專利名稱：：綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒及其拯救方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組豬瘟病毒，尤其涉及綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒及其拯救方法，本發(fā)明進一步涉及該綠色熒光蛋白標記重組豬瘟病毒在診斷豬瘟或定量檢測血清豬瘟中和抗體效價中的應(yīng)用，屬于豬瘟病毒的診斷或檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬痕(classicalswinefever,CSF)是由豬痕病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)引起的豬的一種以高熱和出血為特征的高度接觸性傳染病，豬瘟的流行能夠在全世界范圍內(nèi)引起重大經(jīng)濟損失。CSFV與牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirusl,BVDV-1)、BVDV-2、邊界病病毒(borderdiseasevirus,BDV)同屬于黃病毒科痕病毒屬成員(MoserC，StettlerP,TratschinJD,etal.CytopathogenicandnoncytopathogenicRNArepliconsofclassicalswinefevervirus.J.Virol.1999,73:7787-7794.)。CSFV基因組為線狀單股正鏈RNA，長約12.3kb，含有一個大的開放閱讀框架(openreadingframe,0RF),編碼約3900個氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白在病毒和宿主細胞蛋白酶作用下加工形成4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Ems、El和E2)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(#"。、？7、吧2-3、吧4八、吧48、吧5八和吧58)(MoserC,StettlerP,TratschinJD,etal.CytopathogenicandnoncytopathogenicRNArepliconsofclassicalswinefevervirus.J.Virol.1999，73:7787-7794.)。CSFV反向遺傳學(xué)技術(shù)早在1996年得以建立，利用體外轉(zhuǎn)錄的感染性RNA轉(zhuǎn)染SK-6或PK-15細胞產(chǎn)生感染性病毒(MeyersGjThielHJjRumenapfT.Classicalswinefevervirus:recoveryofinfectiousvirusesfromcDNAconstructsandgenerationofrecombinantcytopathogenicdefectiveinterferingparticles.J.Virol.1996，70:1588-1595.)，之后將CSFV的全長感染性克隆轉(zhuǎn)染表達T7RNA聚合酶的SK-6或PK-15細胞系，利用細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方式改進了CSFV的反向遺傳技術(shù)(vanGennipHG,vanRijnPA,WidjojoatmodjoMN，etal.Recoveryofinfectiousclassicalswinefevervirus(CSFV)fromfull-lengthgenomiccDNAclonesbyaswinekidneycelllineexpressingbacteriophageT7RNApolymerase.J.Virol.Methodsl999，78:117-128.)。最近，本發(fā)明人用巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子控制下的CSFV的全長感染性克隆轉(zhuǎn)染PK-15細胞，利用細胞內(nèi)的RNA聚合酶II啟動感染性克隆的轉(zhuǎn)錄，成功拯救CSFV，使CSFV的反向遺傳技術(shù)更加有效方便(LiC，HuangJHjLiYFjetal.EfficientandstablerescueofclassicalswinefevervirusfromclonedcDNAusinganRNApolymeraseIIsystem.Arch.Virol.2012,do1:10.1007/S00705-012-1548-8)。表達細菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的標記CSFV曾被用于豬瘟病毒的定量石開究(MoserC，TratschinJDjHofmannMA.Arecombinantclassicalswinefevervirusstablyexpressesamarkergene.J.Virol.1998，72:5318-5322.)