(d)通過比較工序(C)中測定的特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達和對照的皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達，評價被測物質(zhì)對于皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達的作用的工序。被測物質(zhì)可以是任何物質(zhì)，可列舉為蛋白質(zhì)、肽、維生素、激素、多糖、低聚糖、單糖、低分子化合物、核酸(DNA、RNA、寡核苷酸、單核苷酸等)、脂質(zhì)、除上述以外的天然化合物、合成化合物、植物提取物、植物提取物的分離物、上述物質(zhì)的混合物等。皮膚細胞及皮膚組織如上所述。被測物質(zhì)與皮膚細胞及/或皮膚組織的接觸，可使用任何方法，例如，可以是將被測物質(zhì)添加到皮膚細胞及/或皮膚組織的培養(yǎng)液中的方法、在涂布或固定有被測物質(zhì)的培養(yǎng)容器或培養(yǎng)板(sheet)上培養(yǎng)皮膚細胞及/或皮膚組織的方法等。也可以是使用人或人以外的哺乳動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬等)等的生物體，將被測物質(zhì)直接涂布于皮膚上的方法、經(jīng)口投給被測物質(zhì)的方法。皮膚細胞及/或皮膚組織的培養(yǎng)時間無特別限制，只要是可確認出被測物質(zhì)對皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達有無效果的時間即可。例如，皮膚細胞使用人體正常表皮角化細胞時，以12 48小時為宜，優(yōu)選為12 24小時。此處，“培養(yǎng)皮膚細胞及/或皮膚組織”是指使皮膚細胞及/或皮膚組織生長發(fā)育.增殖之意，其中，除了使單離后的皮膚細胞及/或皮膚組織生長發(fā)育.增殖以外，還包括使具有皮膚細胞、皮膚組織的生物體自身生存、飼養(yǎng)和養(yǎng)殖具有皮膚細胞、皮膚組織的生物體等。作為比較對照的皮膚細胞及/或皮膚組織，可為與被測物質(zhì)接觸前的皮膚細胞及/或皮膚組織，也可為除不與被測物質(zhì)接觸以外、進行相同處理的皮膚細胞及/或皮膚組織。特定蛋白質(zhì)優(yōu)選從載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP-4、FABP-5、波形蛋白(Vimentin)、Rho GD1、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、烯醇酶 I (Enolase I)、半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素_8 (Galectin_8)、PARK7、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、HSP70、HSP90、血清白蛋白(Serumalbumin)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)、精氨酸酶I (Arginase I)及尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)所組成的組中選擇。作為本發(fā)明的一例，與被測物質(zhì)接觸過的皮膚細胞及/或皮膚組織中，載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、FABP-5、波形蛋白(Vimentin)、Rho GD1、膜聯(lián)蛋白 II (AnnexinII)、烯醇酶 I (Enolase I)、血清白蛋白(Serum albumin)或免疫球蛋白 G (Immunoglobul inG)中任一個的表達量與對照相比減少，可評價為被測物質(zhì)具有使上述任一種蛋白質(zhì)的表達減少的作用時，此被測物質(zhì)即可鑒定為是具有治療及/或預(yù)防特應(yīng)性皮炎作用的物質(zhì)。此外，本發(fā)明的另外一例，與被測物質(zhì)接觸過的皮膚細胞及/或皮膚組織中，F(xiàn)ABP-4、半乳糖凝集素-1 (Galectin-1)、半乳糖凝集素_3 (Galectin-3)、半乳糖凝集素-4 (Galectin-4)、半乳糖凝集素-7 (Galectin-7)、半乳糖凝集素-8 (Galectin-8)、PARK7、結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、HSP70、HSP90、精氨酸酶I (Arginase I)或尿卩密唳DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase)的表達量與對照相比增加，可評價為被測物質(zhì)具有使上述任一種蛋白質(zhì)的表達增加的作用時，此被測物質(zhì)即可鑒定為是具有治療及/或預(yù)防特應(yīng)性皮炎作用的物質(zhì)。實施例以下，根據(jù)實施例詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于下述實施例。

