專利名稱：白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及快速檢測白色念珠菌的試劑盒及方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白色念珠菌(Candida albicans)是念珠菌屬(假絲酵母屬)中最為常見的種。也是臨床上淺部/深部真菌病中發(fā)病率最高的念珠菌病的重要病原菌。由于該菌多侵犯已患有嚴(yán)重疾病機(jī)體免疫力低下的病人，以及接受器官移植，實施心臟、胃腸道手術(shù)需行插管、尿管、導(dǎo)管的外科病人，對生命威脅極大，為及早發(fā)現(xiàn)與診斷念珠菌感染，快速、簡便、特異及準(zhǔn)確達(dá)到臨床分離和鑒定念珠菌的方法一直受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。隨著免疫受損或低下人群的不斷擴(kuò)大，機(jī)會性念珠菌病繼續(xù)增多，迄今仍是醫(yī)學(xué)真菌領(lǐng)域研究的熱點。目前國內(nèi)外白色念珠菌主要的檢測方法有傳統(tǒng)的微生物檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法。微生物方法檢測白色念珠菌主要用到科瑪嘉顯色培養(yǎng)基進(jìn)行分離鑒別，要求檢測人員有較豐富的經(jīng)驗，進(jìn)口的培養(yǎng)基檢測成本也高。分子生物學(xué)檢測主要使用PCR及RT-PCR等方法，普通的PCR技術(shù)其擴(kuò)增產(chǎn)物大多通過凝膠電泳判斷擴(kuò)增結(jié)果，該方法中的致癌物質(zhì)不僅對環(huán)境和操作人員有很大的危害，而且要求檢測人員具備熟練的操作技巧，點樣時操作誤差會使樣品漂移造成結(jié)果不準(zhǔn)確，不適合進(jìn)行大量樣本的檢測分析工作；RT-PCR方法需要購買高端的儀器設(shè)備，并且試劑價格昂貴，這些都給檢測帶來了巨大的成本壓力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用；發(fā)明主要目的在于克服傳統(tǒng)的微生物檢測方法存在檢測時間長、步驟繁瑣等缺陷，提供一種更加快速、簡捷、安全的檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明設(shè)計試劑盒即可以保證PCR技術(shù)的靈敏度和特異性，還保留了免疫層析技術(shù)所具備的高效、便捷、低成本等特點。所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液、樣品稀釋液、陰性對照、陽性對照和試紙條，所述試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成。所述結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線；所述PCR反應(yīng)液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5 ’ TTGGTGGTGGTAGACATAGA 3’，下游引物R為5’ TCAGAACACTGAATCGAAAG 3’ ；所述上游引物F標(biāo)記生物素，下游引物R標(biāo)記地高辛。所述結(jié)合墊上包被的膠體金顆粒粒徑為25nm，ImL膠體金顆粒標(biāo)記8.4 μ g鼠抗地高辛抗體，形成的膠體金-抗體復(fù)合物在結(jié)合點墊上的包被量為2mL/30cm。所述硝酸纖維素膜上檢測線包被親和素濃度為0.5mg/mL,包被量為I μ L/cm ;控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL，包被量為I μ L/cm。
PCR反應(yīng)液組成如下:23 μ L反應(yīng)體系包括以下組分
權(quán)利要求
1.一種白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液和試紙條，所述試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成；其特征在于試劑盒還包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5 ’ TTGGTGGTGGTAGACATAGA3’，下游引物 R 為 5’ TCAGAACACTGAATCGAAAG3’ ；所述上游引物 F5 ’端標(biāo)記生物素，下游引物R5’端標(biāo)記地高辛；所述結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線。
2.如權(quán)利要求1所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)液組成如下:23 μ L反應(yīng)體系包括以下組分
3.如權(quán)利要求1或2所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，所述PCR反應(yīng)液中引物F5’端標(biāo)記的生物素與硝酸纖維素膜上親和素結(jié)合；引物R5’端標(biāo)記的地高辛與結(jié)合墊上膠體金顆粒標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體結(jié)合。
4.如權(quán)利要求1或3所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述結(jié)合墊上包被膠體金顆粒粒徑為25nm, ImL膠體金顆粒標(biāo)記8.4 μ g鼠抗地高辛抗體,形成的膠體金-抗體復(fù)合物在結(jié)合點墊上的包被量為2mL/30cm。
5.如權(quán)利要求1所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述硝酸纖維素膜上檢測線包被親和素濃度為0.5mg/mL，包被量為I μ L/cm ;控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL,包被量為I μ L/cm。
6.如權(quán)利要求1-5所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述試紙條外部設(shè)置塑料卡盒，塑料卡盒上依次設(shè)置凹孔和觀測口，所述試紙條的樣品墊放置于凹孔對應(yīng)處，硝酸纖維素膜上設(shè)置的質(zhì)控線和檢測線在觀測口對應(yīng)處。
7.如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒的檢測方法，包括如下步驟: ` 1)取出含有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管，待溶化后2000轉(zhuǎn)/分離心30秒； `2)向反應(yīng)液管中加入2μL樣品DNA,混勻； `3)將上述反應(yīng)管置于普通PCR儀中，95°C變性3min后，95°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，進(jìn)行30個循環(huán)，之后72°C延伸lOmin，完成PCR擴(kuò)增； ` 4)將上述10μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物與90 μ L的樣品稀釋液進(jìn)行混合； ` 5)取出試紙條平放于水平桌面上，將上述混合液加在試紙條樣品孔中； ` 6)反應(yīng)IOmin后，根據(jù)試紙條層析情況判斷檢測結(jié)果，完成樣本檢測； 結(jié)果判定:出現(xiàn)兩條紅線，一條檢測線，一條質(zhì)控線，表示樣品中存在白色念珠菌；僅出現(xiàn)一條紅線(在質(zhì)控線)，則樣品中不存在白色念珠菌。
8.一種白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒在檢測樣品中白色念珠菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明是將分子生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和免疫層析技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，實現(xiàn)對白色念珠菌的快速檢測。本發(fā)明試劑盒包括PCR擴(kuò)增及試紙條檢測共二部分。其中通過對引物進(jìn)行特定修飾，并在試紙條制備中選擇相應(yīng)的包被物和標(biāo)記物，反應(yīng)過程中形成一個特異的復(fù)合物，實現(xiàn)分子生物學(xué)技術(shù)和免疫層析技術(shù)的結(jié)合，達(dá)到對白色念珠菌特異擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，與傳統(tǒng)生化方法相比大大節(jié)省了檢測時間，簡化操作步驟，以達(dá)到快速、高效、準(zhǔn)確的檢測和篩選目的。在臨床檢測和篩選白色念珠菌的過程中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK103194536SQ20131006830
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者何艷玲, 王麗麗, 劉沛, 于重楠 申請人:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司