專利名稱：鼠肝炎冠狀病毒的活體成像示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鼠肝炎冠狀病毒的活體成像示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用，特別涉及一種在野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株基因組中插入Gaussia熒光素酶基因后得到的重組鼠肝炎冠狀病毒。
背景技術(shù)：
冠狀病毒是目前已知的基因組最大的單股正鏈RNA病毒，主要引起呼吸道和消化道的疾病，是多種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物傳染性疾病的病原體，常常導(dǎo)致巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失。自2003年一種新的SARS-CoV被確定為烈性傳染病SARS的病原體以來，冠狀病毒(Coronavirus)便成為全球生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。生物熒光示蹤技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)嶄新的分子、基因表達(dá)的分析檢測技術(shù)。在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，結(jié)合熒光示蹤的技術(shù)手段，可分別在細(xì)胞和動(dòng)物水平，對標(biāo)記分子進(jìn)行熒光示蹤監(jiān)測和檢測。Gaussia熒光素酶是分離于夏威夷水域的一種大型海洋橈腳類動(dòng)物的新型熒光素酶。通過報(bào)告基因載體，Gaussia突光素酶可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)后的Gaussia熒光素酶為單條肽鏈的單體酶，其分子較小(187aa)，且具有分泌性信號肽，因此可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細(xì)胞外。該熒光素酶催化底物腔腸素的氧化反應(yīng)并且發(fā)光(480nm)，該反應(yīng)無需ATP參與。與其他熒光素酶相比，使用Gaussia熒光素酶作為報(bào)告基因有更多的優(yōu)勢:1.分泌型熒光素酶，可直接取上清檢測，無須裂解細(xì)胞；2.發(fā)光強(qiáng)度高，是其它熒光素酶的I千倍；3.反應(yīng)無須ATP，不受ATP影響；4.穩(wěn)定性高，對溫度、pH值等耐受性強(qiáng)。目前尚未有對鼠肝炎冠狀病毒進(jìn)行Gaussia熒光素酶示蹤的相關(guān)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鼠肝炎冠狀病毒的Gaussia熒光素酶示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述鼠肝炎冠狀病毒的Gaussia熒光素酶示蹤系統(tǒng)即為一種表達(dá)Gaussia熒光素酶的重組鼠肝炎冠狀病毒。本發(fā)明所提供的重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進(jìn)行替換或插入得到的重組病毒；所述替換為:將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段(可由I個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)核糖核苷酸組成)換為片段b ；所述插入為:在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點(diǎn)處插入所述片段b;所述片段a為序列表中序列I編碼的RNA ;所述片段b為含有Gaussia熒光素酶編碼基因的DNA片段編碼的RNA。所述Gaussia熒光素酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。在本發(fā)明中，所述Gaussia熒光素酶的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?的第15-575位。進(jìn)一步，所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段的序列為序列表中序列3。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述野生型鼠肝炎冠狀病毒具體為鼠肝炎冠狀病毒A59 株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組鼠肝炎冠狀病毒是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進(jìn)行替換得到的重組病毒；具體的，所述替換中，所述“片段a中的任一片段”為所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸對應(yīng)的RNA片段。由于所述野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列(Up date:2012_8_23)，相應(yīng)的，所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列(Update:2012-8-23)的第27967-28264位(對應(yīng)序列I的第468-765位)替換為序列表中序列3，得到的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法。