專利名稱：一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸用生物制品中綿羊肺炎支原體滅活疫苗，具體涉及綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝。
背景技術(shù)：
綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)引起綿羊及山羊非典型肺炎，臨床上以流鼻涕、咳嗽、漸進(jìn)性消瘦和增生性間質(zhì)性肺炎為主要特征。1963年Mackay等首次從患肺炎的綿羊肺中分離得到MO，此后在其它多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道MO感染引起綿羊和山羊發(fā)病。目前綿羊肺炎支原體在全球范圍內(nèi)分布，近年來該病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。此外，羊只感染綿羊肺炎支原體后，對(duì)其它病原(如多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌及流感病毒)的易感性明顯增加([l]Dassanayake RP,Shanthalingam S， Herndo n CN, Subramaniam R, Lawrence PK, Bavananthasivam J,Cassirer EF, Haldorson GJ, Foreyt WJ, Rurangirwa FR, Knowles DP, Besser TE,Srikumaran S.Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatalMannheimia haemolytica pneumonia.Vet Microbiol., 2010, 145(3-4): 354-359.),從而使其危害性更為突出。綿羊肺炎支原體在我國(guó)流行同樣十分廣泛，危害嚴(yán)重([2]郭晗，儲(chǔ)岳峰，趙萍，高鵬程，賀英，馮曉明，樊祜卿，逯忠新.青海省綿羊肺炎支原體的血清學(xué)調(diào)查.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(33): 16391-16409.[3]張萍慧，郝永清，張愛榮，范利霞，白龍.綿羊肺炎支原體的分離與鑒定.畜牧與飼料科學(xué)，2010，31(1):142-143.[4]王華，楊發(fā)龍，王永，湯承.四川省山羊支原體性肺炎流行病學(xué)調(diào)查，中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38(1): 210-213.)，對(duì)該病的綜合防治迫在眉睫。針對(duì)綿羊肺炎支原體，采用藥物治療可收到一定效果，但不易根治本病，且存在藥物殘留、對(duì)肉質(zhì)的影響及用藥后易產(chǎn)生耐藥株等一系列問題。因此，研制安全有效的疫苗，實(shí)施預(yù)防免疫是防控MO感染最為有效的方法。在疫苗研制方面，由于支原體的基因組較小，生物合成能力較弱，免疫原性較差，在實(shí)際應(yīng)用中保護(hù)率低，一直是生產(chǎn)中需要解決的問題。此外，影響疫苗免疫效果的關(guān)鍵在于疫苗的制備工藝，其中抗原內(nèi)毒素的含量和佐劑的選用對(duì)疫苗質(zhì)量的影響很大。為了提高疫苗的安全性，必須降低抗原內(nèi)毒素的含量；為了提高抗原的免疫原性，必須在抗原中添加佐劑以增強(qiáng)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力([5]CuplaR K, Relyve E H, Lindblad E B, et al.Adjuvant balance between luxieity andadjuvanlicity[J].Vaccine, 1993，11: 293-306)。佐劑的種類很多，不同的佐劑免疫增強(qiáng)效力有所不同。目前未見制備綿羊肺炎支原體滅活疫苗去除抗原內(nèi)毒素及不同佐劑免疫輔佐效力評(píng)價(jià)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是改良綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，制備一種安全有效的綿羊肺炎支原體滅活疫苗。本發(fā)明使抗原內(nèi)毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。另外，本發(fā)明還篩選到理想的綿羊肺炎支原體高效滅活疫苗佐劑。疫苗免疫羊只后，抗體產(chǎn)生早、效價(jià)高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可有效防控綿羊肺炎支原體感染。


