專利名稱：一種多效復(fù)合生防菌劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生防菌劑，特別是一種用于防治作物土傳病害的多效復(fù)合生防菌劑的制備方法及其應(yīng)用，所述的兩菌株分別為木霉菌(Trichoderma ririofe)和枯草芽胞桿菌{BadIlus subtilis、。
背景技術(shù)：
隨著越來(lái)越多有毒化學(xué)農(nóng)藥被限制使用，世界各國(guó)都在加大生物農(nóng)藥的研發(fā)力度。木霉菌作為一類有重要生防價(jià)值的拮抗性真菌，早在20世紀(jì)30年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)植物病原真菌有拮抗作用，其作用機(jī)制包括產(chǎn)生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競(jìng)爭(zhēng)作用等。木霉菌強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)及生存能力在抑制病原菌尤其是土傳病害的過(guò)程中起著重要作用，是一種很有開發(fā)利用價(jià)值的生防菌。目前國(guó)際上已開發(fā)注冊(cè)有很多木霉菌產(chǎn)品，但由于木霉菌的生防機(jī)理所決定的木霉菌只能定殖在植物根表，在施用方式上只能用于作物發(fā)病前的預(yù)防而一旦發(fā)病，病原菌進(jìn)入植物體內(nèi)僅靠木霉菌解決不了，尤其對(duì)土傳類病害的生物防治更是如此，這也在很大程度上制約了木霉菌生物農(nóng)藥的規(guī)摸化生產(chǎn)與應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌的有關(guān)文獻(xiàn)記載的是一類普遍存在于土壤中、植物體表和體內(nèi)的微生物，具有抵抗高溫、低溫、干燥及營(yíng)養(yǎng)缺乏等不良環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，有些菌株可在植株體內(nèi)傳導(dǎo)定殖和發(fā)揮促生作用，主要抑菌機(jī)理是通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)，并能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，與寄主植物建立和諧共生關(guān)系。定殖于宿主體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌，有充足的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，不易受外界逆境因子影響，與其它根際、葉際生防菌相比，穩(wěn)定的生存環(huán)境更利于其發(fā)揮生防的作用。將具有不同生防機(jī)理的多種生防菌株復(fù)合使用可明顯提高防治效果已得到證實(shí)。如酵母菌和細(xì)菌復(fù)合使用可有效防治蔬菜灰霉病、放線菌混合芽孢桿菌防治草莓黃萎病等。將根際定殖的木霉菌與維管束內(nèi)定殖的內(nèi)生細(xì)菌復(fù)配成多功能生物農(nóng)藥尚未見報(bào)道。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室多年試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5.subtil is)能抑制許多植物病原真菌菌絲體的正常生長(zhǎng)或直接殺滅病菌，對(duì)土壤真菌包括鐮刀菌、腐霉菌、絲核菌等病原菌引起的多種作物枯萎病、猝倒病、立枯病等有控制作用。通過(guò)耐利福平枯草芽胞桿菌突變菌株標(biāo)記回收和DAS-ELISA等方法對(duì)枯草芽胞桿菌在瓜類植株體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌可在作物組織內(nèi)定殖并具有系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)能力，即隨著植物的生長(zhǎng)而在體內(nèi)繁衍，其代謝產(chǎn)物對(duì)許多病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，表明代謝產(chǎn)物中存在著抗生素類物質(zhì)，其代謝物質(zhì)具較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性及對(duì)紫外線較強(qiáng)的耐性。利用生防木霉菌與內(nèi)生性枯草芽孢桿菌防治作物土傳病害的不同作用方式及生防機(jī)理將兩者協(xié)同施用，將成為提高作物土傳病害防治效果的重要手段，可解決木霉菌生物防治作用不穩(wěn)定之不足
