專利名稱：一種高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于能源微藻一葡萄藻開發(fā)利用的技術(shù)，特別涉及一種高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法。
背景技術(shù)：
葡萄藻(Botryococcus)是一種世界廣布的能源微藻，該藻因脂質(zhì)含量通常為其細(xì)胞干重的25-35%，普遍高于小球藻等其它微藻，且脂質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)與化石原油的也最為相近，而被譽(yù)為“油藻”，以其生產(chǎn)航空燃油等高品質(zhì)燃料一直是近年來全球生物能源領(lǐng)域的石開發(fā)熱點之一 [Metzger & Largeau.Botryococcus brauni1: a rich source forhydrocarbons and related ether lipids.Appl Microbiol Biotechnol.2005, 66:486 - 496; Sakamoto, et al.0ptimization of light for growth, photosynthesis,and hydrocarbon production by the colonial microalga Botryococcus brauniiBOT-22.Bioresource Technology.2012, 110: 474 479.]。種子工程是農(nóng)業(yè)與生物產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)，選育優(yōu)良種質(zhì)的重要性不僅在螺旋藻、小球藻等經(jīng)濟(jì)微藻的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中得到了充分體現(xiàn)，在推進(jìn)水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、低成本生產(chǎn)中更是表現(xiàn)得淋漓盡致。值得指出的是，有關(guān)葡萄藻優(yōu)良種質(zhì)選育雖已受到國內(nèi)外的高度重視，但在葡萄藻遺傳育種研究方面迄今近乎空白，而從自然界分離藻株的適應(yīng)性差、脂質(zhì)產(chǎn)率低等問題，也正是制約著葡萄藻至今尚未能得到商業(yè)化開發(fā)應(yīng)用的主要瓶頸。因此，迫切需要運用誘發(fā)突變等現(xiàn)代育種技術(shù)，對從自然界分離獲得的葡萄藻種進(jìn)行遺傳改良，顯著提高其對人工培養(yǎng)條件的適應(yīng)性、生長速率及含脂量，這對實現(xiàn)葡萄藻的低成本工業(yè)化培殖并以之生產(chǎn)品質(zhì)和價格等均能與化石燃油相競爭的生物燃油，推進(jìn)葡萄藻制油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，具有重要意義。目前，開展高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系選育主要面臨著以下兩方面的技術(shù)難題:1、葡萄藻呈由幾十至幾百個細(xì)胞聚集而成的集落狀，其誘變頻率及突變體篩選效率遠(yuǎn)低于小球藻等呈單細(xì)胞態(tài)的微藻；2、還沒有建立適于篩選高脂質(zhì)含量突變體的選擇壓力，只能先將藻液涂于平板分離培養(yǎng)，再將大量的克隆逐一接種到培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)后再進(jìn)行脂質(zhì)測定，因而篩選的工作量大、效率低、成功率小。因此，迫切需要建立一種簡便、高效、高通量的高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的培育方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，建立一種高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:提供一種高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法，該方法是:將葡萄藻液置于離心管，加入微粒型的黃單胞多糖，然后置于冰水浴中 ，并用超聲波將由幾十至上百個細(xì)胞形成的葡萄藻集落制備成單細(xì)胞；單細(xì)胞化的葡萄藻經(jīng)紫外線輻射誘變及低熔點瓊脂糖(lowmelting agarose)固定化培養(yǎng)后，利用尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術(shù)獲得高含脂量的葡萄藻候選突變體；再經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和脂質(zhì)含量測定選育出高脂質(zhì)含量的葡萄藻新品系；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基后的瓊脂糖(低熔點瓊脂糖系常用的生物培養(yǎng)與分子操作實驗素材，其熔點約為65°C，比普通瓊脂糖的熔點低30°C左右)；所述的高脂質(zhì)含量的葡萄藻是指脂質(zhì)含量比其出發(fā)品系至少高30%的葡萄藻。