專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒別歐洲牛肝菌近緣種的分子特異性標(biāo)記引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，以及ー種利用該引物對(duì)歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 進(jìn)行快速辨別的方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
隸屬牛肝菌目Boletales 下 Boletus 屬的 Appendiculati Konrad&Maubl.exLannoy&Estades 群包括 Jf B.appendiculatus Schaeff.:Fr.、B.subappendiculatus
Dermek,Lazebn.&J.Vcsclskv, B.fechtneri Velen.、B.pseudoregius(Huber)Estades 和
B.regius Krombh.五個(gè)Boletus種。這五個(gè)近緣種均起源于歐洲,其共同特征為子實(shí)體的菌柄上或多或少有網(wǎng)紋，全菌柄呈一致黃色，菌管和菌孔經(jīng)常變藍(lán)；菌肉變藍(lán)或不變藍(lán)，但ロ嘗總具溫和口感；許多種在菌柄基部呈現(xiàn)些許粉紅色。對(duì)近緣種B.appendiculatus 與 B.subappendiculatus 標(biāo)本辨別的典型特征是B.subappendiculatus不同于B.appendiculatus,其菌肉暴露在空氣中不變藍(lán)，或微弱變藍(lán)，或有時(shí)部分變藍(lán)；菌孔受傷不變藍(lán)，反而變暗；菌蓋米色、赭(黃)色；B.subappendiculatus的擔(dān)孢子的平均長(zhǎng)寬比大于3。此外，在生境上不同，B.subappendiculatus生長(zhǎng)在針葉林下。宏觀上的顏色差異和變色反應(yīng)是辨別這ニ個(gè)近緣種的主要特征， 微觀上的擔(dān)孢子大小僅作為次級(jí)辨別特征。盡管顏色差異和變色反應(yīng)是辨別這ニ個(gè)近緣種的主要手段，但由于易受生境、氣候、土壌、子實(shí)體生長(zhǎng)期、生理狀況等的影響而常常導(dǎo)致主觀判別上的偏差，而對(duì)于長(zhǎng)期保藏的干標(biāo)本，特別是古老標(biāo)本、模式標(biāo)本的重新鑒別研究，僅憑顏色、宏觀形態(tài)特征更是難以準(zhǔn)確鑒定。因此，在大型真菌分類(lèi)研究上，分子技術(shù)已成為了對(duì)標(biāo)本輔助鑒定的重要手段。真菌的核糖體基因rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)區(qū)段的保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯，這ー特點(diǎn)使得ITS區(qū)段不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定。對(duì)B.appendiculatus和B.subappendiculatus的ニ種的ITS測(cè)序數(shù)據(jù)顯不，B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 的 ITS1-5.8S-1TS2 序列長(zhǎng)度均為 600 700bp，很難利用通用引物對(duì)(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR擴(kuò)增、普通電泳來(lái)進(jìn)行準(zhǔn)確辨別。對(duì)ニ個(gè)種的ITS序列比對(duì)顯示二者的局部序列存在較大差異，這為設(shè)計(jì)ITS特異引物，針對(duì)性地?cái)U(kuò)增ITS特異片段，以方便用于這ニ個(gè)近緣種的分子輔助鑒定提供了可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供ー種可鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，以及ー種利用該引物對(duì)歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 進(jìn)行快速辨別的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，其核苷酸序列如下:上游引物:5'-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3'下游引物:5'-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。該引物對(duì)是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)對(duì)歐洲牛肝菌標(biāo)本B.appendiculatus和B.subappendiculatus的核糖體基因rRNA的ITS區(qū)序列的克隆測(cè)序，以得到的ITS序列進(jìn)行堿基差異比對(duì)，并以此設(shè)計(jì)ITS特異性引物對(duì)。以該引物對(duì)對(duì)B.appendiculatus和B.subappendiculatus 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，可從 B.subappendiculatus 中獲得 630bp 大小的特異性片段，而B(niǎo).appendiculatus則無(wú)法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及所述的分子特異性標(biāo)記引物在鑒別歐洲牛肝菌B.appendiculatus和 B.subappendiculatus 中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及ー種利用所述分子特異性標(biāo)記引物鑒別歐洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的方法，所述方法包括:提取待測(cè)牛肝菌標(biāo)本基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn)630bp的DNA條帶，則待測(cè)牛肝菌為B.subappendiculatus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)630bp的DNA條帶，則待測(cè)牛肝菌為B.appendiculatus ；所述分子特異性標(biāo)記引物序列為:上游引物:5'-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3'下游引物:5'-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。