本發(fā)明所提供的制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法具體可包括如下步驟:(a)將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列分別克隆至質(zhì)粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質(zhì)粒甲；所述待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)位于序列I中；(b)用含所述野生型 鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細(xì)胞后，用步驟(a)獲得的重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)染所述CV-1細(xì)胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質(zhì)粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列發(fā)生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點(diǎn)處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙；(c)將步驟(b)中的所述重組痘苗病毒載體乙中的所述gpt基因替換為所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段，得到重組質(zhì)粒乙；(d)用步驟(b)得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細(xì)胞后，用步驟(C)獲得的重組質(zhì)粒乙轉(zhuǎn)染所述新的CV-1細(xì)胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質(zhì)粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列發(fā)生同源重組，獲得以所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組痘苗病毒載體丙；(e)提取步驟(d)得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉(zhuǎn)錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA ;將所述全長RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒。在上述方法中，步驟(a)中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列分別為 GenBank 號為 NC_001846.1 的序列(Up date:2012-8-23)的第 27500-27966位(對應(yīng)序列I的第1-467位)和第28265-28700位(對應(yīng)序列I的第766-1201位)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，制備所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法具體包括如下步驟:(a)將GenBank號為NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(對應(yīng)序列I的第1-467位，命名為上游同源臂)和第28265-28700位(對應(yīng)序列I的第766-1201位，命名為下游同源臂)分別克隆至質(zhì)粒pSV2-gpt的gpt基因的上游(如酶切位點(diǎn)Not I和Sal I之間)和下游(如酶切位點(diǎn)Pst I和BamH I之間)，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pGPT-1N_0RF4 ；(b)用含鼠肝炎冠狀病毒(MHV)A59株基因組cDNA的痘苗病毒載體vacciniavirus inf-1 (v.v.-1nf-1)感染CV-1細(xì)胞后,用步驟(a)獲得的重組質(zhì)粒pGPT_IN_0RF4轉(zhuǎn)染所述CV-1細(xì)胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質(zhì)粒PGPT-1N-0RF4通過所述上游同源臂和所述下游同源臂發(fā)生同源重組，以所述gpt基因作為陽性篩選標(biāo)記，獲得以所述gpt基因替代所述V.V.-1nf-Ι中的位于GenBank號為NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(Up date:2012_8_23)的第27967-28264位核苷酸序列的重組痘苗病毒載體，將其命名為V.V-1nf-gpt-1n ；(c)將步驟(a)中的所述重組質(zhì)粒pGPT-1N_0RF4中的所述gpt基因替換為所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段(序列3)，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pGPT-OUT-LUC ；(d)用步驟(b)得到的重組痘苗病毒載體乙V.V-1nf-gpt-1n感染新的CV-1細(xì)胞后，用步驟(c)獲得的重組質(zhì)粒pGPT-OUT-LUC轉(zhuǎn)染所述新的CV-1細(xì)胞，所述重組痘苗病毒載體V.V-1nf-gpt-1n與所述重組質(zhì)粒pGPT-OUT-LUC通過所述上游同源臂和所述下游同源臂發(fā)生同源重組，以所述gpt基因作為陰性篩選標(biāo)記，獲得以所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段(序列3)替代所述重組痘苗病毒載體V.V-1nf-gpt-1n中所述gpt基因的重組豆苗病毒載體，將其命名為V.V.