本發(fā)明具體包括以下步驟:(I)取4 mL待測葡萄藻液于5 mL離心管中，再加入微粒型黃單胞多糖，并置于冰水浴中預(yù)冷；微粒型黃單胞多糖的添加量為5粒,0.2 mg/粒,共I mg ；(2)預(yù)冷藻液經(jīng)超聲波處理10 s后，在光學(xué)顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細(xì)胞；(3)若沒有，則用每次5 s的超聲波進(jìn)行多次處理，直至被分散成單細(xì)胞，由此計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間T=10+5Xn，單位為S，其中η為每超聲處理5 s的次數(shù)；(4)用孔徑為0.45 Mffl的無菌濾膜過濾藻液使藻細(xì)胞均勻平鋪于濾膜上，并用紫外線進(jìn)行誘變處理；(5)將濾膜上的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，并使其560 nm的光密度D56tl為0.05，轉(zhuǎn)Λ10 ml的PE管中，每管裝4 ml，并置于37°C水浴中保溫；(6)用低熔點瓊脂糖固定細(xì)胞，并置于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d ；(7)將含藻細(xì)胞的低熔點瓊脂糖凝膠切成I mm厚的圓片，并置于含2%(V/V) 二甲基亞砜和I Pg/mL尼羅紅的染色液中于黑暗下40°C染色10 min ；同時，按上述步驟制備對照組，其中省去步驟(4)中用紫外線誘變處理藻細(xì)胞；(8)取I片染色后的對照組藻細(xì)胞的凝膠片并展到載玻片上，置于熒光顯微鏡上用藍(lán)光激發(fā)，通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕調(diào)節(jié)激發(fā)光強(qiáng)度直至能看到具紅色熒光的葡萄藻細(xì)胞，再通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕逐漸調(diào)低激發(fā)光的強(qiáng)度，至顯微視野中藻細(xì)胞的熒光剛好消失，記下電流表上表征此時藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)度的電流值I，繼續(xù)調(diào)節(jié)藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕使電流表的電流值降至21/3，保持此時旋鈕的位置不變；(9)將經(jīng)紫外線誘變的藻細(xì)胞的凝膠片用尼羅紅染色后展到載玻片上，并置于熒光顯微鏡上用調(diào)節(jié)好光強(qiáng)度的藍(lán)光激發(fā)，當(dāng)觀察到具紅色熒光的藻細(xì)胞時，用接種針挑取相應(yīng)的凝膠塊，并置于含I ml培養(yǎng)液的2 ml PE管中，用頻率為20 kHz、發(fā)射功率為100 W、以I s / I s的開/關(guān)間歇的超聲波處理20 s以粉碎凝膠塊，再置于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，即獲得高脂質(zhì)含量的葡萄藻新品系。本發(fā)明中，在步驟(2)或(3)中制備葡萄藻單細(xì)胞時，設(shè)定超聲波儀的頻率為20kHz，發(fā)射功率為100 W，將Φ2型變幅桿前端2 cm浸入預(yù)冷藻液，以I s / I s的/關(guān)間歇超聲處理15 25 S。在本發(fā)明步驟(4)中，所述誘變處理是:將濾膜上的藻細(xì)胞放置于距18W紫外燈管20 cm處,用紫外線照射15 min,再避光3 h。在本發(fā)明步驟(6)中 ，使用與藻液等體積的濃度為2%、65°C的低熔點瓊脂糖(lowmelting agarose)進(jìn)行固定藻細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點:
本發(fā)明方法與傳統(tǒng)選育方法相比，具有簡便、高效，且可實現(xiàn)高通量篩檢等優(yōu)點，可為葡萄藻育種等提供必要的技術(shù)方法。
具體實施例方式為提高誘變育種的誘變頻率及突變體的有效篩選率，通常需將誘變材料單細(xì)胞化。本方法用適當(dāng)功率超聲波處理將細(xì)胞呈集落狀的葡萄藻制備成單細(xì)胞。為減少超聲波對藻細(xì)胞的機(jī)械損傷，本方法于超聲處理前在藻液中加入少量黃單胞多糖(Xanthan gum),利用其能在藻細(xì)胞表面形成膜狀物，且可使超聲波能量傳遞變得更加平緩等特性，而達(dá)到了良好效果。紫外線是一種高效的物理誘變因子，它能使生物的遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生變異。同時，尼羅紅(9_ (diethylamino) benzo [a]phenoxazin_5 (5H) -one)是一類親脂性的卩惡嗪類染料，進(jìn)入藻細(xì)胞后能與胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合并發(fā)出特異波長的熒光，且熒光強(qiáng)度與脂質(zhì)含量呈正相關(guān)，因而可利用熒光顯微鏡觀測藻細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，篩選出脂量含量比出發(fā)品系的至少高30%的新品系。