專利名稱：一株能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內(nèi)生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內(nèi)生菌，因此可以推測(cè)內(nèi)生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌[2]。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3_4]、具有抗病蟲害的生防菌[5_8]和具有促進(jìn)植物對(duì)不良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。在促進(jìn)光合作用方面的內(nèi)生菌報(bào)道極少，僅有在水稻上發(fā)現(xiàn)一種具有光合作用能力的內(nèi)生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個(gè)株系。木麻黃科植物是兼有Frankia菌、內(nèi)生菌根菌和外生菌根菌的共生營(yíng)養(yǎng)型植物，因此，關(guān)于木麻黃真菌學(xué)方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌、叢枝狀菌根(簡(jiǎn)稱AM菌根)、青枯菌、青枯假單胞桿菌等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內(nèi)生真菌方面的研究尚未見報(bào)道[1°-11]。前人的研究中應(yīng)用菌株，多為外生真菌，同時(shí)也沒有從提高植株葉綠素含量的因素去尋找內(nèi)生真菌，提高其科學(xué)性和可靠性[12]。證實(shí)能提高植株葉綠素的內(nèi)生菌方面尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目 的在于提供一株能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌。本發(fā)明提供的一株能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌，所述功能內(nèi)生真菌為鐮孢(Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6310。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個(gè)部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當(dāng)樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法[13_15]；
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個(gè)部分的鱗狀葉小枝，每個(gè)鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個(gè)處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個(gè)部分；
D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5— 7天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化；生長(zhǎng)緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，直到其生長(zhǎng)穩(wěn)定后純化。固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過2-3次點(diǎn)接純化、轉(zhuǎn)接后得到單一菌種的上述的Fusarium sp.功能菌株；
其在平面培養(yǎng)基上，菌落為黑色，整個(gè)菌落隆起且褶皺，外緣形狀不規(guī)則；背部為黑色。分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，分枝不規(guī)則，在孢子座上單生；分生孢子(梗孢子)無色；分生孢子單胞，長(zhǎng)圓形，單個(gè)著生；參照真菌鑒定手冊(cè)將其鑒定為鐮孢菌屬(Fusarium sp.),保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.6310。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48 72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發(fā)明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標(biāo)菌株為鐮孢(Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6310。將木麻黃根際真菌46接種于木麻黃水培苗，根據(jù)葉綠素的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)提高木麻黃葉綠素含量具有促進(jìn)作用以及實(shí)際對(duì)木麻黃的葉綠素的增效作用，尋找到提高木麻黃葉綠素含量有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。菌株46處理下，苗木葉綠素相對(duì)含量(SPAD值)為對(duì)照的1.31倍。表明其對(duì)于提高植株的葉綠素含量具有極顯著效果。
具體實(shí)施方式
`1、根際土壤澆施應(yīng)用
試驗(yàn)材料為惠安一號(hào)水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農(nóng)林大學(xué)森林生態(tài)研究所田間試驗(yàn)地。水培苗根系長(zhǎng)齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個(gè)直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質(zhì)量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準(zhǔn)確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時(shí)間為24h。待土壤內(nèi)甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發(fā)，以免影響幼苗的移植成活率。經(jīng)過一個(gè)月的恢復(fù)性生長(zhǎng)，在木麻黃根際施入菌株濃度為
9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復(fù)3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對(duì)照。2、水培繁殖中的應(yīng)用(水培接菌)
取配制好的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin，可提高植苗成活率10%以上。對(duì)照為空白處理。菌液的制備:將木麻黃根際真菌46 (菌株46)接入液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂
0.5g，其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經(jīng)過24h的培養(yǎng)，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進(jìn)行葉綠素指標(biāo)的測(cè)定，檢測(cè)方法和結(jié)果如下:
2.1菌株澆施后木麻葉綠素指標(biāo)分析
應(yīng)用便攜式葉綠素含量測(cè)定儀(SPAD-502，Minolta，Tokyo，Japan)，測(cè)定葉中部的SPAD計(jì)數(shù)值代表葉綠素的相對(duì)含量。每個(gè)處理測(cè)定10株，每株選取整個(gè)植株中間部位，同一朝向(東南方向)的枝條，采取5根枝條并排壓平的方式測(cè)量取平均值[16]。所有數(shù)據(jù)處理以及圖表制作均采用Excel和SPSS軟件處理。3測(cè)定結(jié)果:方差分析及多重比較
葉綠素相對(duì)含量的方差分析表明，S (水培浸泡)接菌方式下，菌株46處理與對(duì)照處理之間的苗木葉綠素相對(duì)含量存在顯著差異。與對(duì)照CK木麻黃苗木相比，菌株46號(hào)處理苗木的葉綠素相對(duì)含量有顯著提高，增加了 31.34%。表I水培接菌方式菌株處理下葉綠素相對(duì)含量的多重比較分析
權(quán)利要求
1.一株能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌，其特征在于:所述內(nèi)生真菌為鐮孢(.Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6310。
2.一種如權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌的應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，是將所述的鐮孢(Fusarium sp.)木麻黃根際真菌46接入液體培養(yǎng)基,搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48 72h，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值 6.4±0.2。
3.—種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于:所述應(yīng)用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期蘸 根。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株能提高木麻黃葉綠素含量的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為鐮孢(Fusariumsp.)木麻黃根際真菌46，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.6310。將木麻黃根際真菌46接種于木麻黃水培苗，根據(jù)葉綠素的各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)提高木麻黃葉綠素含量具有促進(jìn)作用以及實(shí)際對(duì)木麻黃的葉綠素的增效作用，尋找到提高木麻黃葉綠素含量有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK103173360SQ201310068759
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者吳承禎, 洪偉, 謝安強(qiáng), 林燕青, 范海蘭 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)