專利名稱：一種批量獲得基因組dna中差異位點及其側翼序列的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種批量獲得基因組DNA中差異位點及其側翼序列的方法。
背景技術：
在物種進化過程中，不同物種間基因組的差異多表現(xiàn)為基因組的大小不同、染色體的重排、基因結構的改變、堿基插入、堿基刪除以及大量的單堿基核苷酸突變(SNP );同一品種(系)不同個體的基因組差異主要表現(xiàn)為若干堿基的插入、刪除以及大量SNP。這些不同形式的基因組差異或突變造成不同個體間存在較大的表型差異，一些堿基的突變甚至會造成疾病的發(fā)生以及生命體的發(fā)育終止?；蚪M差異位點的獲得對于揭示不同個體或群體間表型不同的產生原因具有重要意義。目前，基因突變位點分析技術主要包括對已知突變位點檢測技術和對未知突變位點的檢測技術，其中，檢測未知突變位點的技術包括單鏈構象多態(tài)性(SSCP)技術、變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術、sanger測序技術和高通量測序技術等；檢測已知突變位點的技術有PCR-RFLP 酶切、等位基因特異 PCR(AS-PCR) ,SNP 芯片技術(Genechips) ,MassARRAY,Taqman探針法和質譜技術等。其中，高通量測序技術和芯片技術雖分析通量大，但成本高昂、需要特殊的儀器設備和試劑，而其余技術的分析通量又太小，均不能廣泛應用于基因組差異分析。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得基因組DNA中差異位點及其側翼序列的方法，包括如下步驟:I)將基因組DNA 甲和基因組DNA乙混合后進行分子雜交，使異源的單鏈DNA進行堿基配對并形成異源雙鏈DNA區(qū)，收集雜交產物；2)用SI核酸內切酶酶切步驟I)所述雜交產物，收集酶切產物；3)回收步驟2)所述酶切產物中目的范圍大小的DNA片段，獲得不同大小的異源雙鏈DNA片段的混合物，即混合DNA片段A ；4)將步驟3)所述混合DNA片段A進行分子雜交，使同源的單鏈DNA進行堿基配對形成同源雙鏈DNA片段，收集雜交產物；5)將步驟4)所述雜交產物中的同源雙鏈DNA片段進行末端補平，獲得不同大小的同源雙鏈DNA片段的混合物，即混合DNA片段B ；6)將步驟5)所述混合DNA片段B中的DNA片段兩端連接相同的接頭DNA，獲得混合DNA片段C ；7)使用以步驟6)所述接頭DNA序列設計的引物PCR擴增步驟6)所述混合DNA片段C，獲得混合DNA片段D ;8)將所述混合DNA片段C中的DNA片段進行測序，將所述測序的結果進行序列比對，最后獲得基因組DNA甲和基因組DNA乙中的差異位點及其側翼序列；
所述異源是指分別來自于所述基因組甲和所述基因組乙；
所述同源是指均來自于所述基因組甲或所述基因組乙；
所述混合DNA片段是指不同大小的DNA片段的混合物；
所述將所述測序的結果進行序列比對按照包括如下步驟的方法進行:將所述測序的結果去除所述接頭DNA序列后，再與所述基因組甲和所述基因組乙的同物種的已知基因組全部或部分序列比對。
在上述方法中，步驟2)中所述SI核酸內切酶可為核酸內切酶CEL I。
在上述方法中，步驟4)中所述分子雜交按照包括如下步驟的方法進行:將步驟3)所述混合DNA片段A依次進行如下處理:95°C 10分鐘、70°C 10分鐘、50°C 50分鐘和40°C 50分鐘。
在上述方法中，步驟6)中所述接頭DNA為由核苷酸序列分別為序列表序列I和序列2的兩條單鏈DNA組成的互補雙鏈核苷酸鏈。
在上述方法中，步驟5)所述末端補平具體可通過T4DNA聚合酶實現(xiàn)。
在上述方法中，步驟3)所述目的范圍大小可為50bp — 10kb。
在上述方法中，步驟I)所述分子雜交按照包括如下步驟的方法進行:將基因組DNA甲和基因組DNA乙混合后依次進行如下處理:98°C 10分鐘、70°C 10分鐘、50°C 50分鐘、40 0C 50 分鐘。
在上述方法中，所述基因組DNA甲和基因組DNA乙來源于同一種、品種或品系的動物、植物或微生物。