在實際篩選中，可通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上激發(fā)光強(qiáng)度的電流調(diào)控旋鈕使未經(jīng)誘變處理的藻細(xì)胞(即出發(fā)品系)的熒光剛消失，此時表征藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)度的電流為I，繼續(xù)調(diào)節(jié)藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕使表征藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)度的電流降至21/3，在此條件下，只有含脂量比出發(fā)品系的至少高30%的藻細(xì)胞才能見有熒光，且熒光越亮即意謂藻細(xì)胞的脂質(zhì)含量越高 ，將具熒光的藻細(xì)胞挑選出來后經(jīng)進(jìn)一步培養(yǎng)與檢測，即可獲得高脂質(zhì)含量的突變體。本方法比傳統(tǒng)方法更簡便、高效，且可實現(xiàn)高通量篩檢。下面通過具體實施例子，對本發(fā)明的實現(xiàn)方式進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明的技術(shù)方案可以通過以下步驟實現(xiàn):1、選用樣本材料:以公知的葡萄藻品系UTEX 572 (保藏單位:CultureCollection of Algae at the University of Texas at Austin ;地址:The Universityof Texas at Austin, The Culture Collection of Algae (UTEX), 205 ff.24th St.StopA6700, Austin, TX 78712-1240，USA)為材料，這株品系是實驗室常用的葡萄藻，在發(fā)明人所在的浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存，可隨時提供樣本。2、試劑和儀器:本發(fā)明中所用的微粒型黃單胞多糖(Xanthan gum,約0.2 mg/粒)、尼羅紅(NR)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)、低熔點瓊脂糖(low meltingagarose)均為美國Sigma公司產(chǎn)品；微粒型黃單胞多糖是指用造粒-干燥設(shè)備先將黃單胞多糖等物料制成大小均勻的圓球體顆粒、再進(jìn)行干燥而獲得的微粒狀劑型，其單粒重可通過調(diào)整工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)控。JY92-1I型超聲波發(fā)生儀由寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；Ultrospec 2000型紫外可見分光光度計為美國Pharmacia公司產(chǎn)品；TE214S型電子天平為北京賽多利斯產(chǎn)品；18W紫外燈管為Philip公司產(chǎn)品；CFM-330型熒光顯微鏡為上海長方光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。3、高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法的主要步驟如下:(I)取4 mL待測光密度值的葡萄藻液于5 mL離心管中，再加入5粒(I mg)微粒型黃單胞多糖(Xanthan gum),并置于冰水浴中預(yù)冷；(2)設(shè)定超聲波儀的頻率為20 kHz，發(fā)射功率為100 W，將Φ2型變幅桿前端2 cm浸入步驟(I)的預(yù)冷藻液，以I S / I S (開/關(guān))間歇超聲10 S后，用玻璃吸管取約10μ 藻液在光學(xué)顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細(xì)胞；(3)若葡萄藻集落未被分散成單細(xì)胞，則按步驟(2)中的方法再超聲處理5 S，再用光學(xué)顯微鏡下觀察是否已被分散成單細(xì)胞；(4)重復(fù)步驟(3)，直至將葡萄藻集落分散成單細(xì)胞，由此可計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間Τ=10+5*η，單位為S，其中η為每超聲處理5 s的次數(shù)；(5)用孔徑為0.45 Mffl的無菌濾膜過濾藻液使藻細(xì)胞均勻平鋪于濾膜上，并放置于距18W紫外燈管20 cm處紫外線照射15 min,再避光3 h以阻止DNA損傷光修復(fù)；(6)將濾膜上的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，并使其560 nm的光密度(D56tl)為0.05，轉(zhuǎn)入10 ml的PE管中，每管裝4 ml，并置于37°C水浴中保溫；(7)各PE管中加入65°C濃度為2%的低熔點瓊脂糖4 ml，迅速蓋好蓋并巔倒混勻后，豎直置于試管架上，于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d ；(8)用手術(shù)刀和手術(shù)剪小心切開PE管，取出圓柱形的低熔點瓊脂糖凝膠，用手術(shù)刀切成約I mm厚的圓片，并置于含2%(V/V) 二甲基亞砜和I Pg/mL尼羅紅的染色液中于黑暗下40°C染色10 min ；同時，按上述步驟制備對照組，其中省去步驟⑷中用紫外線誘變處理藻細(xì)胞；(9)取I片染色后的對照組藻細(xì)胞的凝膠片并展到載玻片上，置于熒光顯微鏡上用藍(lán)光激發(fā)，通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕調(diào)節(jié)激發(fā)光強(qiáng)度直至能看到具紅色熒光的葡萄藻細(xì)胞，再通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕逐漸調(diào)低激發(fā)光的強(qiáng)度，至顯微視野中藻細(xì)胞的熒光剛好消失，記下電流表上表征此時藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)度的電流值I，繼續(xù)調(diào)節(jié)藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕使電流表的電流值降至21/3，保持此時旋鈕的位置不變；(9)將經(jīng)紫外線誘 變的藻細(xì)胞的凝膠片用尼羅紅染色后展到載玻片上，并置于熒光顯微鏡上用調(diào)節(jié)好光強(qiáng)度的藍(lán)光激發(fā)，當(dāng)觀察到具紅色熒光的藻細(xì)胞時，用接種針挑取相應(yīng)的凝膠塊，并置于含I ml培養(yǎng)液的2 ml PE管中，用頻率為20 kHz、發(fā)射功率為100 W、以I s / I s的開/關(guān)間歇的超聲波處理20 s以粉碎凝膠塊，再置于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，即可獲得脂質(zhì)含量至少比出發(fā)品系的高30%的葡萄藻新品系。4、結(jié)果與分析根據(jù)實驗結(jié)果，葡萄藻品系UTEX 572藻液在含0.25%。黃單胞多糖(Xanthan gum)的情況下，經(jīng)20 s (n=2)超聲處理，由幾十至上百個細(xì)胞形成的集落可被分散成單細(xì)胞。這種單細(xì)胞化的葡萄藻過濾至0.45 Mm的無菌濾膜上，并放置于距18W紫外燈管20 cm處用紫外線照射15 min后再避光3 h，利用低熔點瓊脂糖固定及尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術(shù)，篩選到I株高含脂量的葡萄藻候選突變體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和脂質(zhì)含量測定[按Rao等(Influence of CO2 on growth and hydrocarbon production in Botryococcus brauni1.J.Microbiol.Biotechnol.2007, 17: 414 - 419)干重稱量法進(jìn)行],此新品系的脂質(zhì)含量為細(xì)胞干重的50.4%，比其出發(fā)品系UTEX 572的高51%。作為實例，我們另選取公知的2株脂質(zhì)含量分別為32.6%和28.8%的葡萄藻品系UTEX 2441和UTEX B2629來驗證本發(fā)明的實用性。利用本發(fā)明方法，UTEX 2441和UTEXB2629分別經(jīng)15 s和25 s超聲處理制得單細(xì)胞，放置于距18W紫外燈管20 cm處用紫外線照射15 min后再避光3 h，利用低熔點瓊脂糖固定及尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術(shù)，分別選育出I株含脂量比UTEX 2441的高43%，以及I株含脂量比UTEX B2629的高46%的高含脂葡萄藻新品系。這些例子進(jìn)一步說明，本發(fā)明建立的高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法是有效和 實用的。
權(quán)利要求
1.一種高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法，其特征在于，該方法是:將葡萄藻液置于離心管，加入微粒型的黃單胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超聲波將由幾十至上百個細(xì)胞形成的葡萄藻集落制備成單細(xì)胞；單細(xì)胞化的葡萄藻經(jīng)紫外線輻射誘變及低熔點瓊脂糖固定化培養(yǎng)后，利用尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術(shù)獲得高含脂量的葡萄藻候選突變體；再經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和脂質(zhì)含量測定選育出高脂質(zhì)含量的葡萄藻新品系；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基后的瓊脂糖；所述的高脂質(zhì)含量的葡萄藻是指脂質(zhì)含量比其出發(fā)品系至少高30%的葡萄藻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)取4mL待測葡萄藻液于5 