實施例1材料和實驗方法1.特應(yīng)性皮炎模型小鼠(NC/Nga小鼠)的半抗原處理特應(yīng)性皮炎模型小鼠(NC/Nga小鼠)，購入6周齡的雄性小鼠[NC/Nga sic,SankyoLabo Service Corporation (日語原名「三協(xié)9 寸一 ' ^株式會社」)],在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。NC/Nga小鼠有多個系統(tǒng)，本研究使用的系統(tǒng)是只在常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)時特應(yīng)性皮炎不發(fā)病，通過DNFB (二硝基氟苯:Dinitorofluorobenzene)等免疫誘導劑處理后才使特應(yīng)性皮炎發(fā)病的系統(tǒng)。因此，將0.1%的DNFB溶液(半抗原)按每周I次共計4周涂布于兩耳及左右背部皮膚上。同時，將可緩和特應(yīng)性皮炎炎癥的乳鐵蛋白以I μ g/ml溶解于飲料水中投給小鼠。小鼠的實驗條件為(I)半抗原(_)/乳鐵蛋白(_)、(2)半抗原(_)/乳鐵蛋白(+)、
(3)半抗原(+)/乳鐵蛋白(_)、⑷半抗原(+)/乳鐵蛋白(+)，各使用3只。2.特應(yīng)性皮炎模型小鼠皮膚組織中蛋白質(zhì)的提取切取用半抗原/乳鐵蛋白處理4周的小鼠的皮膚組織，將組織片用刀切碎，移入預(yù)先測定了皮重的離心管中測定組織重量。加入組織重量X0.85mg尿素(urea)、組織重量 X0.1 μ IL 5%SDS、組織重量 X0.1 μ 18.5% 曲拉通 X-100 (Triton X-100)、組織重量Χ0.05μ 12-ME的緩沖液，用HG30均質(zhì)器(homogenizer) (HITACHI公司)均質(zhì)。15，OOOrpm(15, OOOxg) UO °C離心30分鐘，回收上清后，再將其上清用50，OOOrpmdOO, OOOxg)、10°C離心I小時，將其上清作為樣品。通過點印跡法對蛋白質(zhì)的量定量。3.特應(yīng)性皮炎患者皮膚組織中蛋白質(zhì)的提取在特應(yīng)性皮炎患者發(fā)生炎癥的部位(主要是腕部)和炎癥部位附近未發(fā)生炎癥的部位粘貼角質(zhì)測試儀[AsahiBiomed C0., Ltd(日語原名「7*寸t K <才^;:7卜''社」)],取得角質(zhì)層。作為對照，從特應(yīng)性皮炎未發(fā)病的人身上回收樣品。角質(zhì)測試儀，針對一個部位，在相同部位所使用3片進行回收。每I片膜片在50μ I的IX樣品緩沖液(sample buffer)[83mM Tris-HCl (pH6.8)、2.7%SDS、28% 甘油(glycerin)]中，用細胞刮從膜片上刮取樣品。用15000rpm(15, OOOxg)、4. 、10分鐘離心后回收上清,使用DC蛋白測定(DC proteinassay) (B10-RAD公司)進行蛋白質(zhì)定量。4.二維凝膠電泳(2-DE)4-1第一維等電點電泳將60 μ g的蛋白質(zhì)與凝膠膨脹液[5M尿素(urea)、2M硫代尿素(thiourea)、
0.5% 兩性電解質(zhì)(ampholytes) (pH3.5 10) (Amersham Biosciences 公司)、0.0025% 澄黃 G (Orange G)、2.5mM TBP、1 % 曲拉通 X-100 (Triton X-100)]混合，使總量為 340 μ I后，在 Immobiline 干膠條(Immobiline Dry-Strip gel) (18cm、pH3_10、NL) (AmershamBiosciences公司)20°C膨脹一夜。使用Anatech公司的裝置，第一維用20°C、500V_2小時、700V-1 小時、1000V-1 小時、1500V-1 小時、2000V-1 小時、3000V-1 小時、3500V-10 小時的程序進行等電點電泳。