-1nf-LUC-GPT-OUT ； (e )提取步驟(d)得到的重組痘苗病毒載體V.V.-1nf-LUC-GPT-OUT的基因組DNA,通過體外轉(zhuǎn)錄，獲得所述重組痘苗病毒載體V.V.-1nf-LUC-GPT-OUT的基因組的全長RNA ;將所述全長RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒(MHV-LUC)。在上述方法的步驟(e)中，所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，具體為將所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(BHK-21)與17CL-1細(xì)胞按照1:4的比例混合培養(yǎng)。之后，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，感染新的17CL-1細(xì)胞，進(jìn)而獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒(MHV-LUC)。所述重組鼠肝炎冠狀病毒在如下(al)或(a2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:(al)制備研究鼠肝炎冠狀病毒感染機(jī)制的產(chǎn)品；(a2)制備篩選抗鼠肝炎冠狀病毒藥物的細(xì)胞模型。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供如下(bl)或(b2)的生物材料:(bl)含有所述重組鼠肝炎冠狀病毒的離體動(dòng)物細(xì)胞或重組菌；(b2)含有所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA或cDNA的載體。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施例中，所述動(dòng)物細(xì)胞具體為BHK-21細(xì)胞。本發(fā)明選擇Gaussia熒光素酶(LUC)作為示蹤蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn):1、對細(xì)胞既無毒性，也無種屬、組織和位置特異性；
2、不需要任何反應(yīng)底物及其他輔助因子，只需要激發(fā)光源的激發(fā)即可發(fā)光；3、熒光品質(zhì)穩(wěn)定，能夠克服穿透、毒素、光漂白，高溫等不利因素。本發(fā)明選擇基于痘苗病毒為載體的冠狀病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng),與其他反向遺傳學(xué)系統(tǒng)相比，痘苗病毒載體具有其他載體所沒有的優(yōu)勢。首先，痘苗病毒載體的載容量比較大，可容納至少26Kb外源序列。其次，插入片段在痘苗病毒中比較穩(wěn)定，隨著重組痘苗病毒的增殖，可以獲得高拷貝的外源基因。第三，痘苗病毒載體可介導(dǎo)高頻率的同源重組，便于對基因進(jìn)行修飾改造。實(shí)驗(yàn)證明，對本發(fā)明建立的MHV活體成像示蹤系統(tǒng)一重組鼠肝炎冠狀病毒(MHV-LUC)感染小鼠肝臟后進(jìn)行病毒滴度的測定以及肝損傷的分析，結(jié)果顯示，MHV-WT和MHV-LUC病毒感染小鼠后復(fù)制能力和致病力均無顯著差異，說明重組病毒MHV-LUC可與野生型病毒平行應(yīng)用于MH V的相關(guān)研究。另外，本發(fā)明所提供的重組病毒MHV-LUC由于Gaussia熒光素酶的信號放大效應(yīng)，可以極大的提高病毒監(jiān)測的靈敏度，能夠?qū)Σ《驹谛∈笈K器中的存在與否和病毒的增值情況進(jìn)行直觀初步的觀測，設(shè)備要求簡單。因此，利用動(dòng)物模型開展MHV的感染和抗病毒治療研究時(shí)，MHV示蹤系統(tǒng)可以對傳統(tǒng)的病毒學(xué)研究方法起到很好的輔助和補(bǔ)充作用，不僅極大地?cái)U(kuò)展了經(jīng)典模型系統(tǒng)在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的應(yīng)用，同時(shí)，也為建立新型低劑量病毒亞臨床感染動(dòng)物模型提供了一個(gè)新思路。再則，本發(fā)明為抗冠狀病毒藥物的篩選等應(yīng)用研究也提供新的技術(shù)平臺(tái)。


圖1為為重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的PCR鑒定結(jié)果。其中，泳道Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Markerl5000 ;泳道M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker2000 ;泳道I和4為用引物對PSC40/PSC55進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道2和5為用引物對GPT L-F/PSC55進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道3和6為用引物對GPTR-F/PSC55進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。圖2為重組痘苗病毒V.V.