文獻報道豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)等多種綠色熒光蛋白標記的病毒得以成功構(gòu)建(FangY,RowlandRRRjRoofM，etal.Afull-lengthcDNAinfectiouscloneofNorthAmericantypelporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:expressionofgreenfluorescentproteinintheNsp2region.J.Virol.2006，80:11447-11455;FangY，Christopher-HenningsJjBrownE，etal.Developmentofgeneticmarkersinthenonstructuralprotein2regionofaUStypelporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:1mplicationsforfuturerecombinantmarkervaccinedevelopment.J.Gen.Virol.2008,89:3086-3096;KimDY,CalvertJG，ChangKOjetal.Expressionandstabilityofforeigntagsinsertedintonsp2ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).VirusRes.2007，128:106-114.)。為了控制和根除豬瘟，血清學(xué)調(diào)查是必需的手段。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、中和免疫突光試驗(neutralizationimmunofluorescencetest,NIFT)和中和過氧化物酶聯(lián)試驗(neutralizationperoxidase-linkedassay,NPLA)是常用的檢測血清中豬痕抗體的方法。多種ELISA診斷方法已經(jīng)建立而且其中幾種已經(jīng)商業(yè)化，如IDEXXCSFVAntibodyTestKit和IDEXXCSFSeroAbELISA。特別是IDEXXCSFVAntibodyTestKit作為一種可靠的血清抗體檢測方法已在疫苗評價及豬瘟的血清學(xué)調(diào)查中得到廣泛的應(yīng)用。但是由于豬瘟抗體與其它瘟病毒(BVDV和BDV)抗體的交叉反應(yīng)限制了ELISA診斷方法的特異性，ELISA檢測陽性或可疑的血清樣品常需要通過NIFT或NPLA進一步驗證。豬瘟病毒感染后不引起細胞病變，常用NIFT測定血清中和抗體，NIFT常作為血清學(xué)調(diào)查和建立新的血清學(xué)診斷方法的金標準。NPLA和NIFT是豬瘟診斷可靠敏感的工具，而且利用多個NPLA可以對豬瘟病毒抗體、BVDV和BDV抗體進行鑒別診斷。然而，在病毒培養(yǎng)72h之后，NIFT和NPLA常需要多個步驟:細胞的固定，抗體的孵育，多次洗滌，持續(xù)至少2-3h，通常費時、費力。另外，抗體昂貴、抗體標記成本較高，有待改進。如果將EGFP基因引入CSFV的基因組并實現(xiàn)穩(wěn)定表達，CSFV的檢測將有望實現(xiàn)可視化，檢測步驟也能有效簡化。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一株綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒；本發(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建所述綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒的方法;本發(fā)明的目的之三是將所述的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒應(yīng)用于制備診斷或檢測豬瘟病毒或定量檢測豬瘟中和抗體效價的試劑。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:有文獻報道，將細菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)插入豬瘟病毒Npm蛋白第4位氨基酸和第5位氨基酸之間可獲得標記病毒，且標記基因可以穩(wěn)定表達(MoserC，TratschinJDjHofmannMA.Arecombinantclassicalswinefevervirusstablyexpressesamarkergene.J.Virol.1998,72:5318-5322.)。本發(fā)明人將EGFP基因引入豬瘟病毒Np1:°蛋白基因第4位氨基酸和第5位氨基酸之間，只能獲得瞬時表達，卻未能獲得穩(wěn)定傳代的EGFP基因標記的突變豬瘟病毒。本發(fā)明人通過大量的實驗，意外地發(fā)現(xiàn)，將EGFP基因引入豬瘟病毒感染性克隆#蛋白編碼區(qū)第13位氨基酸和第14位氨基酸之間，所獲得的突變體豬瘟病毒能穩(wěn)定傳代并表達外源基因，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明首先提供了綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)，包括:豬瘟病毒和綠色熒光蛋白編碼基因；其中，綠色熒光蛋白編碼基因插入到豬瘟病毒感染性克隆Npm蛋白編碼區(qū)第13位與第14位氨基酸之間。