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于防治農(nóng)作物土傳病害的多效生防菌劑制備方法及其應(yīng)用，與其它發(fā)明不同的是，本制劑克服已有技術(shù)的不足，根據(jù)土傳病害的發(fā)生特點(diǎn)，通過(guò)從作物根表分離出拮抗木霉菌及枯草芽胞桿菌-內(nèi)生拮抗細(xì)菌，將其復(fù)配成微生物制劑。本發(fā)明通過(guò)多年大量研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)拮抗木霉菌具有強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)生存能力及對(duì)土壤中病原菌的重寄生作用，而大多數(shù)拮抗枯草芽胞桿菌可在作物組織內(nèi)定殖并具有系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)能力，即隨著植物的生長(zhǎng)而在體內(nèi)繁衍，其代謝產(chǎn)物對(duì)許多病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，利用二者對(duì)作物不同生態(tài)位點(diǎn)作用方式同時(shí)施用具有協(xié)同增效作用，可使防治效果達(dá)75%以上，
本發(fā)明的目的是按如下內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的:
所采用的生防菌取自于作物根表的木霉菌和內(nèi)生枯草芽胞桿菌為母菌劑，將其分別純化后轉(zhuǎn)移至PDA試管斜面內(nèi)作母菌劑，在三角瓶?jī)?nèi)振蕩培養(yǎng)為二級(jí)菌種，再通過(guò)液體發(fā)酵使其產(chǎn)生抗逆性木霉菌厚垣孢子和枯草芽胞桿菌孢子，將載有大量孢子的發(fā)酵產(chǎn)物與載體混合后制成多效復(fù)合生防制劑。所述多效復(fù)合生防菌劑按如下方法制備而成:
A:斜面母菌種的制備:
取作物根表土壤10克，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按I: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素
0.03克、水1000毫升；
取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒2-4分鐘后，再以無(wú)菌水沖洗3-5次后研碎，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按1: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得內(nèi)生枯草芽胞桿菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、7K 1000毫升；
B: 二級(jí)菌種的制備:
二級(jí)菌種培養(yǎng)液為紅糖20-30克，酵母2-5克，調(diào)pH值為7-9，加水至1000毫升。分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121°C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28-30°C，發(fā)酵時(shí)間為2_3天；
C:液體發(fā)酵:
制備木霉菌厚垣孢子:
培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯150 - 200克，葡萄糖15 - 20克，磷酸二氫鉀I 一 2克，硫酸鎂I — 2克，硫酸鈣I — 2克，色氨酸3 — 5克，果糖2 — 4克，水1000毫升:調(diào)pH值為5 —
6.5，121°C下滅菌30-40分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的2 — 4%，發(fā)酵溫度為23 — 25°C，攪拌速度為120-150rpm，發(fā)酵時(shí)間3 — 5天，得到木霉菌厚垣孢子懸浮液；
制備枯草芽胞桿菌孢子:
培養(yǎng)基配方為:牛肉膏2-4克g、蛋白胨5-10克、酵母膏2-5克、蔗糖10-20克、磷酸二氫鉀I 一 2克，硫酸鎂I 一 2克、水1000毫升；調(diào)PH值為7-8，121°C下滅菌30-40分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的2 - 4%，發(fā)酵溫度為28-30°C，攪拌速度為120-150rpm，發(fā)酵時(shí)間3 - 5天，得到枯草芽胞桿菌孢子懸浮液；
D:生防菌劑的制備:將所得木霉菌厚垣孢子懸浮液按重量比例8-10%、內(nèi)生枯草芽胞桿菌孢子懸浮液按重量比例10-12%與輕質(zhì)碳酸I丐按重量比例20-30%和娃藻土按重量比例50 - 60%充分混合后制成生防制劑。將多效復(fù)合生防菌劑與土或水按重量比例1:100-300混合，采用床面拌土或穴施或灌根的方法防治作物土傳病害。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1.本發(fā)明綠色木霉菌厚垣孢子作為一種抗逆類型的孢子形態(tài)，與內(nèi)生芽孢桿菌的芽孢一樣具有抵抗高溫、低溫、干燥及營(yíng)養(yǎng)缺乏等不良環(huán)境的能力。將兩孢子用滅菌硅藻土吸附并制成制劑，于室溫下保藏2年，孢子仍然能夠萌發(fā)。通過(guò)人工培養(yǎng)后又放歸于自然，并使之在自然微生物區(qū)系中進(jìn)一步繁衍，形成有益微生物在土壤中的良性循環(huán)，有利于保持根際微生態(tài)的自然平衡，達(dá)到對(duì)病害的持續(xù)控制。