圖1綿羊肺炎支原體滅活疫苗免疫羊血清抗體效價(jià)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，包括以下步驟:
1.抗原制備
(I)培養(yǎng)基的制備
采用改良Thiaucourt’ S培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分如下:PPLO肉湯21.0 g，新鮮酵母浸出液100 mL,滅活馬血清200 mL, 0.5g/ml的葡萄糖2ml, 0.5g/mL的丙酮酸鈉8 ml, 0.5%酹紅3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸鉈0.1 g，用去離子水補(bǔ)足到1000 mL，調(diào)節(jié)pH值7.6 7.8，經(jīng)0.22Mm細(xì)菌濾器過濾除菌后分裝，于4°C保存?zhèn)溆谩?2)綿羊肺炎支原體的增殖
取綿羊肺炎支原體凍干菌種加入I mL改良Thiaucourt’ s培養(yǎng)基溶解，將I mL菌液接入10 mL改良Thiaucourt’ s培養(yǎng)基，37 C。160 rpm搖床培養(yǎng)48 h (培養(yǎng)基顏色由紅色逐漸變成橙黃色，菌液澄清透亮、無菌膜、無混濁現(xiàn)象)時(shí)收獲；將第一代培養(yǎng)物按3%接種量接種于改良Thiaucourt’ s培養(yǎng)基，置于37 °C條件下160 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)20h,連續(xù)傳代至第4代,測(cè)定其活菌滴度即顏色變化單位(color chang unite, (XU) ([5]Loens K, Mackay W G，Scott C，et al.Amulticenter pilot external quality assessmentprogramme to assess the quality of molecular detection of Chlamydophilapneumonia and Mycoplasma pneumonia.J Microbiol Meth.2010)。

(3)綿羊肺炎支原體培養(yǎng)物的濃縮
取綿羊肺炎支原體培養(yǎng)物12000rpm離心30min，菌體用pH7.2 0.15mol/L的PBS重懸，將濃度調(diào)整至IO9 CCU/mL。(4)抗原滅活及內(nèi)毒素的去除
將濃縮后的培養(yǎng)物置60 °C水浴I h，加入0.05%甲醛(v/v)及終濃度0.02%的重鉻酸鉀溶液，置37 0C 160 r/min空氣浴搖床24h，進(jìn)行滅活和去除內(nèi)毒素。(5)滅活檢驗(yàn)
隨機(jī)抽樣滅活的綿羊肺炎支原體，分別接種改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基2支，置37 V，160 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)3日，無支原體生長(zhǎng)者為滅活完全。2.疫苗配制
采用一步乳化法，制備成油包水型乳劑疫苗
水相成分:向綿羊肺炎支原體滅活抗原中加入萬分之一的硫柳汞溶液。水相成分占疫苗總量的30% 35%。油相成分:ISA_760油佐劑，油相成分占疫苗總量的65% 70%。乳化方法:將ISA-760佐劑在高速攪拌器中緩慢攪拌乳化1_2 min，然后再取抗原緩慢加入，快速攪拌直至乳化完全，疫苗抗原終濃度為IO9 CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳劑滅活苗。3.疫苗的物理性狀檢驗(yàn)及無菌檢驗(yàn)該疫苗為油包水型，外觀呈乳白色，3000rpm離心15min不分層。用出口內(nèi)徑為1.2mm的ImL細(xì)管，吸取25°C的疫苗lmL，令其垂直自然流出0.4mL的時(shí)間為4秒。無菌檢驗(yàn)按中華人民共和國(guó)獸藥典(2005版)附錄15頁進(jìn)行，均無細(xì)菌生長(zhǎng)。4.比較試驗(yàn)證實(shí)ISA-760佐劑制備的滅活疫苗比白油佐劑、ISA-206佐劑及Buonavoglial’s佐劑制備的滅活疫苗的免疫抗體及達(dá)到高峰時(shí)間均提早一周,抗體水平高I 2個(gè)滴度，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(詳見實(shí)施例2)。因此，ISA-760是理想的綿羊肺炎支原體高效滅活疫苗佐劑。實(shí)施例1抗原內(nèi)毒素的測(cè)定、疫苗安全檢驗(yàn)及效力檢驗(yàn) (O內(nèi)毒素的測(cè)定