電泳后，將凝膠浸入SDS平衡緩沖液[5.811尿素(111'冊)、0.061硫代尿素(thiourea)、0.5%dithiothereitol (DTT) (w/v) >25% 丙三醇(glycerol)、0.0025%BPB]中，室溫下平衡I小時。4-2 第二維 SDS-PAGE第二維使用Tris-三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)系統(tǒng)的緩沖液[陰極緩沖液:0.05M Tris、0.05M三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、0.05%SDS、陽極緩沖液:IMTris-HCl (pH8.8)]，通過 18cm X 18cm、7.5% 丙烯酰胺凝膠進行 SDS-PAGE。4-3電泳印跡法將結(jié)束SDS-PAGE后的凝膠使用半干式轉(zhuǎn)移裝置[Nihon Eido C0.，Ltd.(日語原名「日本工 ^ K 一社」)],在 20cmX 20cm 的 PVDF 膜[ProBlott Membranes (AppliedBiosystemus公司)]上用150mA的恒定電流轉(zhuǎn)移2小時。轉(zhuǎn)移緩沖液使用陽極I液:0.3M Tris-HCl (ρΗΙΟ.4),20% 甲醇(methanol )，陽極 2 液:25mM Tris-HCl (ρΗ10.4)、20% 甲醇(methanol),陰極液:25mM Tris-HCl (ρΗΙΟ.4) >20% 甲醇(methanol)、40mM6_ 氨基己酸(6-amino hexanoic acid)(和光純藥工業(yè))。轉(zhuǎn)移后用TTBS緩沖液[20mMTris-HCl(ρΗ7.5)(B10-RAD 公司)、500mM NaCl、0.3% 吐溫-20 (Tween-20) (B10-RAD 公司)]20分鐘洗滌3次后，用MQW2分鐘洗滌3次。然后將膜封好后浸滿50ml的膠體金溶液[Colloidal Gold Total Protein Stain (BIO-RAD 公司)],振蕩 I 2 小時后使蛋白質(zhì)染色。膜染色后，去除膠體金溶液，用純水洗I分鐘、洗滌5次后,使其干燥。5.蛋白質(zhì)的鑒定
5-1PVDF膜上蛋白質(zhì)的還原S-烷基化和蛋白酶酶切切取轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的蛋白質(zhì)點，放入試管中，加入100 300μ I的還原用緩沖液[8Μ 鹽酸胍(guanidine-HCl) (ρΗ8.5) ]、0.5Μ Trisbase、0.3%EDTA-2Na (w/v)、5% 乙腈]。在還原用緩沖液中加入溶解的相當于Img的DTT(dithiothreitol),將試管內(nèi)置換為氮氣，室溫靜置I小時，還原蛋白質(zhì)。反應(yīng)結(jié)束前，加入在IM NaCl中溶解的相當于3mg的碘乙酸(Monoiodoacetic Acid),在遮光狀態(tài)下持續(xù)攪拌15 20分鐘進行S-羧甲基化。結(jié)束后取出PVDF膜，用純水攪拌洗滌5分鐘后，在2%乙腈中同樣方法攪拌。取出PVDF膜，移至裝有Lys-C酶切緩沖液[70%乙腈/20mM Tris-HCl (pH9.0)]的試管內(nèi)清洗2 3次后，完全浸入Lys-C酶切緩沖液，酶切I小時。5-2質(zhì)量分析和肽質(zhì)量指紋譜將蛋白酶酶切的溶液稀釋7倍使乙腈濃度為10%。作為前處理，為了活化ZipTipcl8移液器吸頭(MILLIP0RE公司)的充填劑部分，反復(fù)用50%乙腈/0.1%TFA(三氟乙酸:trifluoro-acetic acid)多次、用 2% 乙臆 /0.1%TFA (三氟乙酸:trifluoro-aceticacid)多次吸入、排出。然后用經(jīng)活化的Zip Tipcl8移液器吸頭將蛋白酶酶切液多次吸入、排出，使片段化后的肽吸附在充填部分上。再將2%乙腈/0.1%TFA(三氟乙酸:trif luoro-acetic acid)多次吸入、排出，去除鹽類。吸入在50%乙腈/0.1%TFA(三氟乙酸:trif luoro-acetic acid)中溶解的飽和基質(zhì)溶液0.5 1μ I,放置10秒左右后,滴入到質(zhì)譜儀附屬的靶探針中。使樣品干固，用質(zhì)譜儀(MALD1-T0F MS)測定。基于得到的質(zhì)量值，參照在數(shù)據(jù)庫(MS-Fit, Mascot Search)登錄的蛋白質(zhì)進行鑒定。6.Western 印跡法使用用于Western印跡法的樣品，通過Laemmli的Tris-Glycin系統(tǒng)進行SDS-PAGE。