2.內(nèi)生芽孢桿菌繁殖速度極快，在作物根表形成生物屏障阻止病原菌侵染，同時(shí)附著在根系的芽孢桿菌在土壤和根表分泌抗生物質(zhì)有效地抑制了病菌孢子的萌發(fā)，進(jìn)入植株體內(nèi)的芽孢桿菌可通過(guò)傳導(dǎo)抑制和殺死病菌。3.木霉菌可在根表定殖，通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及占領(lǐng)生態(tài)位點(diǎn)等發(fā)揮生防作用，枯草芽孢桿菌可在植物體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)，抑制及殺死進(jìn)入植株體內(nèi)的病原菌，兩類生防菌分別在根表與根內(nèi)形成了雙重生態(tài)屏障。4.引起作物的土傳病害病原菌一般都是是從苗期開始侵入，在寄主維管束中繁殖，在苗期通過(guò)木霉生防菌阻止病原菌對(duì)根系的侵入為第一道屏障，以進(jìn)入植物體內(nèi)的枯草芽孢桿菌為第二道屏障，對(duì)控制后期病害意義重大。本發(fā)明適用于大多數(shù) 木霉菌株和芽孢桿菌，方法簡(jiǎn)單易行，適合于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1
A:斜面母菌種的制備:
取作物根表土壤10克，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按I: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素0.03克、水1000毫升；
取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒2分鐘后，再以無(wú)菌水沖洗3次后研碎，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基:按1: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得內(nèi)生枯草芽胞桿菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、7K 1000毫升；
B: 二級(jí)菌種的制備:二級(jí)菌種培養(yǎng)液為紅糖20克，酵母5克，調(diào)pH值為7，加水至1000毫升；分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121°C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵時(shí)間為3天；
C:液體發(fā)酵:
制備木霉菌厚垣孢子:培養(yǎng)基配方為馬鈴薯150克，葡萄糖15克，磷酸二氫鉀2克，硫酸鎂2克，硫酸鈣2克，色氨酸5克，果糖4克，水1000毫升；調(diào)pH值為5，121°C下滅菌30分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的4%，發(fā)酵溫度為23°C，攪拌速度為150rpm，發(fā)酵時(shí)間5天，得木霉菌厚垣孢子懸浮液；
制備枯草芽胞桿菌孢子:培養(yǎng)基配方為牛肉膏2克、蛋白胨10克、酵母膏2克、蔗糖10克、磷酸二氫鉀I克、硫酸鎂I克、水1000毫升^PH值為7，121°C下滅菌30分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的2%,發(fā)酵溫度為28°C，攪拌速度為120rpm，發(fā)酵時(shí)間5天，得枯草芽胞桿菌孢子懸浮液；
D:生防菌劑的制備:將所得木霉菌厚垣孢子懸浮液按重量比例8%、內(nèi)生枯草芽胞桿菌孢子懸浮液按重量比例12%與輕質(zhì)碳酸I丐按重量比例20%、娃藻土按重量比例60%充分混合后制成生防制劑。用于瓜類作物土傳病防治試驗(yàn)結(jié)果表明:在黃瓜播種時(shí)，以本制劑與土按重量比例1:100混合，裝營(yíng)養(yǎng)缽育苗，坐果前期，再以本制劑與水按重量比例1:300混合，灌根一次，防治效果達(dá)82.12%。在西瓜播種時(shí)，以本制劑與土按重量比例1:100混合，裝營(yíng)養(yǎng)缽育苗，坐果前期，再以本制劑與水按重量比例1:300混合，灌根一次，防治效果76.44%。實(shí)施例2
A:斜面母菌種的制備:
取作物根表土壤10克，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按I: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素0.03克、水1000毫升；
取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒3分鐘后，再以無(wú)菌水沖洗4次后研碎，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按1: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得內(nèi)生枯草芽胞桿菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、/K 1000毫升；
B: 二級(jí)菌種的制備:
二級(jí)菌種培養(yǎng)液為紅糖25克，酵母3克，調(diào)pH值為8，加水至1000毫升；分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121°C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度29°C，發(fā)酵時(shí)間為3天；
C:液體發(fā)酵:
制備木霉菌厚垣孢子:
培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯180克，葡萄糖18克，磷酸二氫鉀1.5克，硫酸鎂1.5克，硫酸鈣
1.5克，色氨酸4克，果糖3克，水1000毫升；調(diào)pH值為6，121°C下滅菌30分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的3%，發(fā)酵溫度為24°C，攪拌速度為130rpm，發(fā)酵時(shí)間4天，得到木霉菌厚垣孢子懸浮液；
制備枯草芽胞桿菌孢子:培養(yǎng)基配方為:牛肉膏3克、蛋白胨8克、酵母膏4克、蔗糖15克、磷酸二氫鉀1.5克，硫酸鎂1.5克、水1000毫升；調(diào)PH值為7.5，121°C下滅菌35分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的3.5%，發(fā)酵溫度為29°C，攪拌速度為140rpm，發(fā)酵時(shí)間4天，得到內(nèi)生枯草芽胞桿菌孢子懸浮液；
D:生防菌劑的制備:將所得木霉菌厚垣孢子懸浮液按重量比例9%、內(nèi)生枯草芽胞桿菌孢子懸浮液按重量比例11%與輕質(zhì)碳酸鈣按重量比例25%硅藻土按重量比例55%充分混合后制成生防制劑。在甜瓜播種時(shí)，以本制劑與土按重量比例1:200混合于育苗床，坐果前期，再以本制劑與水按重量比例1:300混合，灌根一次，防治土傳病效果77.06%。在辣椒播種時(shí)，以本制劑與土按重量比例1:300混合于育苗床，坐果前期，再以本制劑與水按重量比例1:300混合，灌根一次，防土傳病效果75.36%ο實(shí)施例3
A:斜面母菌種的制備:
取作物根表土壤10克，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按I: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素0.03克、水1000毫升；
取作物根系10克，用0.1% 升汞溶液表面消毒4分鐘后，再以無(wú)菌水沖洗5次后研碎，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按1: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得內(nèi)生枯草芽胞桿菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種；
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、7K 1000毫升；
B:二級(jí)菌種的制備:
二級(jí)菌種培養(yǎng)液為紅糖30克，酵母2克，調(diào)pH值為9，加水至1000毫升。分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121°C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間為2天；
C:液體發(fā)酵:
制備木霉菌厚垣孢子:培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀I克，硫酸鎂I克，硫酸鈣I克，色氨酸3克，果糖2克，水1000毫升；調(diào)pH值為6.5，121°C下滅菌40分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的2%，發(fā)酵溫度為25°C，攪拌速度為120rpm，發(fā)酵時(shí)間3天，得到木霉菌厚垣孢子懸浮液；
制備枯草芽胞桿菌孢子:培養(yǎng)基配方為:牛肉膏4克、蛋白胨5克、酵母膏5克、蔗糖20克、磷酸二氫鉀2克，硫酸鎂2克、水1000毫升；調(diào)PH值為8，121°C下滅菌40分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的4%，發(fā)酵溫度為230°C，攪拌速度為150rpm，發(fā)酵時(shí)間3天，得到內(nèi)生枯草芽胞桿菌孢子懸浮液；
D:生防菌劑的制備:將所得木霉菌厚垣孢子懸浮液按重量比例10%、內(nèi)生枯草芽胞桿菌孢子懸浮液按重量比例10%與輕質(zhì)碳酸I丐按重量比例30%和娃藻土按重量比例50%充分混合后制成生防制劑。在玉米播種時(shí)，以本制劑與土按重量比例1:100混合，進(jìn)行穴施，防治玉米莖腐病效果達(dá)78.36%。在人參2年苗移栽時(shí)，先用本制劑每簾(10平方米)200克均勻混入?yún)⒋哺鲗?，展葉后以本制劑與水按重量比例1:300混合，灌根一次，防治人參根病效果為77.97%。參考文獻(xiàn): 1.生防木霉菌的生物安全性檢測(cè).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(4)