采用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定綿羊肺炎支原體滅活抗原內(nèi)毒素含量，結(jié)果顯示重鉻酸鉀處理后，抗原內(nèi)毒素含量大大下降。未用重鉻酸鉀處理的抗原內(nèi)毒素含量為912 EU/mL，經(jīng)重鉻酸鉀處理的抗原內(nèi)毒素含量?jī)H為38 EU/mL,也就是說,經(jīng)重絡(luò)酸鉀處理后,抗原內(nèi)毒素含量降低了 24倍，提高了疫苗的安全性。(2)安全檢驗(yàn)
5月齡左右健康成都麻羊5只(用MO間接血凝診斷試劑盒測(cè)定其無抗體，用鼻腔棉拭子提取DNA，PCR鑒定無MO)，頸部肌肉注射疫苗6ml/只。觀察30日，無食欲減退、精神沉郁、體溫反應(yīng)、注射部位炎癥等不良反應(yīng)，且全部健活。(3)效力檢驗(yàn)
12月齡健康山羊10只，分別檢測(cè)MO抗原和抗體均為陰性，隨機(jī)分為兩組，免疫組和對(duì)照組各5只。免疫組頸部肌肉注射疫苗3mL/只，對(duì)照組頸部肌肉注射生理鹽水3mL/只。免疫后30日，免疫組和對(duì) 照組山羊氣管注射MO培養(yǎng)物IOmL/只，觀察30日。對(duì)照組全部發(fā)病，免疫羊保護(hù)4只。實(shí)施例2疫苗佐劑的篩選
選取滅活疫苗常用的佐劑:白油佐劑、ISA-206佐劑、Buonavoglial’ s佐劑及ISA-760佐劑分別與滅活抗原配制成疫苗，免疫健康成年家兔，通過檢測(cè)其血清抗體水平，評(píng)價(jià)佐劑對(duì)疫苗的輔佐效力，篩選出理想的滅活疫苗佐劑。方法:
1.抗原制備:抗原的制備按照具體實(shí)施方式
所述的方法進(jìn)行。2.滅活疫苗的配制:
(I)白油佐劑滅活疫苗的制備:按抗原體積加入終濃度為3%的滅菌吐溫-80，邊加邊攪拌，至完全溶解，制成滅活疫苗水相。水相與白油佐劑的體積比為1:1。將白油佐劑在高速攪拌器中緩慢攪拌乳化I 2 min，然后再取相同體積的水相緩慢加入，直至乳化完全。(2)ISA_206佐劑滅活疫苗的制備:將抗原和佐劑在33°C孵育15 min之后，將ISA-206佐劑在磁力攪拌器中進(jìn)行攪拌，再將抗原按質(zhì)量比1:1加入佐劑中進(jìn)行乳化，加速攪拌10 min，乳化成水包油包水型雙向油乳劑滅活疫苗。(3) Buonavoglial’ s佐劑滅活疫苗的制備:按Domenico等([6])介紹的方法配制。(4) ISA-760佐劑滅活疫苗的制備:按照具體實(shí)施方式
所述的疫苗配制方法進(jìn)行。以上4種佐劑疫苗的抗原終濃度均為IO9 (XU/mL。疫苗物理性狀檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行。結(jié)果顯示，這4種佐劑制備的滅活疫苗其物理外觀、粘稠度、穩(wěn)定性、無菌檢驗(yàn)等指標(biāo)均符合要求。3.免疫接種及血清抗體檢測(cè):每種疫苗免疫家兔3只，每只家兔頸背部皮下分2點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射2mL。在免疫后1、2、3、4、5、6、7、8、9周分別經(jīng)耳緣靜脈采血，分離血清，采用MO正向間接血凝診斷試劑盒測(cè)定血清抗體水平。結(jié)果:
用MO間接血凝試劑盒測(cè)定MO滅活疫苗免疫家兔后的血清效價(jià)，抗體消長(zhǎng)規(guī)律見表I。ISA-206佐劑和白油佐劑制備滅活疫苗免疫家兔后第4周達(dá)到抗體高峰(4.33 lg2±0.57lg2, 5.00 lg2±0.00 lg2)，免疫后第 9 周下降約 I 個(gè)滴度;ISA_760 和 Buonavoglial’ s 佐劑制備的滅活疫苗免疫家兔后第3周到達(dá)抗體高峰(5.67 lg2±0.70 lg2，6.00 lg2±0.00lg2)，免疫后第9周維持抗體高峰(6.00 lg2±0.00 lg2,6.00 lg2±1.00 lg2)。利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0對(duì)4種佐劑MO滅活疫苗對(duì)MO免疫輔佐效力的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，ISA-206佐劑和白油佐劑、ISA-760佐劑、Buonavoglial’s佐劑制備的MO滅活疫苗對(duì)MO免疫輔佐效力的影響差異顯著Gd < 0.05)；ISA-206佐劑和白油佐劑制備的兩種MO滅活疫苗對(duì)MO免疫輔佐效力影響差異不顯著Gd > 0.05) ；ISA-760佐劑和Buonavoglial’ s佐劑制備的兩種MO滅活疫苗對(duì)MO免疫輔佐效力的影響差異顯著Gd < 0.05);綜上所述，ISA-760佐劑為制備MO滅活疫苗的理想佐劑。