本發(fā)明將拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)提交專利認可的機構(gòu)保藏，其微生物保藏編號為=CGMCCN0.7219;保藏時間為:2013年2月I日；該重組豬瘟病毒的分類命名為:表達綠色熒光蛋白的重組豬瘟病毒；保藏單位:中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址:中國北京朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種拯救所述綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)的方法，包括以下步驟:(I)將綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因插入到豬瘟病毒Npm蛋白編碼區(qū)的第13位與第14位氨基酸之間，獲得攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因的全長感染性克隆質(zhì)粒；(2)將攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因的全長感染性克隆質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染PK-15細胞，拯救得到綠色熒光蛋白標記的重組豬痕病毒。豬瘟病毒在易感細胞中增殖時一般不引起細胞病變。一般而言，為了拯救豬瘟病毒，轉(zhuǎn)染的細胞需要持續(xù)傳三代，稱其為“盲傳”，然后通過免疫學(xué)方法檢測病毒的存在和滴度。本發(fā)明對EGFP-CSFV病毒的拯救過程實現(xiàn)了可視化，即可通過熒光顯微鏡實時觀察病毒的產(chǎn)生和病毒量的變化。有文獻報道，將EGFP引入PRRSV的NSP2基因，產(chǎn)生的突變體病毒不穩(wěn)定(KimDY,CalvertJG,ChangK0,etal.Expressionandstabilityofforeigntagsinsertedintonsp2ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).VirusRes.2007，128:106-114.)。然而，本發(fā)明將EGFP引入CSFVNpro蛋白基因(NpiO蛋白13位氨基酸與14位氨基酸之間)中，獲得了穩(wěn)定的突變體病毒。Npro蛋白具有抑制干擾素產(chǎn)生和自我切割的功能(RiimenapfTjStarkR，HeimannMjetal.N—terminalproteaseofpestiviruses:1dentificationofputativecatalyticresiduesbysite-directedmutagenesis.J.Virol.1998，72:2544—2547;StarkRjMeyersG，RiimenapfT，etal.Processingofpestiviruspolyprotein:cleavagesitebetweenautoproteaseandnucleocapsidproteinofclassicalswinefevervirus.J.Virol.1993,67:7088-7095;WiskerchenMjBelzerSKjCollettMS.Pestivirusgeneexpression:thefirstproteinproductofthebovineviraldiarrheaviruslargeopenreadingframe,p20，possessesproteolyticactivity.J.Virol.1991,65:4508-4514.)，而本發(fā)明結(jié)果表明EGFP的插入并不影響病毒的復(fù)制。另外，Npro是非結(jié)構(gòu)蛋白，卻能指示病毒的存在或產(chǎn)生，經(jīng)分析可能是由于豬瘟病毒先產(chǎn)生一個多聚蛋白，然后在病毒或宿主蛋白酶的作用下產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。本發(fā)明中，利用熒光顯微鏡直接觀察EGFP-CSFV的EGFP熒光與IFA方法測定的病毒滴度相同；用本發(fā)明拯救的EGFP-CSFV代替豬瘟親本病毒建立的中和試驗方法(即EGFP-NT)可以直接檢測血清中豬瘟抗體，可以快速準確地測定血清中和效價。IDEXX豬瘟抗體ELISA是通過過氧化物酶標記的抗豬瘟病毒E2蛋白中和性單克隆抗體與血清中的中和抗體競爭結(jié)合包被抗原而建立的阻斷ELISA。根據(jù)已有的報道，NPLA檢測血清以中和抗體效價彡25作為判定陽性的標準。盡管EGFP-NT和NIFT與IDEXX豬瘟抗體ELISA檢測的血清都有很高的符合率，但對于IDEXX豬瘟抗體ELISA檢測可疑的樣品卻被中和試驗檢測為陽性或陰性，表明中和試驗的敏感性高于ELISA，這一結(jié)果與Blome等報道的一致(BlomeS,Meindl-RdllUierA,LoeffenW，etal.Assessmentofclassicalswinefeverdiagnosticsandvaccineperformance.Rev.Sc1.Tech.2006,25:1025-1038.)