所述方法關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的選擇、DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定，以及電泳檢測(cè)，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物和檢測(cè)方法僅適用于歐洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的鑒別，即待測(cè)標(biāo)本是限定為歐洲牛肝菌標(biāo)本B.appendiculatus和B.subappendiculatus的范圍內(nèi)的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)子實(shí)體形態(tài)和顏色先進(jìn)行初步的判斷，再將判斷可能為B.appendiculatus或B.subappendiculatus的牛肝菌標(biāo)本采用本發(fā)明方法進(jìn)行鑒別。B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 是同屬于 Boletus 屬內(nèi)Appendiculati類(lèi)群的ニ個(gè)近緣種，同起源于歐洲，有著該類(lèi)群內(nèi)ー些共同的形態(tài)特征。對(duì)B.appendiculatus與B.subappendiculatus的辨別主要通過(guò)二者的菌肉和菌孔在變藍(lán)反應(yīng)上的差異和菌蓋顏色上的差異，但對(duì)變色反應(yīng)程度和顔色差異的判別具有很強(qiáng)的主觀性，而且對(duì)于干標(biāo)本，特別是古老標(biāo)本已很難通過(guò)變藍(lán)反應(yīng)來(lái)準(zhǔn)確鑒定，有文獻(xiàn)記載了這ニ個(gè)近緣種被混淆鑒定的情況。采用本發(fā)明方法，可對(duì)B.appendiculatus和B.subappendiculatus進(jìn)行快速的分子鑒定，方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，是形態(tài)特征辨別的有效輔助。所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成如下(總體積25 ii L):
PCR Buffer終濃度為I x
dNTPs0.8 mM
MgCI:2.0 mM
Taq DNA 酶I 2 U
上、下游引物各0.4 p M
模板 DNA5CM Wng
余量為ddH20;PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性 6min 后；94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。具體的，所述方法如下:(I)取待測(cè)牛肝菌標(biāo)本子實(shí)體0.2 g，加液氮徹底磨碎，以SDS-CTAB法提取待測(cè)牛肝菌的基因組DNA ；(2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系每25 ii L組成如下:
10 PCR Buffer2.5 m L
IOmM dNTPs2pL
25 mM MgCl22pL
5U/pLTaq DNA H 0.3 p L IOpM上、下游引物各丨JliL 17ng/pL 模板 DNA3pL
(WH2O 補(bǔ)足至 25 p L;PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性 6min 后；94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ；(3)取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5 ii L，與I ii L 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)630 bp的DNA條帶，則待測(cè)牛肝菌為B.subappendiculatus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)630 bp的DNA條帶，則待測(cè)牛肝菌為B.appendiculatus。PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應(yīng)體系中的濃度與IXPCR Buffer相同，通常選用體積為反應(yīng)體系體積1/10的10XPCR Buffer。10XPCRBuffer成分為:100mM Tris-HCl (pH8.5)、500mMKCl、25mM MgCl2和 1.0%Triton-X_100，溶劑為 ddH20。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對(duì)近緣種
B.appendiculatus和B.subappendiculatus進(jìn)行快速的分子鑒定，方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，是形態(tài)特征辨別牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的有效輔助。


圖1 為對(duì) B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的結(jié)果；M:Marker,即 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；C:陰性對(duì)照；Ba:B.appendiculatus ；Bsu:B.subappendiculatus ;圖1所指為編號(hào)為Ba的B.appendiculatus標(biāo)本未擴(kuò)增出分子量為630bp的特殊DNA條帶,而編號(hào)為Bsu的B.subappendiculatus標(biāo)本擴(kuò)增出了該條帶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:(I)牛肝菌標(biāo)本基因組DNA的提取:取待測(cè)牛肝菌標(biāo)本子實(shí)體0.2g，加液氮徹底磨碎，基因組DNA的提取采用SDS-CTAB法，經(jīng)多次抽提，來(lái)提取獲得標(biāo)本的基因組DNA粗提物。DNA粗提物再經(jīng)Magabio核酸純化試劑盒進(jìn)行純化(博日Bioer,杭州，中國(guó))后,通過(guò)
1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光光度計(jì)(GeneQuant Pro,GEHealthcare)來(lái)檢測(cè)完整性、純度及濃度。0D26(i/0D28(i>1.8的DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。DNA提取物干-20°C冰箱貯藏備用。(2)設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對(duì)的序列為上游引物5 ' -AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3 '和下游引物 5 ' -ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3 '，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。(3) ITS特異引物的PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系:10XPCR Buffer2.5 U L, 10mmol /T, dNTPs2 U L, 25mmol/L MgCl2 2 U L, 5U/ U L TaqDNA g|0.3uL, IOu mol/L 上下游特異引物各 I U L, 17ng/ u L 模板 DNA3 u L, ddH2014.2 u L,反應(yīng)總體積為25 u L0擴(kuò)增反應(yīng)在杭州博日公司的TC-XP型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性6min后；94°C變性40s，退火40s，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為 4 0C o
