專利名稱：一種斑點雜交檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種斑點雜交檢測方法。
背景技術(shù)：
綿羊肺腺瘤病是由一種反轉(zhuǎn)錄病毒引起，在世界范圍內(nèi)發(fā)生。主要呈地方性散發(fā)，在英國、德國、法國、荷蘭、意大利、南斯拉夫、希臘、以色列、保加利亞、土耳其、俄羅斯、南非、秘魯、印度及中國內(nèi)蒙古和新疆等地均有綿羊肺腺瘤病發(fā)病報道，特別是在蘇格蘭綿羊肺腺瘤病呈頑固的地方性散發(fā)，年發(fā)病率為20%左右，死亡率很高，可達100%。蘇格蘭的黑臉皮綿羊易感性最強，多呈單獨感染(而在有些國家如南非、美國綿羊肺腺瘤病多與綿羊進行性肺炎及巴氏桿菌引起的肺炎混合感染)。綿羊肺腺瘤病主要感染綿羊，山羊有一定的抵抗力。各品種和年齡的綿羊均能發(fā)病，本病的潛伏期長，多為2-4歲成年綿羊。在蘇格蘭，綿羊肺腺瘤病的發(fā)病率有時在一牧群中最高可達20%左右，潛伏期也大大縮短，綿羊肺腺瘤病在一個地區(qū)或一個牧場一旦發(fā)生，很難徹底消滅。本病一般都以死亡而告終。目前也有關(guān)于綿羊肺腺瘤病毒的分子生物學技術(shù)檢測的報道，但因檢測樣品的選擇容易造成污染和假陽性出現(xiàn)等原因而沒有推廣。綿羊肺腺瘤病的病原是外源性綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒，但在所有已研究過的正常綿羊基因組內(nèi)都含有27拷貝與外源性綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒密切相關(guān)的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄序列。由于內(nèi)源性綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒的存在，使得特異性檢測該病病原困難更大。針對綿羊肺腺瘤病的診斷方法，目前，全世界都沒有建立統(tǒng)一特異性診斷綿羊肺腺瘤病的方法。其原因有三個方面:一是該病的潛伏期較長，病程較長，對處于潛伏期或臨床癥狀不明顯的病羊很難發(fā)現(xiàn)。二是病羊體內(nèi)檢測不到循環(huán)抗體，很難用常規(guī)的免疫學方法進行診斷，三是引起該病的病原綿羊肺腺瘤病毒仍未建立體外培養(yǎng)體系，所以常規(guī)的病毒分離鑒定方法無法利用。目前對該病的診斷還主要依靠臨床癥狀和病理組織學檢查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例提供一種綿羊肺腺瘤病毒斑點雜交檢測方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)依靠臨床癥狀和病理組織學檢查，操作復雜，條件要求高。本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種斑點雜交檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:將含有DNA樣品的雜交膜封入雜交袋中并加入雜交溶液，封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點；將所述雜交膜置于燒杯，加入沖洗溶液于搖床中洗膜，洗去未結(jié)合的探針并封閉所述雜交膜上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；取出所述雜交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗體的馬來酸緩沖液中，使酶聯(lián)抗體與地高辛相結(jié)合并洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體；將所述雜交膜置于顯色液中顯色，使用無酶水終止反應。
本發(fā)明實施例提供的方法操作方便，耗時相對較短，無需特殊的儀器設備，試劑成本較低，陽性信號清晰，具有更高的準確率和靈敏性，可用于實驗室和臨床樣品中綿羊肺腺瘤病毒的快速準確檢測。


圖1表示本發(fā)明實施例提供的一種斑點雜交檢測方法的實現(xiàn)流程圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實施例通過針對外源性綿羊肺腺瘤病毒前病毒DNA的特定片段，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應方法制備與此特定片段互補的cDNA探針，并用地高辛標記此探針并確定該探針的靈敏度和特異性，利用斑點雜交技術(shù)，來檢測組織細胞內(nèi)或待檢DNA樣本中外源性綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒的存在。 