進行SDS-PAGE后，將凝膠用每Icm20.8mA的恒定電流轉(zhuǎn)移至PVDF膜(MILIP0RE公司)，然后使用5%脫脂奶/PBS㈠4 °C封閉過夜。將PVDF膜用0.1%吐溫20 (Tween20)/PBS(-)洗滌3次后，與I次抗體在室溫下反應(yīng)I小時。其次，2次抗體用生物素化抗羊 IgG (Biotinylated ant1-goat IgG) (Vector Laboratories 公司)[1:1000稀釋(dilution)]振蕩I小時時,與堿性磷酸酶共軛的抗生物素蛋白D (Alkalinephosphatase-conjugated avidin D)(Vector Laboratories 公司)(1:1000 稀釋)反應(yīng) I 小時，用 0.6mg/ml5-漠-4-氣-3-卩引噪基憐酸(5-bromo-4-chloro-3_indolylphosphate)、1.2mg/ml 硝基四氮唑藍(nitrobluetetrazolium)、0.IM Tris-HCl (ρΗ9.5)、5mMMgCl2顯色。且2次抗體使用辣根過氧化物酶標記抗小鼠IgG(HRP labeled ant1-mouseIgG) (Amersham Bioscience公司)(1: 1000稀釋)，辣根過氧化物酶標記抗兔IgG(HRPlabeled ant1-rabbit IgG) (Amersham Bioscience 公司)(1:1000 稀釋)，辣根過氧化物酶標記抗大鼠 IgG (HRP labeled ant1-rat IgG) (Amersham Bioscience 公司)(1:1000 稀釋)，辣根過氧化物酶標記抗羊 IgG(HRP labeled ant1-goat IgG) (SantaCruz 公司)(1:1000 稀釋)時，使用增強化學發(fā)光(Enhanced chemiluminescence) (ECL)(Amersham Bioscience公司)試劑盒,通過突光顯色檢測。使用的I次抗體的種類和稀釋度如下所不:小鼠抗_HSP70單克隆抗體(mouse ant1-HSP70monoclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology公司)(1:1000稀釋)、兔抗-膜聯(lián)蛋白II多克隆抗體(rabbit ant1-annexin II polyclonal antibody) (Santa Cruz Biotechnology 公司)(1:1000 稀釋)、小鼠抗-HSP90 單克隆抗體(mouse ant1-HSP90monoclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology 公司)(1:1000 稀釋)、大鼠抗-GRP94 單克隆抗體(ratant1-GRP94monoclonal antibody) (Stressgeen 公司)(1:1000 稀釋)、小鼠抗-半乳糖凝集素-1 單克隆抗體(mouse ant1-galectin-lmonoclonal antibody) (R&D Systems 公司)(1:1000稀釋)、大鼠抗-半乳糖凝集素-3單克隆抗體(rat ant1-galectin-3 monoclonalantibody) (R&D Systems公司)(1: 1000稀釋)、小鼠抗-半乳糖凝集素_4單克隆抗體(mouse ant1-galectin-4monoclonal antibody)(R&D Systems 公司)(1:1000 稀釋)、小鼠抗-半乳糖凝集素-7 單克隆抗體(mouse ant1-galectin-7monoclonal antibody)(R&DSystems公司)(1: 1000稀釋)、小鼠抗_半乳糖凝集素_8單克隆抗體(mouseant1-galectin-8monoclonal antibody) (R&D Systems 公司)(1: 1000 稀釋)、羊抗-半乳糖凝集素 _9 多克隆抗體(goat ant1-galectin-9poIyclonal antibody) (Santa CruzBiotechnology公司)(1:1000稀釋)、兔抗-結(jié)蛋白多克隆抗體(rabbit ant1-desminpolyclonal antibody) (Santa Cruz Biotechnology 公司)(1:1000 稀釋)、羊抗-波形蛋白多克隆抗體(goat ant1-vimentin polyclonal antibody) (Santa Cruz