-1nf-LUC-GPT-OUT的PCR鑒定結(jié)果。其中，泳道Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker2000 ;泳道M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker 15000 ;泳道I和5為用引物對GPT L-F/PSC54進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道2和6為用引物對GPT R-F/PSC54進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道3和7為用引物對LUC UP L/PSC54進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；泳道4和8為用引物對LUCUP R/PSC54進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。圖3為重組病毒MHV-LUC測序鑒定結(jié)果示意圖。圖4為重組病毒MHV-LUC的一步生長曲線。其中，WT表示野生型MHV A59株；LUC表示重組病毒MHV-LUC。圖5為重組病毒MHV-LUC感染17CL-1細(xì)胞的培養(yǎng)上清的RLU值(MOI=I )。圖6為腹腔感染病毒后小鼠體重變化情況，劑量為3 X IO6PFU/只。圖7為各組小鼠血清ALT濃度測定結(jié)果，劑量為3 X IO6PFU/只。其中，WT表示野生型MHV A59株；LUC表示重組病毒MHV-LUC。圖8為腹腔感染重組病毒MHV-LUC后小鼠血液中RLU值的測定結(jié)果。其中，A表示注射病毒劑量分別為3 X IO5PFU/只和3 X IO4PFU/只；B表示注射病毒劑量為3 X IO5PFU/只；A和B中，空白對照MOCK均為PBS組小鼠血液加腔腸素底物后測量數(shù)值。
圖9為各組小鼠肝臟病毒滴度測定結(jié)果，劑量為3 X IO5PFU/只。其中，*表示未檢測到病毒；WT表示野生型MHV A59株；LUC表示重組病毒MHV-LUC。圖10為各組小鼠肝臟病理切片(200X)，劑量為3X105PFU/只，感染時(shí)間為5天。其中，A為PBS組小鼠；B為MHV-WT感染小鼠；C為MHV - LUC感染小鼠。圖11為腹腔感染重組病毒MHV-LUC小鼠活體成像監(jiān)測結(jié)果，注射劑量為3 X IO5PFU/只，腔腸素底物注射量3mg/kg。其中，A為小鼠活體成像照片，a為MHV-LUC感染小鼠后第一天，b為MHV-LUC感染小鼠后第二天，c為MHV-LUC感染小鼠后第三天，d為MHV-LUC感染小鼠后第四天，e為MHV-LUC感染小鼠后第五天，f為PBS組小鼠注射腔腸素底物對照為小鼠活體成像發(fā)光平均亮度值，*表示無熒光值。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。毒株、細(xì)胞與小鼠:含鼠肝炎冠狀病毒(mouse hepatitis virus, MHV) A59株基因組全長cDNA的痘苗病毒載體(vaccinia virus inf-1,簡稱v.v.-1nf_l)由英國布里斯托大學(xué)StuartG.Siddell教授惠贈(zèng)，記載在林磊，吳曉燕，常國輝，祝慶余.鼠肝炎冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白I內(nèi)保守序列LLRKxGxKG的功能研究.解放軍醫(yī)學(xué)雜志.2010，35 (5) =508-512.中，公眾可從中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所獲得。質(zhì)粒pSV2-gpt (購自ATCC公司，產(chǎn)品目錄號=37145 ),質(zhì)粒pGL3_Basic (購自Promega公司，產(chǎn)品目錄號:E1751)、CV-1細(xì)胞(購自ATCC，產(chǎn)品目錄號:CCL_70)和BHK-21細(xì)胞(購自ATCC公司，產(chǎn)品目錄號:CCL-10) ;17Clone_l (17CL-1)細(xì)胞(參見文獻(xiàn):Sturman，L S.，and K. K.Takemot0.1972.Enhanced growth of a murine coronavirus intransformed mouse cells.1nfect.1mmun.6:501 - 507.)、D980R 細(xì)胞(參見文獻(xiàn):Kerr, S.M., and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virusrepIication!recovery of plasmids from virus-1nfected cells.Virology,180:625 -632.)015-18g，6_8周齡的雌性Balb/c小鼠購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。主要試劑和材料:DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase, Suoerscript III反轉(zhuǎn)錄酶，脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染試劑等均購自Invitrogen公司；RiboMAX LargeScale RNA Production System T7, Ribo m7G Cap Analog購自 Promega公司；Mycophenolicacid (MPA), Hypoxanthine, Xanthine, 6-Thioguanine (6-TG), Gelrite Gellan Gum 等均購自sigma公司；Doxycycline hyclate購自BioChemika ；Eag I限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；RNeasy Mini Kit 購自 QIAGEN。