在上述方法中，所述基因組DNA甲來源于阿勒泰羊，所述基因組DNA乙來源于中國美利奴羊新疆軍墾細毛羊。
本發(fā)明還提供了一種構建基因組DNA差異位點及其側翼序列的DNA文庫的方法，包括上述任一所述方法中的所述步驟I) 一7)。
實驗證明，使用本發(fā)明所提供的方法，獲得了含粗毛羊(阿勒泰羊)和細毛羊(中國美利奴羊新疆軍墾細毛羊)的基因組DNA之間差異序列位點及其側翼序列信息的DNA片段D的陽性克隆2000個，隨機取5個陽性克隆對其DNA片段D進行測序，去除兩端的接頭序列，獲得4個不同的DNA片段B的序列。經測序分析，每個所述DNA片段B上的兩端序列或每個DNA片段B兩側外的臨近序列均為粗羊毛基因組DNA和細羊毛基因DNA的兩個不同差異位點序列。
本發(fā)明所提供的方法具有如下優(yōu)點:操作簡單方便，在測序前不需要使用復雜設備或昂貴的試劑，也不需要進行引物設計，通過自雜交和末端補平以及添加接頭的步驟就可將含差異位點和側翼序列的不同DNA片段(即DNA文庫)連接到克隆載體上；效率高，通量大，成本低，一條陽性克隆可提供2處基因組DNA差異位點及其側翼序列的信息；適用范圍廣，可用于農業(yè)動物(豬、馬、牛、羊和雞等)品種、品系間基因組DNA未知差異位點的檢測，還可用于性狀差異較大的植物-植物、微生物-微生物間的未知差異位點分析及癌癥細胞與正常細胞間未知的基因組DNA序列差異。


圖1為一條DNA片段B的測序結果(已除去接頭序列)。其中，左框線內的序列與圖2中左上圖和左下圖中的右端部分序列相同，右框線內的序列與圖2中右上圖和右下圖中的左端部分序列相同。圖2為細毛羊和粗毛羊的基因組DNA序列中對應于圖1所不序列的左側及左側外的部分序列(左上圖和左下圖)，及細毛羊和粗毛羊的基因組DNA序列中對應于圖1所示序列的右側及右側外部分序列(右上圖和右下圖)。結果顯示，在細毛羊和粗毛樣的基因組DNA對應于圖1所示序列的左側外存在一個堿基突變(左框線處)，在該位點，細毛羊的基因型為TT純合，粗毛羊的基因型為GG純合；在細毛羊和粗毛樣的基因組DNA對應于圖1所示序列的右側外存在一個堿基突變(右框線處)，在該位點，細毛羊的基因型為TC雜合(用N表示)，粗毛羊的基因型為TT純合。圖1和圖2的結果說明，在該DNA片段B的左側外的一個堿基和右側外的一個堿基分別為細毛羊和粗毛羊的基因組DNA的兩個不同突變位點。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、批量獲得基因組DNA中的差異位點1、基因組DNA的獲得按照文獻(盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學實驗技術.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版，1999年)中的酚-氯仿抽提DNA的方法分別提取粗毛羊(阿勒泰羊)和細毛羊(中國美利奴羊新疆軍墾細毛羊)耳組織的基因組DNA，用ddH20將基因組DNA的終濃度均稀釋為200ng/u L0
2、基因組DNA的雜交取等量的步驟I獲得的粗、細毛羊基因組DNA (各5 L，即I g基因組DNA))混合，按照如下反應體系和條件進行分子雜交:雜交反應體系:1 ii L50XDenhardt’ s (購自invitrogen公司，產品目錄編號為750018),2.5 u L20XSSC (溶劑為水，溶質及其濃度分別為:氯化鈉3.0mol/L，檸檬酸鈉
0.3mol/L)、5.0ii L粗毛羊基因組DNA和5.0 y L細毛羊基因組DNA，用ddH20補至50.0u L0雜交反應條件:98°C 10分鐘后，迅速退火至70°C 10分鐘、50°C 50分鐘、40°C 50分鐘、常溫30分鐘。由于基因組DNA很長，經雜交后形成的雙鏈基因組DNA為部分區(qū)段為異源和部分區(qū)段為同源的雙鏈基因組DNA。