Biotechnology公司)(1: 1000 稀釋)、兔抗-烯醇酶-1 多克隆抗體(rabbit ant1-enolase-lpolyclonalantibody) (Santa Cruz Biotechnology 公司)(1: 1000 稀釋)、兔抗-埃茲蛋白 / 根蛋白 / 膜突蛋白多克隆抗體(rabbit ant1-ezrin/radixin/moesin polyclonal antibody)(Chemicon 公司)(1:1000 稀釋)、羊抗-FABP-4 多克隆抗體(goat ant1-FABP_4poIyclonalantibody) (G-T research公司)(1: 1000稀釋)、小鼠抗-載脂蛋白Al單克隆抗體(mouseant1-apolipoprotein Al monoclonal antibody)(ICN biomedicals 公司)(1:1000 稀釋)、羊抗-載脂蛋白 Al (goat ant1-apolipoprotein Al) (Abcom 公司)(1: 1000 稀釋)、羊抗-PARK7 多克隆抗體(goat ant1-PARK7poIyclonal antibody) (Abcom 公司)(1:1000稀釋)、小鼠抗-Rho GDI 單克隆抗體(mouse ant1-Rho GDI monoclonal antibody)(Santa Cruz Biotechnology 公司)(1: 1000 稀釋)、羊抗-FABP-5 多克隆抗體(goatant1-FABP-5poIyclonal antibody) (R&D Systems 公司)(1: 1000 稀釋)、小鼠抗-SCCA2 單克隆抗體(mouse ant1-SCCA2monoclonal antibody) (Santa Cruz Biotechnology 公司)(1:1000 稀釋)、兔抗-FAB P-5 多克隆抗體(rabbit ant1-FABP~5poIyclonal antibody)(BioVendor公司)(1:5000稀釋)、兔抗-人血白蛋白多克隆抗體(rabbit ant1-humanalbumin polyclonal antibody) (Inter-Cell 公司)(1:1000 稀釋)。7.角質(zhì)細胞面積減少度的測定將角質(zhì)測試儀按壓在患病部位，剝離角質(zhì)層細胞。將釆集了角質(zhì)層細胞的角質(zhì)測試儀用1%亮綠、0.5%龍膽紫水溶液染色后，使用數(shù)碼顯微鏡(VHX-100，KEYENCE Co，Ltd.，Japan)(改變檀渕等的方法，JSCCJ，23，1，1989。日語原文:檀渕6 O方法*改變，JSCCJ，23,1 19890 )觀察。所得到的圖像的角質(zhì)細胞面積通過專業(yè)判定員的目測評價分5級別(I分:小，2分:稍小，3分:一般，4分:稍大，5分:大)評分。 8.經(jīng)皮水分喪失量的測定使用市售的皮膚水分流失測試儀(Tewameter) (TEWAMETER ΤΜ210、Courage+Khazaka electronic GmbH公司制)測定。其測定原理是假定從皮膚表面向空氣中散失的水分根據(jù)Fick法則擴散，測量皮膚上數(shù)_的2點的蒸氣壓，算出從表皮蒸發(fā)的水分量。9.通過 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法:enzyme-linked immunosorbent assay)的標記物蛋白質(zhì)的測定在96-well ELISA板中，將用磷酸緩沖溶液(PBS)稀釋到0.2μ 1/μ I的角質(zhì)層蛋白質(zhì)溶液以50 μ I/well添加，4°C吸附18小時。除去角質(zhì)層蛋白質(zhì)溶液后，浸入封閉溶液{含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS}中，37°C、封閉I小時。用洗滌液{含有0.05%的聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯(和光純藥)的PBS}洗滌后，將I次抗體溶液{用洗滌液制成5mg/ml的各種抗體}分別以50 μ 1/well添加，37°C、反應(yīng)2小時。洗滌后，將2次抗體溶液{用洗漆液制成lmg/ml的HRP (辣根過氧化物酶:Horseradish peroxidase)化抗小鼠免疫球蛋白G (VECTOR LABORATORIES)或用洗滌液制成lmg/ml的HRP (辣根過氧化物酶:Horseradish peroxidase)化抗兔免疫球蛋白 G (VECTOR LABORATORIES)}分別以 50μ1/well添加,37°C、反應(yīng)I小時。