圖1示出了本發(fā)明實施例提供的一種斑點雜交檢測方法的實現(xiàn)流程，詳述如下:在步驟SlOl中，將含有DNA樣品的雜交膜封入雜交袋中并加入雜交溶液，封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點；在本發(fā)明的實施例中，雜交膜根據(jù)大小剪取尼龍膜，置于無酶水中漂洗，將尼龍膜完全濕潤，取出后再浸泡于檸檬酸鈉沖洗緩沖液中，并置于滅菌紙上于室溫干燥。在本發(fā)明的實施例中，檸檬酸鈉沖洗緩沖液由氯化鈉及檸檬酸鈉構(gòu)成，溶于無酶水中，用氫氧化鈉固體將PH調(diào)至7.0，于室溫保存。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，DNA樣品經(jīng)過14mins的煮沸，快速放入冰水中，驟冷IOmins后置于雜交膜的毛面上并放在120°C的烘箱中30mins。在本發(fā)明的實施例中，加入的雜交溶液至雜交膜漂起為止，除去氣泡，置于37 42°C恒溫搖床，振搖I小時。雜交溶液包括去離子甲酰胺、檸檬酸鈉沖洗緩沖液、阻斷溶液、十二烷基磺酸鈉、磷酸氫二鈉及硫酸葡聚糖。在步驟S102中，將雜交膜置于燒杯，加入沖洗溶液于搖床中洗膜，洗去未結(jié)合的探針并封閉雜交膜上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；在本發(fā)明的實施例中，洗去未結(jié)合的探針并封閉所述雜交膜上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點具體包括:1.將雜交膜放入燒杯中，加入沖洗溶液，在搖床中洗膜；2.取出雜交膜，在含有預熱沖洗緩沖液的平皿中浸泡，轉(zhuǎn)入10%馬來酸緩沖液中，室溫作用I小時。在步驟S103中，取出雜交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗體的馬來酸緩沖液中，使酶聯(lián)抗體與地高辛相結(jié)合并洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體；作為本發(fā)明的實施例，馬來酸緩沖液包括馬來酸及氯化鈉，溶于無酶水中，用氫氧化鈉固體將PH調(diào)為7.5并用無酶水定容，室溫保存。
在步驟S104中，將雜交膜置于顯色液中顯色，使用無酶水終止反應。在本發(fā)明的實施例中，探針為特異性引物，其制備方法具體包括如下步驟:1.將綿羊肺腺瘤病毒囊膜基因與長末端重復區(qū)的U3基因序列反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物純化并測定含量，于-20°C保存；2.依據(jù)地高辛標記及試劑盒檢測進行囊膜基因和U3基因序列探針的標記，并于-20°C保存；3.檢測標記特異性探針的靈敏度。在本發(fā)明的實施例中，檢測標記特異性探針的靈敏度的步驟具體包括:1.將地高辛標記的產(chǎn)物和DNA樣品進行濃度梯度稀釋；2.取不同濃度I μ L平行點至尼龍膜上，120°C烘焙30mins后顯色,根據(jù)尼龍膜上出現(xiàn)的斑點與DNA樣品出現(xiàn)的斑點對照，確定探針的靈敏度。實施例一:特異性探針的制備如下:1.env基因與LTR的U3區(qū)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的純化及含量的測定(I) env基因的產(chǎn)物用env基因巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物，長度是730bp，進行純化后，用紫外風光光度計測得含量為753ng/y L，_20°C保存；(2)U3的產(chǎn)物用U3巢式外側(cè)引物的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物，長度是354bp，進行純化后，用紫外風光光度計測得含量為324ng/y L，_20°C保存；2.按照地高辛標記及試劑盒的檢測說明書進行，具體步驟如下:(I)取env基因和U3的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物分別16 μ L放入微量離心管中作為模板。(2)將微量離心管在沸水浴中變性lOmins，然后迅速將其轉(zhuǎn)移到冰水浴中冷卻IOmins0(3)在變性的DNA中加入4 μ L的地高辛，混勻并瞬時離心。(4) 37°C孵育20h。孵育時間越長越有利于提高DIG-DNA的產(chǎn)量。(5)加入65°C的乙二胺四乙酸2μ L(0.2M，ρΗ8.0)，65°C水浴lOmins，以終止標記反應，置于-20°C保存。
權(quán)利要求