(4)電泳檢測(cè):取步驟(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，與Iul0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，在含
0.5 u g/mlEB的水溶液中染色30分鐘，然后在上海培清JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相。按照上述方法，分別對(duì) B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 標(biāo)本(B.appendiculatus 標(biāo)本來(lái)自于比利時(shí)國(guó)家植物園 National Botanical Garden ofBelgium, B.subappendiculatus標(biāo)本來(lái)自于維也納大學(xué)植物研究所Institute ofBotany, University of Vienna)進(jìn)行檢測(cè)，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。其中編號(hào)為1、2、3、4、5、 6、7的B.appendiculatus標(biāo)本未擴(kuò)增出分子量為630bp的特殊DNA條帶，而編號(hào)為8、9、10的B.subappendiculatus標(biāo)本擴(kuò)增出了該條帶。
權(quán)利要求
1.一種鑒別歐洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，其核苷酸序列如下: 上游引物:5' -AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3' 下游引物:5' -ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。
2.如權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物在鑒別歐洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus 中的應(yīng)用。
3.ー種利用權(quán)利要求1所述分子特異性標(biāo)記引物鑒別歐洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的方法,所述方法包括:提取待測(cè)牛肝菌標(biāo)本基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn)630bp的DNA條帶,則待測(cè)牛肝菌為B.subappendiculatus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)630bp的DNA條帶,則待測(cè)牛肝菌為B.appendiculatus ;所述分子特異性標(biāo)記引物序列為: 上游引物:5' -AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3' 下游引物:5' -ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性6min后；94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于方法如下: (1)取待測(cè)牛肝菌標(biāo)本子實(shí)體，加液氮徹底磨碎，以SDS-CTAB法提取待測(cè)牛肝菌的基因組DNA ； (2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記 引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增: PCR反應(yīng)體系每25 ii L組成如下: 10X PCR Buffer2.5 m L IOmMdNTPs 2pL 25 mM MgCl2 2pL 5 U/p LTaq DNAiH OJpL IOpM上、下游引物各〗pL 11Hg/ p L 模板 DNA3 M L ddH20 補(bǔ)足至 25 p L; PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性6min后；94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ； (3)取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5ii L，與I ii L 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于I XTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)630bp的DNA條帶,則待測(cè)牛肝菌為B.subappendiculatus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)630 bp的DNA條帶,則待測(cè)牛肝菌為B.appendiculatus。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可鑒別歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該引物對(duì)歐洲牛肝菌近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus進(jìn)行快速辨別的方法。所述分子特異性標(biāo)記引物核苷酸序列如下上游引物5′-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3′下游引物5′-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3′。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對(duì)近緣種B.appendiculatus和B.subappendiculatus進(jìn)行快速的分子鑒定，方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，是形態(tài)特征辨別牛肝菌二種的有效輔助。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103114149SQ201310070420
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者魏海龍, 李海波, 胡傳久, 王麗玲, 付立忠 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院