洗漆后，使用增強化學發(fā)光(Enhanced chemi luminescence)(ECL) (Amersham Bioscience公司)試劑盒進行化學發(fā)光反應(yīng)，通過化學發(fā)光檢測儀(SpectraMax Lmax II 384, Molecular devices)檢測，進行數(shù)值化。實驗結(jié)果1.特應(yīng)性皮炎模型小鼠的半抗原處理本研究中使用的特應(yīng)性皮炎模型小鼠(NC/Nga小鼠)在常規(guī)環(huán)境下經(jīng)半抗原處理后飼養(yǎng)時，半抗原處理4周后，用肉眼可確認出酷似特應(yīng)性皮炎的皮膚炎發(fā)病。本研究將對特應(yīng)性皮炎有效果的乳鐵蛋白(與唾液、血液中所含有的鐵離子結(jié)合的分子量為8萬的蛋白質(zhì))混入飲用水中使其飲用。半抗原及乳鐵蛋白處理后飼養(yǎng)的結(jié)果，在半抗原涂布處理的小鼠的背部發(fā)現(xiàn)有酷似人體特應(yīng)性皮炎的炎癥，而半抗原涂布處理后，進一步飲用了混入乳鐵蛋白的水的小鼠與只進行半抗原涂布處理的小鼠相比，炎癥受到了抑制(圖1)。通過半抗原處理，伴隨特應(yīng)性皮炎發(fā)病其表達發(fā)生改變的蛋白質(zhì)如通過乳鐵蛋白處理，特應(yīng)性皮炎癥狀得到緩和而恢復(fù)到與無處理時同等的水平，則可認為其蛋白質(zhì)是有希望的標記物。2.使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠的皮膚組織進行二維電泳分析為鑒定與特應(yīng)性皮炎有關(guān)的蛋白質(zhì)，將半抗原涂布處理或未處理、乳鐵蛋白處理或未處理的小鼠的皮膚用二維電泳對變化的蛋白質(zhì)進行分析。取出無處理(對照)小鼠、半抗原涂布小鼠、作為對照飲用乳鐵蛋白的小鼠以及涂布半抗原后進一步飲用乳鐵蛋白的小鼠的皮膚(半抗原涂布時有炎癥的部位)，根據(jù)重量添加樣品緩沖液，用Polytron型均質(zhì)器破碎后，15000rpm(15, OOOxg) >30分鐘離心,然后回收上清液。將其上清用100，OOOxgU小時超離心，將上清作為樣品使用。二維電泳，其第一維用PH3-10的膠條(strip gel)、第二維用7.5%丙烯酰胺凝膠進行。使用膠體金溶液染色，檢測變化的蛋白質(zhì)，對能看出變化的蛋白質(zhì)使用質(zhì)譜儀(MALD1-T0F MS)進行分子鑒定(圖2(a) (b))。其結(jié)果，在分析的49個蛋白質(zhì)中鑒定出43個蛋白質(zhì)。鑒定出的蛋白質(zhì)中，半抗原處理的小鼠(產(chǎn)生特應(yīng)性皮炎炎癥的小鼠)中表達增加的蛋白質(zhì)鑒定出FABP-5、載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)、波形蛋白(Vimentin)等，未知蛋白質(zhì)有4種。另一方面，在半抗原處理的小鼠中，表達減少的蛋白質(zhì)鑒定出半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)、結(jié)蛋白(Desmin)、PARK7等。且鑒定出的蛋白質(zhì)的大多數(shù)是角蛋白5 (keratin5)、角蛋白16(keratinl6)、結(jié)蛋白(Desmin)、波形蛋白(Vimentin)、膜突蛋白(Moesin)等的骨架蛋白。3.使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠發(fā)生改變的蛋白質(zhì)的抗體進行確認為確認上述所示的因特應(yīng)性皮炎發(fā)病而改變的蛋白質(zhì)的表達，使用各種抗體，通過Western印跡法進行分析。首先，因由二維電泳的結(jié)果鑒定的蛋白質(zhì)中含有半乳糖凝集素-3(Galectin-3)，所以著眼于半乳糖凝集素家族進行確認。半乳糖凝集素是糖蛋白質(zhì)的一種，不具有通常的信號序列，但受免疫反應(yīng)等的刺激或不受刺激而向細胞外釋放。有報道指出，各半乳糖凝集素分子顯示不同的組織分布，參與免疫調(diào)節(jié)、細胞.基質(zhì)間粘著、細胞間粘著、創(chuàng)傷治愈等種種不同的生理現(xiàn)象(參照J.Biol.Chem.264:1310-1316(1989)，J.Biochem.104:1-4 (1988)，Proc.Natl Acad.Sc1.USA.87:7324-7328 (1990)，Eur.J.Biochem.248:225-230 (1997)，Dev.Biol.168:259-271 (1995)，J.Biol.Chem.270:5823-5829 (1995)，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.93:7252-7257 (1996))。