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3.綠色木霉菌T23對(duì)黃瓜枯萎病防治效果及防御酶活性影響.植物病理學(xué)報(bào)，2005 (2)
4.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) B6對(duì)甜瓜枯萎病的生防作用.果樹學(xué)報(bào)2008(6)
權(quán)利要求
1.一種多效復(fù)合生防菌劑的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟: (1)斜面母菌種的制備: 取作物根表土壤10克，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按I: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得木霉菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種； PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈霉素0.03克、水1000毫升； 取作物根系10克，用0.1%升汞溶液表面消毒2-4分鐘后，再以無(wú)菌水沖洗3-5次后研碎，加無(wú)菌水稀釋至1000毫升稀釋液，將稀釋液與PDA培養(yǎng)基按1: 9的重量比例混合后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，26°C下培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)分離獲得內(nèi)生枯草芽胞桿菌；純化后轉(zhuǎn)移至試管斜面內(nèi)作斜面母菌種； PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、7K 1000毫升； (2)二級(jí)菌種的制備: 二級(jí)菌種培養(yǎng)液為紅糖20-30克，酵母2-5克，調(diào)pH值為7-9，加水至1000毫升。分裝在250毫升三角瓶中，裝液量為100毫升，在121°C下滅菌30分鐘，接入斜面母菌種，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/ 分，發(fā)酵溫度28-30°C，發(fā)酵時(shí)間為2_3天； (3)液體發(fā)酵: 制備木霉菌厚垣孢子: 培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯150 - 200克，葡萄糖15 - 20克，磷酸二氫鉀I 一 2克，硫酸鎂I — 2克，硫酸鈣I — 2克，色氨酸3 — 5克，果糖2 — 4克，水1000毫升；調(diào)pH值為5 —6.5，121°C下滅菌30-40分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的2 — 4%，發(fā)酵溫度為23 — 25°C，攪拌速度為120-150rpm，發(fā)酵時(shí)間3 — 5天，得到木霉菌厚垣孢子懸浮液； 制備枯草芽胞桿菌孢子: 培養(yǎng)基配方為:牛肉膏2-4克g、蛋白胨5-10克、酵母膏2-5克、蔗糖10-20克、磷酸二氫鉀I 一 2克，硫酸鎂I 一 2克、水1000毫升；調(diào)PH值為7-8，121°C下滅菌30-40分鐘，接菌量為培養(yǎng)基重量的2 - 4%，發(fā)酵溫度為28-30°C，攪拌速度為120-150rpm，發(fā)酵時(shí)間3 - 5天，得到枯草芽胞桿菌孢子懸浮液； (4)生防菌劑的制備:將所得木霉菌厚垣孢懸浮液子按重量比例8-10%、枯草芽胞桿菌孢子懸浮液按重量比例10-12%與輕質(zhì)碳酸鈣按重量比例20-30%和硅藻土按重量比例50 - 60%充分混合后制成生防制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述的多效復(fù)合生防菌劑的應(yīng)用，其特征在于:將多效復(fù)合菌劑按重量比例100-300倍采用床面拌土或穴施或灌根的方法防治作物土傳病害。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于防治物土傳病害的多效生防菌劑的制備方法及其應(yīng)用。采用對(duì)作物土傳病害病原菌具有拮抗作用的木霉菌株和內(nèi)生枯草芽胞桿菌為母菌劑，以輕質(zhì)碳酸鈣為載體制成生防菌制劑，該菌劑主要用于防治由鐮孢菌、腐霉菌、絲核菌等病原真菌引起的多種作物土傳病害，同時(shí)具有提高植物自身抗性、增加產(chǎn)量的多重功能。產(chǎn)品生產(chǎn)周期短，防治效果穩(wěn)定持久，對(duì)作物無(wú)殘留，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。
文檔編號(hào)C12R1/125GK103141518SQ20131006626
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者鄭雅楠, 楊長(zhǎng)成, 魏漢蓮, 高增貴, 李可強(qiáng), 關(guān)昕, 莊敬華 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)