實(shí)施例1、LUC標(biāo)記的重組鼠肝炎冠狀病毒的構(gòu)建一、同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pGPT-1N-0RF4的構(gòu)建及鑒定將野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(GenBank號:NC_001846.1，Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(對應(yīng)序列I的第1-467位，命名為上游同源臂)和第28265-28700位(對應(yīng)序列I的第766-1201位，命名為下游同源臂)分別克隆至質(zhì)粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質(zhì)粒pGPT-1N-0RF4。具體操作如下:(I)痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l基因組DNA的提取由于痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l含野生型鼠肝炎冠狀病毒(mousehepatitis virus, MHV) A59株基因組全長cDNA，所以提取其基因組DNA作為模板，用于擴(kuò)增所述上游同源臂和所述下游同源臂。具體操作如下:將痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l用DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯螅尤氲脚囵B(yǎng)至單層的BHK-21細(xì)胞中(MOI=I),于37°C培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變。待細(xì)胞病變達(dá)到+++ (約3d)時(shí)，用細(xì)胞刮刮取病變細(xì)胞，2000rpm離心8min后，取細(xì)胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或_70°C凍存?zhèn)溆谩２《綝NA提取步驟如下:I)取細(xì)胞沉淀，加入一定體積的 Buffer A (IOmM Tris-Cl pH9.0, ImM EDTA)充分懸浮，凍融3次，并超聲波處理3分鐘，充分裂解細(xì)胞釋放病毒。2)加 1/10 體積 0.5% (0.5g/100ml)的胰蛋白酶，37°C水浴，消化 20min。3)將上述反應(yīng)液加入到含有蔗糖墊(用ImM的pH9.0的Tris配制)的超速離心管中，16000rpm,4°C,90min離心。棄上清,用400μ1 Buffer A重懸沉淀,儲(chǔ)存于4°C冰箱。4)加適量RNase-free DNase (具體用量參照產(chǎn)品說明書)到病毒重懸液，37°C，20min,以消化病毒外的細(xì)胞DNA。然后加入終濃度IOmM的EDTA，65 V，IOmin終止消化。

5)向上述反應(yīng)液中加入I倍體積的2XProteinase K Digestion Buffer和適量Proteinase K (終濃度 50 μ g/ml), 50°C溫育 2h。6)加I倍體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)，輕輕顛倒混合均勻，13，OOOrpm離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)入新管(注意不要吸到中間蛋白質(zhì)層)。7)向新管中加I倍體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1)，輕輕顛倒混合均勻，14, OOOrpm離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)入新管。8)加2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA,輕輕顛倒混合均勻，14, OOOrpm離心15min。9)棄掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片層，14，OOOrpm離心lOmin。用移液器完全移除液體，加40-100 μ I無RNase水溶解DNA。10)提取完成后，于260nm處測定其OD值，以判斷DNA濃度和純度，并_70°C凍存?zhèn)溆谩?2)引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(GenBank號:NC_001846.1，Up date:2012-8-23)設(shè)計(jì)并合成如下兩個(gè)引物對:擴(kuò)增上游同源臂的引物對:L-UP:5，-GCGGCCGCCTTCAATACCTAATCCACCCGAC-3，(下劃線部分為酶切位點(diǎn) Not I的識別序列，其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第27500-27522位，即序列I的第1_23位)L-down:5’-GTCGACGGTAGCAATGAGAATGCTATAAATTG_3’(下劃線部分為酶切位點(diǎn) SalI的識別序列，其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第27941-27966位的反向互補(bǔ)序列，即序列I的第442-467位的反向互補(bǔ)序列)擴(kuò)增下游同源臂的引物對:R-up:5’ -CTGCAGAGAGGTTTTGATTATAGTAC-3，(下劃線部分為酶切位點(diǎn) Pst I 的識別序列，其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第28265-28284位，序列I的第766-785位)R-down:5’ ~GGATCCTCGAGCTGCGTGGCCCTAAAAAG~3 (下劃線部分為酶切位點(diǎn) BamHI的識別序列,其后的序列為GenBank:NC_001846.1的第28678-28700位的反向互補(bǔ)序列，序列I的第1179-1201位的反向互補(bǔ)序列)(3)重組質(zhì)粒pGPT-1N-0RF4的構(gòu)建及鑒定以步驟(I)獲得的痘苗病毒載體vaccinia virus inf_l基因組DNA為模板，以步驟(2)設(shè)計(jì)合成的兩個(gè)引物對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的上游同源臂和下游同源臂。首先用限制性內(nèi)切酶Not I和Sal I雙酶切所述上游同源臂，將其與經(jīng)過同樣雙酶切的pSV2-gpt質(zhì)粒大片段相連，獲得中間質(zhì)粒；接著用限制性內(nèi)切酶Pst I和BamHI雙酶切所述下游同源臂，將其與經(jīng)過同樣雙酶切的所述中間質(zhì)粒大片段相連，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定在pSV2-gpt質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)Not I和Sal I之間插入了 GenBank號為NC_001846.1 (Up date:2012-8-23)的序列的第27500-27966位核苷酸，同時(shí)在酶切位點(diǎn)Pst I 和 BamH I 之間插入了 GenBank 號為 NC_001846.1 (Up date:2012-8-23)的序列的第28265-28700位核苷酸的重組質(zhì)粒為陽性，將其命名為pGPT-1N_0RF4。2、重組質(zhì)粒pGPT-OUT-LUC的構(gòu)建及鑒定(I) LUC基因片段的獲得從質(zhì)粒pGL3_Basic中獲得本發(fā)明所需的Gaussia熒光素酶的編碼基因，并在其兩端添加上構(gòu)建重組質(zhì)粒所需的酶 切位點(diǎn)。具體操作如下:利用LUC特異引物L(fēng)UC up和LUC down從質(zhì)粒pGL3_Basic中獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的LUC基因片段。LUC UD: 5，-GTCGACCTAGACCCATGGGCGTGAAGG-3，(下劃線部分為酶切位點(diǎn) Sal I 的識別序列，整個(gè)序列為序列3的第1-27位的序列)LUC down: 5，-CTGCAGGAATTCTTACGTATCGCCGCC-3，(下劃線部分為酶切位點(diǎn) Pst I的識別序列，整個(gè)序列為序列3的第561-587位反向互補(bǔ)序列)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為序列表中序列3。(2)重組質(zhì)粒pGPT-OUT-LUC的構(gòu)建及鑒定用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I雙酶切步驟(I)獲得的LUC基因片段，與將其與經(jīng)過同樣雙酶切的步驟I構(gòu)建的重組質(zhì)粒PGPT-1N-0RF4的載體大片段相連，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定將重組質(zhì)粒PGPT-1N-0RF4的酶切位點(diǎn)Sal I和Pst I之間的gpt基因取代為序列表中序列3的第7-581位所示核苷酸序列的重組質(zhì)粒為陽性，將其命名為pGPT-OUT-LUC。序列表中序列3的第15-575位為Gaussia熒光素酶的編碼基因。二、重組痘苗病毒的構(gòu)建1、重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的構(gòu)建及鑒定利用冠狀病毒的痘苗病毒載體反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，通過感染-轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞，使痘苗病毒載體vaccinia virus inf-1與重組質(zhì)粒pGPT_IN_0RF4通過上游同源臂和下游同源臂發(fā)生同源重組，以E.Coli gpt基因作為陽性篩選標(biāo)記，利用蝕斑純化，獲得以所述gpt基因替代所述vaccinia virus inf-1中的位于GenBank號為NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠狀病毒A59株的基因組cDNA序列(Up date =2012-8-23)的第27967-28264位核苷酸序列的重組痘苗病毒載體V.V-1nf-gpt-1n。