因此,除半乳糖凝集素-3 (Galectin-3)以外,還使用半乳糖凝集素(Galectin)家族中所包含的半乳糖凝集素_1、_3、_4、-7、-8、_9 (Galectin-Ι、_3、_4、_7、-8、-9)的抗體，分析特應(yīng)性皮炎模型小鼠皮膚中表達量的變化(圖3)。其結(jié)果，對于半乳糖凝集素-1、-3、_
4、-7、-8 (Galectin-Ι、-3、-4、-7、-8)來說，半抗原處理的小鼠與未處理的小鼠(對照小鼠)相比表達量減少。而另一方面，對于半乳糖凝集素_1、-4、_7、_8 (Galectin-1> -4、-7、-8)來說，還可知即使是半抗原處理的小鼠，在使其飲用乳鐵蛋白后，小鼠的表達量仍恢復(fù)到接近半抗原未處理的小鼠(對照小鼠)的水平。半乳糖凝集素-9 (Galectin-9)未因半抗原處理而發(fā)生變化，所以認為其與特應(yīng)性皮炎的相關(guān)性低。對于細胞骨架蛋白結(jié)蛋白(Desmin)、膜突蛋白(Moesin)/埃茲蛋白(Ezrin)/根蛋白(Radixin)、波形蛋白(Vimentin)也進行了同樣的分析(圖4)。半抗原處理的小鼠與未處理的對照小鼠相比，結(jié)蛋白(Desmin)的表達量減少,膜突蛋白(Moesin)/埃茲蛋白(Ezrin)/根蛋白(Radixin) (50KDa切割型)及波形蛋白(Vimentin)的表達量增加。特別是膜突蛋白(Moesin)/埃茲蛋白(Ezrin)/根蛋白(Radixin)通過半抗原處理,其低分子量的切割型明顯增加，通過乳鐵蛋白給藥后也未減少。且膜突蛋白(Moesin)/埃茲蛋白(Ezrin)/根蛋白(Radixin)屬于同一家族的蛋白質(zhì)，通過二維電泳分析，鑒定為膜突蛋白(Moesin)。因此次使用的抗體是識別此3種的抗體，所以認為由于炎癥，膜突蛋白(Moesin)或其他蛋白質(zhì)單獨或多數(shù)高表達。對于熱休克蛋白質(zhì)HSP70、HSP90、GRP94，半抗原處理的小鼠與未處理的小鼠(對照小鼠)相比，HSP70、HSP90的表達量減少，但GRP94的表達與半抗原處理、無處理無關(guān)，沒有變化(圖4)。而且，對于FABP-4 (脂肪酸結(jié)合蛋白-4:fatty acid binding protein-4) >FABP-5 (脂肪酸結(jié)合蛋白-5:fatty acid binding protein-5)、烯醇酶 I (Enolasel)、PARK7 (DJ-1)、膜聯(lián)蛋白 II (Annexin II)、載脂蛋白 Al (Apolipoprotein Al)、Rho GD I 來說，通過Western印跡法進行了分析(圖5)。其結(jié)果,對于膜聯(lián)蛋白II (Annexin II)、烯醇酶I (Enolasel)、FABP_4、PARK7，半抗原處理的小鼠與未處理小鼠(對照小鼠)相比表達量減少。且除FABP-4以外，即使是半抗原處理的小鼠，在使其飲用乳鐵蛋白后，小鼠的表達量仍恢復(fù)到了接近半抗原未處理的小鼠(對照小鼠)的水平。另一方面，對于Rho⑶1、FABP-5、載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)來說,半抗原處理的小鼠與未處理的小鼠(對照小鼠)相比表達增加(圖5)。已知Rho⑶I減弱細胞間的粘著，所以，因特應(yīng)性皮炎發(fā)病此蛋白質(zhì)的表達增加可能與其參與特應(yīng)性皮炎中的皮膚脫離有關(guān)。4.使用特應(yīng)性皮炎患者的皮膚組織進行SDS-PAGE分析從上述結(jié)果中，篩選使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠的候選特應(yīng)性皮炎標記物，但需調(diào)查這些蛋白質(zhì)能否成為人體特應(yīng)性皮炎的標記物。因此，實際從特應(yīng)性皮炎發(fā)病者的炎癥部位(圖6、A.P.)和非炎癥部位(Control)、特應(yīng)性皮炎未發(fā)病的志愿者的相同部位(Control)使用稱為角質(zhì)測試儀的膜片狀物品采集樣品。從人體皮膚的相同部位回收3片膜片的樣品，然后使用IXSDS樣品緩沖液溶解皮膚組織。