。在中和抗體效價的定量分析中，EGFP-NT和NIFT符合率可到達93.8%。所以，用本發(fā)明拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)所建立的中和試驗檢測方法(EGFP-NT)可以替代NIFT，省去病毒培養(yǎng)72h后的步驟，大大簡化了傳統(tǒng)的NIFT檢測方法?，F(xiàn)地豬群常常發(fā)生混合感染，如CSFV和PCV2、TGEV和PRV、CSFV和PrV、CSFV、PrV和豬鏈球菌的混合感染。本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，CSFV不能被其它病毒的抗體所中和，EGFP-NT對豬瘟抗體的檢測是高度特異的。NPLA方法常用來驗證ELISA檢測為陽性的血清以及鑒別診斷CSFV抗體與其它偶蹄動物瘟病毒抗體。用本發(fā)明拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)所建立的中和檢測方法(EGFP-NT)可以用熒光顯微鏡直接觀察，結(jié)果判斷方便。在病毒培養(yǎng)72h后，與NPLA和NIFT相比，EGFP-NT不需要額外實驗步驟，直接于熒光顯微鏡下檢測CSFV的存在，從而快速確定中和抗體的效價。復(fù)合物捕獲阻斷ELISA(complex-trapping-blockingELISA,CTB-ELISA)測定的血清抗體阻斷率在NPLA測定的中和抗體效價〈100時，變化較大；當中和抗體效價>100時，阻斷率穩(wěn)定在較高水平。本發(fā)明用豬瘟免疫和攻毒的血清144份對血清阻斷率與中和抗體效價的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果表明，待檢豬血清的豬瘟抗體阻斷率與其中和抗體效價的對數(shù)呈正相關(guān)性。實驗結(jié)果表明，用本發(fā)明拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)建立的中和試驗檢測方法(EGFP-NT)是檢測血清中和抗體的可靠方法，而且省時省力。總之，本發(fā)明將綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因引入豬瘟病毒蛋白編碼區(qū)的第13位與第14位氨基酸之間，通過轉(zhuǎn)染、傳代，拯救得到綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒，通過直接觀察EGFP突光、間接免疫突光試驗(indirectimmunofluorescenceassay,IFA)和IDEXX豬瘟抗原ELISA檢測證實可視化的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒EGFP-CSFV構(gòu)建成功。該重組病毒感染細胞后通過熒光顯微鏡直接可視，而且其生長特性與親本病毒一致。用本發(fā)明綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒建立的中和試驗檢測方法(EGFP-NT)可以直接用熒光顯微鏡觀察確定豬瘟病毒的存在以及確定血清中和抗體效價，不需要免疫熒光的操作步驟，比NIFT至少減少2h，檢測更加便捷，且可獲得與NIFT—致的結(jié)果，并能保持傳統(tǒng)NT高特異性和高敏感性的優(yōu)勢，因此可替代傳統(tǒng)NIFT成為用于豬瘟血清學(xué)調(diào)查和流行病學(xué)調(diào)查的更為方便的檢測方法。圖1綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒EGFP-CSFV的可視化觀察；A:熒光顯微鏡觀察:透射顯微鏡明場觀察。圖2綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒EGFP-CSFV的熒光顯微鏡直接觀察和免疫熒光試驗檢測結(jié)果。圖3EGFP基因在綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒EGFP-CSFV基因組中的穩(wěn)定性分析。圖4綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒EGFP-CSFV的一步生長曲線分析。圖5EGFP-NT檢測中和抗體效價與IDEXX豬瘟抗體ELISA檢測血清阻斷率的關(guān)系O具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。I實驗材料1.1細胞和病毒PK-15細胞和豬瘟病毒強毒石門株(Shimen，以下稱為wt-CSFV)均由本發(fā)明人實驗室保存，分別用含8%胎牛血清和2%胎牛血清(無BVDV和支原體)的Dulbecco’sModifiedEaglesMedium(DMEM)培養(yǎng)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱。1.2血清血清樣品來自本實驗室經(jīng)腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗或豬瘟兔化弱毒株免疫隨后用豬瘟強毒石門株攻毒的實驗豬(SunY,TianDY，LiS，etal.Comprehensiveevaluationoftheadenovirus/alphavirus-repIiconchimericvector-basedvaccinerAdV-SFV_E2againstclassicalswinefever.Vaccine2013,31:538-544；SunY,LiuDF,WangYF,etal.GenerationandefficacyevaluationofarecombinantadenovirusexpressingtheE2proteinofclassicalswinefevervirus.Res.Vet.Sc1.2010,88:77-82.);現(xiàn)地待檢豬血清，包括豬偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PrV)陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清、PrV和CSFV雙陽性血清、PRRSV和CSFV雙陽性血清，均由本發(fā)明人實驗室保存，豬傳染性胃腸炎病毒(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)陽性血清由馮力研究員饋贈。實施例1綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)的構(gòu)建1.1全長感染性克隆質(zhì)粒pEGFP-CSFV的構(gòu)建以CSFV石門株全長感染性克隆pBRCISM(LiC，HuangJH,LiYF,etal.EfficientandstablerescueofclassicalswinefevervirusfromclonedcDNAusinganRNApolymeraseIIsystem.Arch.Virol.2012,do1:10.1007/s00705-012-1548_548)為基礎(chǔ)構(gòu)建全長感染性克隆質(zhì)粒pEGFP-CSFV。將EGFP基因通過融合PCR技術(shù)插入到豬瘟病毒『°的第13位與第14位氨基酸之間，所用引物如下:Npro-412eGFP-lS:CACCTCGAGATGCTATGTGG(SEQIDN0.1)；Npro-412eGFP-lR:CTCGCCCTTGCTCACCATGTTTGTTTTGTATAAAAGTTC(SEQIDN0.2)；Npro-412eGFP-2S:AACTTTTATACAAAACAAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(SEQIDN0.3)；Npro-412eGFP-2R:CCCATTGGTTTTTGTTTCTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQIDN0.4)；Npro-412eGFP-3S:GACGAGCTGTACAAGAAACAAAAACCAATGGGAGTG(SEQIDN0.5)；Npro-412eGFP-3R:AACTCTAGAGGGGCCCTATGG(SEQIDN0.6)。PCR產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI克隆至pBRCISM-5,(LiC,HuangJH,LiYF,etal.EfficientandstablerescueofclassicalswinefevervirusfromclonedcDNAusinganRNApolymeraseIIsystem.Arch.Virol.2012),形成pBRCISM-5'EGFP0將pBRCISM-5'EGFP的Sail和BamHI片段插入pBRCISM_3'中，獲得全長感染性克隆質(zhì)粒pEGFP-CSFV。1.2綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)的拯救及鑒定將純化的質(zhì)粒pEGFP-CSFV2μg轉(zhuǎn)染長滿單層的PK-15細胞之后進行三次細胞傳代(每2天進行一次傳代)至第四代(F4)(細胞培養(yǎng)過程中可隨時用熒光顯微鏡直接進行病毒產(chǎn)生的實時觀察)，凍融一次收獲病毒。按照RNeasyMiniKit說明書提取病毒RNA，用DNaseI處理后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板PCR擴增EGFP及NS5B基因，用熒光定量PCR檢測病毒基因拷貝數(shù)。通過測序驗證PCR產(chǎn)物是否存在突變。用E2特異性單克隆抗體6E10(PengWP,HouQ,XiaZH,etal.1dentificationofaconservedlinearB-cellepitopeattheN-terminusoftheE2glycoproteinofClassicalswinefevervirusbyphage-displayedrandompeptidelibrary.VirusRes.2008，135:267-272.)