具體操作如下:(I) GPT-1N同源重組細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得將CV-1細(xì)胞按照1:2的比例由75cm2培養(yǎng)瓶傳至6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至80_90%匯合度，感染痘苗病毒載體vaccinia virus inf-1 (MOI=I )，37°C吸附lh，然后吸除病毒液，獲得感染后的CV-1細(xì)胞；按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將步驟一獲得的重組質(zhì)粒PGPT-1N-0RF4轉(zhuǎn)染所述感染后的CV-1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)2_3d，直至細(xì)胞病變完全，反復(fù)凍融后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，得到GPT-1N同源重組細(xì)胞培養(yǎng)物，于_70°C保存?zhèn)溆谩?2) GPT陽性篩選GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基 (pH7.0):由霉酚酸、次黃嘌呤、黃嘌呤和DMEM培養(yǎng)基組成；所述霉酚酸在GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基中的終濃度為25 μ g/ml，所述次黃嘌呤在GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基中的終濃度為15 μ g/ml，所述黃嘌呤在GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基中的終濃度為 250 μ g/ml ο2XMEM 培養(yǎng)基(ρΗ7.0):將 100mll0XMEM、10mll00XMEM 非必需氨基酸和 IOOml
胎牛血清混合后，用水定容至500ml。將CV-1細(xì)胞按照1:2的比例由75cm2培養(yǎng)瓶傳至6孔板內(nèi)，于37°C 5%C02的條件下培養(yǎng)，至80%匯合度時(shí)，換成GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。取上述步驟(I)獲得的GPT-1N同源重組細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，用GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基稀釋10倍，感染上述在GPT陽性的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CV-1細(xì)胞(M0I=1)，37°C吸附lh。其間，將0.25%Gelrite (固化劑，質(zhì)量百分含量)和2 XMEM培養(yǎng)基預(yù)熱至56°C，且在2 XMEM培養(yǎng)基中加入GPT陽性篩選藥物(霉酚酸、次黃嘌呤和黃嘌呤，所述霉酚酸在2 XMEM培養(yǎng)基中的終濃度為25 μ g/ml，所述次黃嘌呤在2 XMEM培養(yǎng)基中的終濃度為15μ g/ml，所述黃嘌呤在2XMEM培養(yǎng)基中的終濃度為250 μ g/ml)。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，將適量0.25%Gelrite和加入了 GPT陽性篩選藥物的2XMEM培養(yǎng)基等體積混勻，按3ml/孔加入各孔；室溫防治3-5min，待其凝固后，置于37°C繼續(xù)培養(yǎng)，直至觀察到明顯的細(xì)胞病變，挑取單個(gè)蝕斑，獲得已純化的重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n (簡稱:V.V-1nf-gpt-1n),于 _70°C保存?zhèn)溆谩?3)重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的鑒定A.引物設(shè)計(jì)根據(jù)鼠肝炎冠狀病毒A59 株(Mouse Hepatitis Virus strain A59)的 mRNA 序列(GenBank:NC_001846.1)及GPT基因序列設(shè)計(jì)鑒定引物如表I。弓丨物由Invitrogen公司合成，用無核酸酶水配制成濃度為10 μ M的工作液，-20°C保存?zhèn)溆谩１鞩重組痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n PCR鑒定所用弓丨物
權(quán)利要求
1.重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進(jìn)行替換或插入得到的重組病毒； 所述替換為:將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段換為片段b; 所述插入為:在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點(diǎn)處插入所述片段b; 所述片段a為序列表中序列I編碼的RNA ;所述片段b為含有Gaussia熒光素酶編碼基因的DNA片段編碼的RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述Gaussia熒光素酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述Gaussia熒光素酶的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?的第17-575位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段的序列為序列表中序列3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述野生型鼠肝炎冠狀病毒為鼠肝炎冠狀病毒A59株；或 所述替換中，所述片段a中的任一片段為所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸對應(yīng)的RNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組鼠肝炎冠狀病毒，其特征在于:所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA反轉(zhuǎn)錄的c DNA序列為GenBank號為NC_001846.1的序列的第27967-28264位替換為序列表中序列3，得到的核苷酸序列。