其后，使用特應(yīng)性皮炎發(fā)病者(2人)和非發(fā)病者(3人)的樣品進行SDS-PAGE，使用質(zhì)譜儀(MALDI T0F-MS)對特應(yīng)性皮炎發(fā)病的樣品中表達增加的蛋白質(zhì)進行鑒定。其結(jié)果表明，膜聯(lián)蛋白II (Annexin II)、鱗狀細胞癌抗原I (squamous cell carcinoma antigen-1) (SCCAl)、鱗狀細胞癌抗原2(squamous cell carcinoma antigen-2) (SCCA2)、月旨肪酸結(jié)合蛋白 _5(fatty acid bindingprotein-5 (FABP-5))、血清白蛋白(Serum albumin)及免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G)的表達隨特應(yīng)性皮炎發(fā)病而增加(圖6)。另一方面,也表明精氨酸酶I (Arginase I)及尿嘧啶DNA糖基化酶(Uraci1-DNA glycosylase)的表達在特應(yīng)性皮炎發(fā)病者中減少(圖6)。5.通過使用特應(yīng)性皮炎患者皮膚組織的各種抗體進行分析使用特應(yīng)性皮炎模型小鼠通過Western印跡法的分析時,發(fā)現(xiàn)有17種蛋白質(zhì)發(fā)生了變化。測定這些蛋白質(zhì)在人體特應(yīng)性皮炎的炎癥發(fā)病時是否有同樣的變化(圖7)。同時通過使用特應(yīng)性皮炎患者的皮膚組織的SDS-PAGE分析，對發(fā)生變化的蛋白質(zhì)進行探討。對于膜聯(lián)蛋白II (Annexin II)來說，特應(yīng)性皮炎發(fā)病者的發(fā)病部位(圖7、A.P.)與非發(fā)病部位(Control)相比表達增加，且與特應(yīng)性皮炎非發(fā)病者的條帶相比分子量略小。此原因尚不明確，但認為此分子水平差異可能與特應(yīng)性皮炎發(fā)病者和非發(fā)病者的體質(zhì)不同有關(guān)。對于烯醇酶I (Enolasel)、鱗狀細胞癌抗原 2 (squamous cell carcinomaantigen2) (SCCA2)來說，在I名特應(yīng)性皮炎發(fā)病者的發(fā)病部位上增加。對于PARK7來說，因特應(yīng)性皮炎發(fā)病者不同其表達的增減也不一定，但與特應(yīng)性皮炎非發(fā)病者相比，特應(yīng)性皮炎發(fā)病者中仍全部顯示減少趨勢。此外,對于載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)來說,特應(yīng)性皮炎非發(fā)病者及特應(yīng)性皮炎發(fā)病者的非發(fā)病部位完全沒有表達，而只在特應(yīng)性皮炎發(fā)病部位表達增加。將以上結(jié)果歸納在表I中。表I
權(quán)利要求
1.可特異性識別伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的抗體在制備診斷或檢測特應(yīng)性皮炎的制劑中的應(yīng)用，所述特定蛋白質(zhì)包含PARK7。
2.用于判定特應(yīng)性皮炎的試劑盒，其包含可特異性識別伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變的特定蛋白質(zhì)的抗體，所述特定蛋白質(zhì)包含PARK7。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，其具備用于采集皮膚細胞及/或皮膚組織的角質(zhì)測試儀。
全文摘要
本發(fā)明以探索可成為特應(yīng)性皮炎疾病標記物的物質(zhì)為目的，涉及包括測定皮膚細胞及/或皮膚組織中特定蛋白質(zhì)的表達及/或其基因表達的判定特應(yīng)性皮炎的方法，所述方法中，所述特定蛋白質(zhì)伴隨特應(yīng)性皮炎的炎癥其表達發(fā)生改變或因特應(yīng)性皮炎起因的程度其表達發(fā)生改變。本發(fā)明還提供用于判定特應(yīng)性皮炎的炎癥程度或特應(yīng)性皮炎發(fā)病的危險度的試劑盒及鑒定具有治療及/或預(yù)防特應(yīng)性皮炎作用的物質(zhì)的方法。
文檔編號C12Q1/68GK103149368SQ20131006611
公開日2013年6月12日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者宮田智, 宮崎香, 安田知永, 巖松明彥, 池澤善郎, 相原道子, 森山佳谷乃 申請人:株式會社芳珂, 宮崎香, 池澤善郎, 相原道子, 森山佳谷乃