進行IFA檢測，證實EGFP-CSFVE2蛋白的表達，同時用IDEXX豬瘟抗原檢測試劑盒檢測EGFP-CSFVEms蛋白的表達。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Fl和F2代只見少數(shù)幾個發(fā)熒光的細胞，F(xiàn)3代可見幾個發(fā)熒光的細胞團，到F4代整瓶細胞布滿熒光團(圖1)，表明已獲得綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)。用IDEXX豬瘟抗原檢測試劑盒檢測EGFP-CSFVF4代病毒的OD45tl值為1.168，陽性對照0.703，陰性對照0.085，樣品>0.385判為陽性，因此IDEXX豬瘟抗原檢測結(jié)果判為陽性。IFA檢測EGFP-CSFV抗原與豬瘟抗體6E10特異性反應(yīng)，與親本病毒結(jié)果一致。直接觀察EGFP-CSFV感染的細胞，其熒光更特異，相比IFA的熒光無任何背景(圖2)。用熒光定量PCR檢測EGFP-CSFV的RNA可以達到每微升6.82XIO6拷貝數(shù)，通過RT-PCR可以成功擴增到豬瘟病毒NS5B基因和EGFP基因。實驗例2EGFP基因在綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)基因組中的穩(wěn)定性分析實驗將實施例1所拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)F4代繼續(xù)細胞傳代至F8代，每代病毒傳至下一代之前觀察EGFP熒光。收獲F4、F5、F6、F7、F8代病毒液，用IDEXX豬瘟抗原試劑盒檢測病毒抗原，同時提取病毒RNA，用RT-PCR檢測EGFP基因是否穩(wěn)定存在。將各代次的病毒液接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的PK-15細胞，48h后先觀察EGFP特異熒光，之后用冷無水乙醇固定細胞，用豬瘟單克隆抗體和TRITC或FITC標記的抗鼠二抗進行IFA檢測。EGFP-CSFV感染的細胞從F4傳代到F8，每代均可觀察到熒光。用IDEXX豬瘟抗原檢測試劑盒檢測F4-F8病毒，每代病毒均呈陽性；IFA檢測F4-F8病毒可見特異性熒光團；通過RT-PCR可以從EGFP-CSFV病毒RNA中特異性地擴增出EGFP基因，但未從親本病毒基因中擴增到EGFP基因(圖3)。這些結(jié)果表明:EGFP-CSFV可以持續(xù)傳代，EGFP基因也可以穩(wěn)定存在于豬瘟病毒的基因組且能正確表達。實驗例3綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)的一步生長曲線測定將實施例1所拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒EGFP-CSFV和親本病毒wt-CSFV以感染復(fù)數(shù)(MOI)為I的劑量接種長至單層的PK-15細胞，感作2h，用PBS洗滌后加入維持液，37°C培養(yǎng)。分別在感染后24、36、48、60和72h收獲病毒，將病毒液作連續(xù)10倍稀釋，分別接種于長至單層的PK-15細胞，感染2h后換2%維持液，48h后直接觀察EGFP熒光，之后用IFA檢測，應(yīng)用Reed-Muench方法計算其TCID5tl，繪制病毒生長曲線。測定結(jié)果表明，實施例1所拯救的EGFP-CSFV與親本病毒具有相似的生長特性，在感染后72h，病毒滴度均可達到106_5TCID5tlAiL(圖4)，這說明EGFP插入豬瘟病毒Npm的第13位與第14位氨基酸之間不影響豬瘟病毒的生長。另外，直接觀測EGFP與IFA測定的EGFP-CSFV的滴度是一致的，表明可視化豬瘟病毒EGFP-CSFV可以替代親本病毒直接確定其病毒滴度。實驗例4基于EGFP-CSFV的中和試驗(EGFP-NT)與傳統(tǒng)中和試驗(NIFT)的對比實驗將實驗免疫或攻毒的豬瘟抗體陰性血清88份和現(xiàn)地陰性血清30份(共118份)(IDEXX豬瘟抗體檢測試劑盒確定抗體阻斷率<30%)，實驗免疫或攻毒的豬瘟抗體陽性血清74份和22份現(xiàn)地陽性血清(共96份)(IDEXX豬瘟抗體檢測試劑盒確定抗體阻斷率彡40%),同時分別進行EGFP-NT和NIFT。檢測前將待檢血清樣品56°C滅活30min。中和試驗在96孔板上進行。血清樣品按1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512稀釋，與100TCID50(EGFP-CSFV或wt-CSFV)混合，然后37°C孵育lh。將血清-病毒混合物加入單層的96孔板細胞中，培養(yǎng)lh，然后再培養(yǎng)72h。對于EGFP-CSFV，病毒直接在熒光顯微鏡下(NikonTE200,Japan)觀察，然后確定血清中和效價。對于wt-CSFV，細胞洗滌3遍，然后用冷無水乙醇固定20min，固定的細胞風干后，與E2單克隆抗體HQ0637°C孵育lh，洗滌3遍，然后用FITC熒光標記的羊抗鼠IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)37°C孵育45min,用PBS洗3遍后，用90%丙三醇覆蓋細胞，于熒光顯微鏡下觀察。