3、兩基因組未形成雙鏈區(qū)的單鏈DNA區(qū)(即序列差異位點)的酶切收集步驟2的雜交產物，用核酸內切酶CEL I (一種單鏈特異性核酸酶，能準確切割異源雙鏈DNA錯配位點，并在錯配堿基的3’端進行切割)按照如下反應體系和條件進行酶切:酶切反應體系:步驟2獲得的雜交產物50.0ii L，7.0ii L0.15M MgCl2Solution,6.0u L SURVEYOR Nuclease S(即 CEL I 酶)和 7.0 y L SURVEYOR Enhancer S，共計 70 u L。上述MgCl2Solution、SURVEYOR Nuclease S 和 SURVEYOR Enhancer S 為Transgenomic公司的產品目錄編號為706020的CEL I酶試劑盒SURVRYOR+ MutationDetection Kit 中的試劑。
酶切反應條件:42°C酶切10小時以上，加入10 μ L0.225mol/L EDTA(pH8.0)終止反應。
4、酶切產物的純化
收集步驟3的酶切產物(即步驟3酶切后的反應液)加入到omega DNA純化柱(為omega公司的產品目錄號為D2500-01的omega膠回收試劑盒中的產品)中，按照試劑盒使用說明進行DNA片段的純化(此步驟可除去蛋白、鹽離子、酶切所產生的殘存堿基、未切的基因組，同時還可將不利于后期TA克隆的小于50bp和大于IOkb的DNA片段除去)，最后，使用20 μ L ddH20洗脫柱子，回收50bp — IOkb大小的異源雙鏈基因組DNA片段(命名為混合DNA片段A)。
由于異源雙鏈基因組DNA之間在非配對處(即序列差異位點)形成不匹配的大、小空泡(即單鏈DNA區(qū))，能被CEL I切割(但在兩個不匹配單鏈DNA上的切割位置是隨機的)并產生不匹配的末端，而同源雙鏈基因組DNA不能被CEL I切割，因此，經步驟3的酶切和步驟4的去純化后獲得的基因組片段為兩末端分別帶不同序列差異位點部分堿基的完全異源雙鏈基因組DNA片段(即 混合DNA片段A)。
5、自雜交
將20.0 μ L步驟4的所述混合DNA片段Α，依次經95°C 10分鐘、70°C 10分鐘、500C 50分鐘、40°C 50分鐘和常溫30分鐘的處理進行分子雜交，收集雜交產物。
6、末端補平
將步驟5收集的雜交產物于如下反應體系和條件下用T4DNA聚合酶補平末端和DNA純化，獲得兩末端為平齊的同源雙鏈基因組DNA片段(命名為混合DNA片段B):
反應體系:步驟5獲得的自雜交產物、3U的T4DNA聚合酶(購自Takara，產品目錄編號為 2040Α)、3μ L 的 10XT4DNA Polymerase Buffer、3 μ L 的 0.1%BSA和 2 μ L2mM 的 dNTPMixture,用水補充至30 μ L。
反應條件:37°C溫育30分鐘后，劇烈震蕩致酶失活后置冰上保存。
將補平產物按照步驟4的方法進行DNA的純化回收，最后用20 μ L ddH20洗脫柱子回收，獲得所述混合DNA片段B。
步驟4獲得的異源雙鏈基因組混合DNA片段A兩端含有不配對序列，不利于末端補平。步驟5的自雜交可使不同的異源雙鏈基因組DNA片段即混合DNA片段A中的DNA片段先變性為單鏈DNA，再經退火形成同源雙鏈基因組DNA片段，由于CEL I切割空泡的位置是隨機的，該同源雙鏈基因組DNA片段上存在粘性末端的情況，經步驟6的末端補齊，獲得可用于加接頭DNA的平末端；
另外，經步驟5未形成同源雙鏈基因組DNA片段的異源雙鏈基因組DNA片段，經步驟6后末端不能補齊(因為不是粘性末端而沒有模板)，從而在步驟7中無法加接頭并進行步驟8的PCR擴增及步驟9的連接，被丟失。
7、接頭的設計、合成與連接
設計并合成單鏈DNA接頭F和單鏈DNA接頭R，退火后形成雙鏈DNA接頭H，再與步驟6獲得的產物按照如下反應體系和條件進行連接:
連接反應體系:10X T4DNA Ligase Buffer2.5 μ L,混合 DNA 片段 Β20 μ L,接頭 H(5pM) I u L, T4DNA Ligase (Takara, D2011A) I u L, ddH200.5 y L。連接反應條件:16°C連接10小時以上。連接完畢后加入2.5 ii L的3M CH3COONa (pH5.2)，再加入3倍體積的冷無水乙醇，-20°C放置I小時；13000rpm離心20分鐘，75%冷乙醇洗沉淀2次；加20 u L ddH20,獲得在步驟6獲得的混合DNA片段B中DNA片段兩末端均添加接頭H的重組DNA片段(命名為混合DNA片段C)。上述接頭F和接頭R的序列如下:接頭F:5’-AGACT CGACT GAGTT GCCGT GAGTC ACGAG GAGTG AGCTG-3’(如序列表序列I所示)(5’端去磷酸化修飾，以防止接頭分子自連)；接頭R:5，-CAGCT CACTC CTCGT GACTC ACGGC AACTC AGTCG AGTCT-3，(如序列表序列2所示)。8、PCR 擴增設計并合成單鏈DNA引物M (5’ -CGACT GAGTT GCCGT GAGTC-3’)，在如下反應體系和條件下PCR擴增混合DNA片段C，獲得混合DNA片段D:PCR 擴增反應體系(50ul):10Xbuffer5ul，dNTP (IOmM) 4ul，引物 M (IOpM) Iul，LA Taq 酶 0.5ul，混合 DNA 片段 C50ng,加 ddH20 至 50ul ；PCR 擴增反應條件:94°C變性 5min ;再941: 30sec,65°C 30sec,72°C 3min，循環(huán) 20次；最后 720C IOmin09、連接T載體后測序 將混合DNA片段D純化回收后與T載體連接，獲得2000個陽性克隆，隨機取5陽性克隆對其DNA片段D進行測序，去除兩端的接頭序列，獲得4個不同的DNA片段B的序列。10、序列分析將步驟9獲得的4個DNA片段B的序列先與UCSC Genome Bioinformatics (網址:http://genome, ucsc.edu/)中綿羊的基因組進行序列比對,再根據DNA片段B序列對應于綿羊基因組的上下游序列設計引物，分別以粗羊毛基因組DNA和細羊毛基因DNA為模板，PCR擴增涵蓋該DNA片段B序列的DNA片段，將得到的PCR產物分別測序后進行相互的序列比對，獲得粗羊毛基因組DNA和細羊毛基因DNA的差異位點序列及其側翼序列。結果證明，每個DNA片段B上的兩端或每個DNA片段B外的臨近兩側均為粗羊毛基因組DNA和細羊毛基因DNA的不同差異位點序列。下面以混合DNA片段D與T載體連接后獲得的2000個陽性克隆中的其中一個陽性克隆為例，進行說明:將該陽性克隆上的DNA片段D進行測序后，除去接頭序列，得到的序列如圖1所示。將圖1所示序列與綿羊的基因組序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，圖1所示序列位于綿羊第四條染色體上，為IGFBP3基因第四內含子的部分序列。根據圖1所示序列在綿羊基因組的上、下游序列，分別設計引物 (5’ -TGCCT CAGCA CGGAG AGCAA G-3’ 和 5’ -GAACC ATGAG GCTCATGGGG G-3’)，再分別以粗毛羊和細毛羊的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產物分別進行測序，結果表明:粗、細毛羊基因組在圖1所示DNA序列的左右兩側各存在I處堿基突變(結果如圖2所示)，這兩處突變分別與文獻“沈敏，王文君，楊永林等IGFBP-3基因多態(tài)性及其與中國美利奴羊部分羊毛性狀的關聯(lián)分析.遺傳，2008，30 (9):1182-1186”和文獻“沈敏，王文君，楊永林等中國美利奴羊IGFBP-3基因內含子4區(qū)的PCR-RFLP多態(tài)性分析.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37 (8):134-138”中的報道結果一致，圖1所示序列即為這兩個突變堿基位點的其中 一側的側翼序列。
權利要求