1.一種斑點雜交檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 將含有DNA樣品的雜交膜封入雜交袋中并加入雜交溶液，封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點； 將所述雜交膜置于燒杯，加入沖洗溶液于搖床中洗膜，洗去未結(jié)合的探針并封閉所述雜交膜上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點； 取出所述雜交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗體的馬來酸緩沖液中，使酶聯(lián)抗體與地高辛相結(jié)合并洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體； 將所述雜交膜置于顯色液中顯色，使用無酶水終止反應。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雜交膜根據(jù)大小剪取的尼龍膜，置于無酶水中漂洗，將尼龍膜完全濕潤，取出后再浸泡于檸檬酸鈉沖洗緩沖液中，并置于滅菌紙上于室溫干燥，所述檸檬酸鈉沖洗緩沖液由氯化鈉及檸檬酸鈉構(gòu)成，溶于無酶水中，用氫氧化鈉固體將pH調(diào)至7.0，于室溫保存。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA樣品經(jīng)過14mins的煮沸,快速放入冰水中，驟冷IOmins后置于雜交膜的毛面上并放在120°C的烘箱中30mins。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入的雜交溶液至雜交膜漂起為止，除去氣泡，置于37 42°C恒溫搖床,振搖I小時。
5.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述雜交溶液包括去離子甲酰胺、檸檬酸鈉沖洗緩沖液、阻斷溶液、十二烷基磺酸鈉、磷酸氫二鈉及硫酸葡聚糖。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗去未結(jié)合的探針并封閉所述雜交膜上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點具體包括: 將所述雜交膜放入燒杯中，加入沖洗溶液，在搖床中洗膜； 取出所述雜交膜，在含有預熱沖洗緩沖液的平皿中浸泡，轉(zhuǎn)入10%馬來酸緩沖液中，室溫作用I小時。
7.如權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述馬來酸緩沖液包括馬來酸及氯化鈉，溶于無酶水中，用氫氧化鈉固體將PH調(diào)為7.5并用無酶水定容，室溫保存。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針為特異性引物，其制備方法具體包括如下步驟: 將綿羊肺腺瘤病毒囊膜基因與長末端重復區(qū)的U3基因序列反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物純化并測定含量，于-20°C保存； 依據(jù)地高辛標記及試劑盒檢測進行 囊膜基因和U3基因序列探針的標記，并于_20°C保存； 檢測標記特異性探針的靈敏度。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述檢測所述標記特異性探針的靈敏度的步驟具體包括: 將地高辛標記的產(chǎn)物和DNA樣品進行濃度梯度稀釋； 取不同濃度I μ L平行點至尼龍膜上，120°C烘焙30mins后顯色，根據(jù)所述尼龍膜上出現(xiàn)的斑點與所述DNA樣品出現(xiàn)的斑點對照，確定探針的靈敏度。
全文摘要
本發(fā)明適用于病毒檢測領(lǐng)域，提供了一種斑點雜交檢測方法，所述方法包括將含有DNA樣品的雜交膜封入雜交袋中并加入雜交溶液，封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點；將所述雜交膜置于燒杯，加入沖洗溶液于搖床中洗膜，洗去未結(jié)合的探針并封閉所述雜交膜上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；取出所述雜交膜置于平皿中，加入含有抗地高辛抗體的馬來酸緩沖液中，使酶聯(lián)抗體與地高辛相結(jié)合并洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體；將所述雜交膜置于顯色液中顯色，使用無酶水終止反應。本發(fā)明可同時檢測多個樣品，操作方便，節(jié)省時間，無需特殊儀器設備，陽性信號清晰，試劑成本較低，可做半定量分析并可檢測出病毒載量低的病毒。
文檔編號C12R1/93GK103146843SQ20131006805
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者劉淑英, 趙澤赟, 齊景偉, 梁化春, 王宇 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學