mL離心管中，再加入微粒型黃單胞多糖，并置于冰水浴中預(yù)冷；微粒型黃單胞多糖的添加量為5粒,0.2 mg/粒,共I mg ； (2)預(yù)冷藻液經(jīng)超聲波處理10s后，在光學(xué)顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細(xì)胞； (3)若沒有，則用每次5s的超聲波進(jìn)行多次處理，直至被分散成單細(xì)胞，由此計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間T=10+5Xn，單位為S，其中n為每超聲處理5 s的次數(shù)； (4)用孔徑為0.45Mffl的無菌濾膜過濾藻液使藻細(xì)胞均勻平鋪于濾膜上，并用紫外線進(jìn)行誘變處理； (5)將濾膜上的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，并使其560nm的光密度D56tl為0.05，轉(zhuǎn)入10ml的PE管中，每管裝4 ml，并置于37°C水浴中保溫； (6)用低熔點瓊脂糖固定細(xì)胞，并置于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30d； (7)將含藻細(xì)胞的低熔點瓊脂糖凝膠切成Imm厚的圓片，并置于含2%(V/V) 二甲基亞砜和I吒/mL尼羅紅的染色液中于黑暗下40°C染色10 min ； 同時，按上述步驟制備對照組，其中省去步驟(4)中用紫外線誘變處理藻細(xì)胞； (8)取I片染色后的對照組藻細(xì)胞的凝膠片并展到載玻片上，置于熒光顯微鏡上用藍(lán)光激發(fā)，通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕調(diào)節(jié)激發(fā)光強(qiáng)度直至能看到具紅色熒光的葡萄藻細(xì)胞，再通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡上藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕逐漸調(diào)低激發(fā)光的強(qiáng)度，至顯微視野中藻細(xì)胞的熒光剛好消失，記下電流表上表征此時藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)度的電流值I，繼續(xù)調(diào)節(jié)藍(lán)色激發(fā)光電流調(diào)控旋鈕使電流表的電流值降至21/3，保持此時旋鈕的位置不變； (9)將經(jīng)紫外線誘變的藻細(xì)胞的凝膠片用尼羅紅染色后展到載玻片上，并置于熒光顯微鏡上用調(diào)節(jié)好光強(qiáng)度的藍(lán)光激發(fā)，當(dāng)觀察到具紅色熒光的藻細(xì)胞時，用接種針挑取相應(yīng)的凝膠塊，并置于含I ml培養(yǎng)液的2 ml PE管中，用頻率為20 kHz、發(fā)射功率為100 W、以I s / I s的開/關(guān)間歇的超聲波處理20 s以粉碎凝膠塊，再置于25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，即獲得高脂質(zhì)含量的葡萄藻新品系。
3.據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(2)或(3)中制備葡萄藻單細(xì)胞時，設(shè)定超聲波儀的頻率為20 kHz，發(fā)射功率為100 W，將02型變幅桿前端2 cm浸入預(yù)冷藻液，以I s / I s的/關(guān)間歇超聲處理15 25 S。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述誘變處理是:將濾膜上的藻細(xì)胞放置于距18W紫外燈管20 cm處，用紫外線照射15 min，再避光3 h。
5.據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(6)中，使用與藻液等體積的濃度為2%、65 °C的低熔 點瓊脂糖進(jìn)行固定藻細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及葡萄藻開發(fā)利用，旨在提供一種高脂質(zhì)含量葡萄藻新品系的選育方法。該方法是向葡萄藻液中加入微粒型的黃單胞多糖，置于冰水浴中用超聲波將葡萄藻集落制備成單細(xì)胞；經(jīng)紫外線輻射誘變及低熔點瓊脂糖固定化培養(yǎng)后，利用尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術(shù)獲得高含脂量的葡萄藻候選突變體；再經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和脂質(zhì)含量測定選育出高脂質(zhì)含量的葡萄藻新品系。本發(fā)明方法與傳統(tǒng)選育方法相比，具有簡便、高效，且可實現(xiàn)高通量篩檢等優(yōu)點，可為葡萄藻育種等提供必要的技術(shù)方法。
文檔編號C12N15/01GK103146678SQ201310066949
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月3日
發(fā)明者汪志平, 馬麗芳, 劉新穎, 于金鑫 申請人:浙江大學(xué)