血清中和效價以中和50%病毒生長的最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。每次中和試驗都設(shè)陰、陽性血清對照，中和試驗結(jié)束后對病毒滴度進行復(fù)測。定性分析結(jié)果:用本發(fā)明拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)所建立的中和試驗檢測方法EGFP-NT和傳統(tǒng)的NIFT檢測118份陰性血清中全為陰性，中和抗體效價〈25；96份陽性血清檢測89份為陽性，其中71份血清中和抗體效價介于40-512之間，18份中和抗體效價>512，7份IDEXX豬瘟抗體試劑盒檢測陽性的血清被中和試驗檢測為陰性，EGFP-NT和NIFT符合率為100%(214/214)，與IDEXX豬瘟抗體檢測試劑盒符合率為96.7%(207/214)(表I)。定量分析結(jié)果=EGFP-NT和NIFT檢測88份陰性血清其中具有相同中和抗體效價的87份，檢測的74份陽性血清中65份具有相同的中和抗體效價，符合率為93.8%(152/162)。EGFP-NT和NIFT檢測現(xiàn)地血清的中和抗體效價符合率為96.2%(50/52)(表2)。本實驗對11份抗體阻斷率30%-40%的可疑樣品進行單獨分析，其中9份為陽性，2份為陰性。以上結(jié)果表明:用本發(fā)明拯救的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒(EGFP-CSFV)所建立的中和試驗檢測方法EGFP-NT與傳統(tǒng)的NIFT結(jié)果基本一致，且二者都比ELISA更敏感。表I多種血清診斷方法檢測豬瘟特異性抗體的符合率分析權(quán)利要求1.一種綠色熒光蛋白標記的重組豬痕病毒，其特征在于包括豬痕病毒和綠色熒光蛋白編碼基因。2.按照權(quán)利要求I所述的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒，其特征在于將綠色熒光蛋白編碼基因插入到豬瘟病毒感染性克隆#蛋白編碼區(qū)第13位與第14位氨基酸之間。3.按照權(quán)利要求I或2所述的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒，其特征在于其微生物保藏編號為CGMCCNO.7219。4.一種拯救權(quán)利要求1-3任何一項所述綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒的方法，包括以下步驟(1)將綠色熒光蛋白編碼基因插入到豬瘟病毒Npm蛋白編碼區(qū)的第13位與第14位氨基酸之間，獲得攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因的全長感染性克隆質(zhì)粒；(2)將攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因的全長感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細胞，拯救出綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒。5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將攜帶有綠色熒光蛋白編碼基因的全長感染性克隆質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染PK-15細胞。6.權(quán)利要求1-3所述綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒在制備診斷豬瘟的試劑中的用途。7.權(quán)利要求1-3所述綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒在制備定量檢測豬瘟中和抗體效價的試劑中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒及其拯救方法和應(yīng)用。本發(fā)明將綠色熒光蛋白編碼基因插入到豬瘟病毒感染性克隆Npro蛋白編碼區(qū)的第13位與第14位氨基酸之間，通過轉(zhuǎn)染PK-15細胞、傳代，拯救出可視化的綠色熒光蛋白標記的重組豬瘟病毒。所述重組豬瘟病毒的生長特性與其親本病毒一致，感染PK-15細胞后通過熒光顯微鏡直接可視，用其建立的改進中和試驗方法(EGFP-NT)能夠借助熒光顯微鏡直接觀察豬瘟病毒的存在與否并確定待檢血清中的中和抗體效價，無需額外的免疫熒光試驗步驟，其特異性和敏感性與傳統(tǒng)的中和免疫熒光試驗一致，卻更加方便快捷，可替代中和免疫熒光試驗方法用于豬瘟血清學(xué)檢測和流行病學(xué)調(diào)查。文檔編號C12R1/93GK103255111SQ20131006948公開日2013年8月21日申請日期2013年3月5日優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日發(fā)明者仇華吉,李永鋒,孫元,李素,羅玉子申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所