1.一種獲得基因組DNA中差異位點及其側翼序列的方法，包括如下步驟: 1)將基因組DNA甲和基因組DNA乙混合后進行分子雜交，使異源的單鏈DNA進行堿基配對并形成異源雙鏈DNA區(qū)，收集雜交產物； 2)用SI核酸內切酶酶切步驟I)所述雜交產物，收集酶切產物； 3)回收步驟2)所述酶切產物中目的范圍大小的DNA片段，獲得不同大小的異源雙鏈DNA片段的混合物，即混合DNA片段A ； 4)將步驟3)所述混合DNA片段A進行分子雜交，使同源的單鏈DNA進行堿基配對形成同源雙鏈DNA片段，收集雜交產物； 5)將步驟4)所述雜交產物中的同源雙鏈DNA片段進行末端補平，獲得不同大小的同源雙鏈DNA片段的混合物，即混合DNA片段B ； 6)將步驟5)所述混合DNA片段B中的DNA片段兩端連接相同的接頭DNA，獲得混合DNA片段C ； 7)使用以步驟6)所述接頭DNA序列設計的引物PCR擴增步驟6)所述混合DNA片段C ； 8)將所述混合DNA片段C中的DNA片段進行測序，將所述測序的結果進行序列比對，最后獲得基因組DNA甲和基因組DNA乙中的差異位點及其側翼序列； 所述異源是指分別來自于所述基因組甲和所述基因組乙； 所述同源是指均來自于所述基因組甲或所述基因組乙； 所述混合DNA片段是指不同大小的DNA片段的混合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述SI核酸內切酶為核酸內切酶CEL 1。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟4)中所述分子雜交按照包括如下步驟的方法進行:將步驟3)所述混合DNA片段A依次進行如下處理:95°C 10分鐘、700C 10分鐘、50°C 50分鐘和400C 50分鐘。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟6)中所述接頭DNA為由核苷酸序列分別為序列表序列I和序列2的兩條單鏈DNA組成的互補雙鏈核苷酸鏈。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步驟5)所述末端補平是通過T4DNA聚合酶實現(xiàn)的。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟3)所述目的范圍大小為50bp一 IOkb。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟I)所述分子雜交按照包括如下步驟的方法進行:將基因組DNA甲和基因組DNA乙混合后依次進行如下處理:98°C 10分鐘、70°C 10分鐘、50°C 50分鐘、40°C 50分鐘。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述基因組DNA甲和基因組DNA乙來源于同一種、品種或品系的動物、植物或微生物。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述基因組DNA甲來源于阿勒泰羊，所述基因組DNA乙來源于中國美利奴羊新疆軍墾細毛羊。
10.一種構建基因組DNA差異位點及其側翼序列的DNA文庫的方法，包括權利要求1一9中任一所述方法中的所述步驟I) 一7)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種批量獲得基因組DNA中差異位點及其側翼序列的方法。該方法包括如下步驟將基因組DNA甲和基因組DNA乙混合后雜交，用CELⅠ核酸內切酶對未形成雙鏈區(qū)的單鏈DNA區(qū)進行酶切，回收酶切產物中目的范圍大小的DNA片段進行自雜交；再進行DNA末端補平、加接頭DNA、PCR擴增和測序，最后獲得基因組DNA甲和基因組DNA乙的基因組DNA中的差異位點。本發(fā)明所提供的方法具有如下優(yōu)點效率高，通量大，成本低，一條陽性克隆可提供2處基因組DNA差異位點信息；操作簡單方便，在測序前不需要使用復雜設備或昂貴的試劑；可廣泛用于動物、植物和微生物品種間、品系間及癌癥細胞與正常細胞間基因組DNA差異位點的檢測分析。
文檔編號C12N15/10GK103146686SQ20131007538
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權日2013年3月7日
發(fā)明者甘尚權, 高蕊, 沈敏, 王新華, 劉守仁 申請人:新疆農墾科學院