權(quán)利要求
1.一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，其特征在于操作步驟如下: A.抗原制備 (1)培養(yǎng)基的制備 采用改良Thiaucourt’ s培養(yǎng)基；培養(yǎng)基成分如下:PPL0肉湯21.0 g，新鮮酵母浸出液100 mL,滅活馬血清200 mL, 0.5g/ml的葡萄糖2ml, 0.5g/mL的丙酮酸鈉8 ml, 0.5%酹紅3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸鉈0.1 g，用去離子水補(bǔ)足到1000 mL，調(diào)節(jié)pH值.7.6 7.8，經(jīng)0.22Mm細(xì)菌濾器過濾除菌后分裝，于4°C保存?zhèn)溆茫? (2)綿羊肺炎支原體的增殖 取綿羊肺炎支原體凍干菌種加入I mL改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基溶解，將I mL菌液接Λ 10 mL改良Thiaucourt’ s培養(yǎng)基，37°C 160 rpm搖床培養(yǎng)48 h (培養(yǎng)基顏色由紅色逐漸變成橙黃色，菌液澄清透亮、無菌膜、無混濁現(xiàn)象)時(shí)收獲；將第一代培養(yǎng)物按3%接種量接種于改良Thiaucourt’ s培養(yǎng)基，置于37 °C條件下160 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)20 h，連續(xù)傳代至第4代,測(cè)定其活菌滴度即顏色變化單位(color chang unite, (XU)； (3)綿羊肺炎支原體培養(yǎng)物的濃縮 取綿羊肺炎支原體培養(yǎng)物12000rpm離心30min，菌體用pH7.2 0.15mol/L的PBS重懸，將濃度調(diào)整至109(XU/mL ； (4)抗原滅活及內(nèi)毒素的去除 將濃縮后的培養(yǎng)物置60 °C水浴I h，加入0.05%甲醛(v/v)及終濃度0.02%的重鉻酸鉀溶液，置37 0C 160 r/min空氣浴搖床24h，進(jìn)行滅活和去除內(nèi)毒素； (5)滅活檢驗(yàn) 隨機(jī)抽樣滅活的綿羊肺炎支原體，分別接種改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基2支，置37 V,.160 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)3日，無支原體生長(zhǎng)者為滅活完全； B.疫苗配制 采用一步乳化法，制備成油包水型乳劑疫苗 水相成分:向綿羊肺炎支原體滅活抗原中加入萬分之一的硫柳汞溶液，水相成分占疫苗總量的30% 35% ； 油相成分:ISA-760油佐劑，油相成分占疫苗總量的65% 70% ； 乳化方法:將ISA-760佐劑在高速攪拌器中緩慢攪拌乳化1-2 min，然后再取抗原緩慢加入，快速攪拌直至乳化完全，疫苗抗原終濃度為IO9 CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳劑滅活苗； C.疫苗的物理性狀檢驗(yàn)及無菌檢驗(yàn) 該疫苗為油包水型，外觀呈乳白色，3000rpm離心15min不分層；用出口內(nèi)徑為1.2mm的ImL細(xì)管，吸取25°C的疫苗lmL，令其垂直自然流出0.4mL的時(shí)間為4秒； 無菌檢驗(yàn)按中華人民共和國(guó)獸藥典(2005版)附錄15頁進(jìn)行，均無細(xì)菌生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，改良了綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，提供了一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明所述的方法篩選到理想的綿羊肺炎支原體高效滅活疫苗佐劑，并使抗原內(nèi)毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。疫苗免疫羊只后，抗體產(chǎn)生早、效價(jià)高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可有效防控綿羊肺炎支原體感染。
文檔編號(hào)C12N1/36GK103110583SQ20131006838
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者湯承, 岳華, 費(fèi)磊 申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)