7.制備權(quán)利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒的方法，包括如下步驟: Ca)將權(quán)利要求1-6任一中所述的野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列分別克隆至質(zhì)粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重組質(zhì)粒甲； 所述待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)位于序列I中； (b)用含權(quán)利要求1-6任一中所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列的痘苗病毒載體甲感染CV-1細(xì)胞后，用步驟(a)獲得的重組質(zhì)粒甲轉(zhuǎn)染所述CV-1細(xì)胞，所述痘苗病毒載體甲與所述重組質(zhì)粒甲通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列發(fā)生同源重組，獲得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒載體甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒載體甲中的所述待插入位點(diǎn)處插入所述gpt基因的重組痘苗病毒載體乙； (c)將步驟(a)中的所述重組質(zhì)粒甲中的所述gpt基因替換為權(quán)利要求1-4任一中所述的含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段，得到重組質(zhì)粒乙； Cd)用步驟(b)得到的重組痘苗病毒載體乙感染新的CV-1細(xì)胞后，用步驟(c)獲得的重組質(zhì)粒乙轉(zhuǎn)染所述新的CV-1細(xì)胞，所述重組痘苗病毒載體乙與所述重組質(zhì)粒乙通過所述位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列發(fā)生同源重組，獲得以所述含有Gaussia熒光素酶的編碼基因的DNA片段替代所述重組痘苗病毒載體乙中所述gpt基因的重組豆苗病毒載體丙；(e)提取步驟(d)得到的重組痘苗病毒載體丙的基因組DNA，通過體外轉(zhuǎn)錄，獲得所述重組痘苗病毒載體丙的基因組的全長RNA ;將所述全長RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，獲得所述重組鼠肝炎冠狀病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述方法的步驟(a)中，位于待取代核苷酸序列或待插入位點(diǎn)上游和下游的序列分別為GenBank號為NC_001846.1的序列的第27500-27966 位和第 28265-28700 位的序列。
9.權(quán)利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒在如下(al)或(a2)中的應(yīng)用: (al)制備研究鼠肝炎冠狀病毒感染機(jī)制的產(chǎn)品； (a2)制備篩選抗鼠肝炎冠狀病毒藥物的細(xì)胞模型。
10.如下(bl)或(b2)的生物材料: (bl)含有權(quán)利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒的離體動(dòng)物細(xì)胞或重組菌； (b2)含有權(quán)利要求1-6中任一所述重組鼠肝炎冠狀病毒的基因組RNA或cDNA的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼠肝炎冠狀病毒的LUC示蹤系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供系統(tǒng)為重組鼠肝炎冠狀病毒，是將野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA進(jìn)行替換或插入得到的重組病毒；所述替換為將所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的片段a中的任一片段換為片段b；所述插入為在所述野生型鼠肝炎冠狀病毒基因組RNA中的所述片段a中的任一位點(diǎn)處插入所述片段b；所述片段a為序列表中序列1編碼的RNA；所述片段b為含有Gaussia熒光素酶編碼基因的DNA片段編碼的RNA。本發(fā)明的MHV-LUC可與野生型病毒平行用于研究。另外，由于LUC的信號放大效應(yīng)，MHV-LUC可極大提高病毒監(jiān)測靈敏度，為建立新型低劑量病毒亞臨床感染動(dòng)物模型提供了新思路，為抗冠狀病毒藥物篩選等應(yīng)用研究也提供新技術(shù)平臺(tái)。
文檔編號C12R1/93GK103146657SQ20131007300
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者常國輝, 劉京梅, 孫走南, 柳洪濤, 楊益, 吳曉燕, 蘇文莉, 張雨, 何湘 申請人:中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所