專利名稱：馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法及其特異性引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及馬尾松、濕地松及其雜交品種的鑒定，尤其是一種馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法及其特異性引物對(duì)。
背景技術(shù)：
馬尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我國(guó)分布最廣的針葉樹(shù)種，也是我國(guó)南方地區(qū)重要的用材、荒山造林和工業(yè)原料樹(shù)種，其木材和松脂是許多森林工業(yè)、林產(chǎn)工業(yè)和造紙工業(yè)的主要原料。馬尾松在我國(guó)亞熱帶地區(qū)(約占國(guó)土 1/5)山地均有分布，林分總面積居全國(guó)針葉樹(shù)種首位， 蓄積量?jī)H次于云杉、冷杉和落葉松，居全國(guó)針葉樹(shù)種第四位。濕地松(Pinus elliottii)是我國(guó)南方人工林大面積成功推廣的引種樹(shù)種之一，具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)、材質(zhì)好、松脂產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。種間雜交是獲得雜種優(yōu)勢(shì)的主要方法，是林木遺傳育種研究的重要內(nèi)容。開(kāi)展馬尾松與濕地松種間雜交研究，如何獲得兼具雙親優(yōu)點(diǎn)的雜交子代對(duì)我國(guó)的松樹(shù)改良具有深遠(yuǎn)意義。盡管馬尾松與濕地松為同一亞屬，但其原產(chǎn)地與親緣關(guān)系均相距甚遠(yuǎn)，未見(jiàn)成功雜交的先例。松樹(shù)的花粉具有氣囊隨風(fēng)擴(kuò)散能力極強(qiáng)，很容易對(duì)松樹(shù)雜交授粉形成污染干擾。因此，雜交子代的鑒定是確定雜交是否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在分子遺傳學(xué)水平進(jìn)行雜種鑒定是目前最可靠的鑒定方法之一，然而，目前尚無(wú)馬尾松、濕地松及其雜交品種的分子生物學(xué)鑒定方法，影響馬尾松和濕地松種間雜交研究順利進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法及其特異性引物對(duì)，為開(kāi)展馬尾松和濕地松種間雜交研究建立了有效的松屬種間分子鑒定技術(shù)體系，對(duì)將來(lái)濕馬雜交苗木的鑒定和交易具有十分重要的意義。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法，包括以下步驟:〈 DDNA 提取采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法提取樣品DNA ；<2>PCR 擴(kuò)增用步驟〈I>的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系:共 IOii L，包括模板 DNA1.2 ii L、10XBufferl u L、2mM_dNTP0.2 y L、25mu-MgCl21.1 u L> r-Taq0.1 u L> F-primer0.25 y L> R-primer0.25 y L> ddH205.9 u L ；PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94 V 4min ;梯度降溫?cái)U(kuò)增16循環(huán)，第一次94 V 15s,60°C 15s，72°C 30s，此后每個(gè)循環(huán)退火溫度均比前一個(gè)循環(huán)低0.5°C ;一般性擴(kuò)增15循環(huán)940C 15s，52。。15s，72。。30s ;延伸 72°C 20min ;最終保存 4°C ；
〈3>凝膠電泳將步驟〈2>的PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后銀染檢測(cè)。上述檢測(cè)方法中，F(xiàn)-primer是引物 PJ164L:CGTCGGTGAATCAGCAGC ；R-primer 是引物 PJ164R:GATAAGCGAGTGGGAAGTA。馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法的特異性引物對(duì)，該引物對(duì)為PJ164L/R，具有以下序列:引物PJ164L:CGTCGGTGAATCAGCAGC (見(jiàn) SEQ.1D.N0.1)；引物PJ164R:GATAAGCGAGTGGGAAGTA (見(jiàn) SEQ.1D.N0.2 )。本發(fā)明的關(guān)鍵在于松類簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)標(biāo)記引物，所用引物來(lái)自申請(qǐng)人從松屬EST序列中開(kāi)發(fā)出的EST-SSR引物。松屬EST序列來(lái)自dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)，將序列下載后利用GRAMENE網(wǎng)站提供的在線SSR鑒定軟件SSRIT (simple sequencerepeat iden-tif ication tool)進(jìn)行 SSR 檢索,對(duì)所檢索到的 EST-SSRs 序列進(jìn)行 PrimerPremier5軟件引物設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)出248對(duì)EST-SSR引物。隨機(jī)選擇馬尾松、濕地松各4個(gè)DNA樣品對(duì)248對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有60對(duì)引物擴(kuò)增出目的產(chǎn)物；再以馬尾松、濕地松各8個(gè)DNA樣品對(duì)初篩得到的83對(duì)引物進(jìn)行復(fù)篩，篩選出主帶清晰的特異性引物10對(duì)；最后，采用不同種源的馬尾松樣本31個(gè)、不同種源的濕地松樣本27個(gè)對(duì)10對(duì)特異性引物進(jìn)行第三次篩選鑒定，最終選擇了種間差異明顯種內(nèi)保守性最好的PJ164號(hào)引物對(duì)作為馬尾松與濕地松的種間特異性分子檢測(cè)鑒別引物。該引物EST序列的dbEST ID為69147425，共815個(gè)堿基。該引物在馬尾松中特異擴(kuò)增出303bp的產(chǎn)物，在濕地松中特異擴(kuò)增出325bp的產(chǎn)物?；诖耍l(fā)明人建立了本發(fā)明馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法，適用于馬尾松、濕地松及其種間雜交后代的快速可靠的分子檢測(cè)和`鑒定，對(duì)于雜交研究結(jié)果的鑒定具有重要的實(shí)用價(jià)值。與其他方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì):1.結(jié)果高度準(zhǔn)確可靠經(jīng)對(duì)不同種源的馬尾松與濕地松的DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果100%準(zhǔn)確，保證檢測(cè)結(jié)果高度的可靠性。2.操作簡(jiǎn)便快速本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)樣本進(jìn)行簡(jiǎn)單處理、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳后即可以判斷結(jié)果，無(wú)需對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程一般可在4個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。3.檢測(cè)結(jié)果靈敏度高本發(fā)明的檢測(cè)方法僅需提供待檢測(cè)樣品模板DNA20ng即可準(zhǔn)確鑒定其所屬種。4.取材方便、經(jīng)濟(jì)效益明顯針葉、冬芽、球花等組織或器官均可為實(shí)驗(yàn)材料，苗期、幼林期、成年大樹(shù)均可取樣，不受季節(jié)、地點(diǎn)限制。通過(guò)對(duì)松樹(shù)苗木進(jìn)行分子鑒定可以避免苗木生產(chǎn)與銷(xiāo)售過(guò)程中出現(xiàn)魚(yú)龍混雜的現(xiàn)象，也為松類種間雜交研究結(jié)果的檢驗(yàn)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)方法。


圖1是應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)27個(gè)濕地松基因組DNA樣本的PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中:M是DNA ladder, 1-27是27個(gè)不同種源濕地松個(gè)體DNA樣本。圖2是應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)31個(gè)馬尾松基因組DNA樣本的PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中:M是DNA ladder, 1-31是31個(gè)不同種源馬尾松個(gè)體DNA樣本。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1〈1>材料的采集采取濕地松或馬尾松的針葉，用冰袋保存(主要是防止葉片組織的降解及葉片的褐化)，用泡沫塑料箱子帶回，置于_70°C冰箱保存。<2>CTAB—娃珠法提取 DNA在IOml離心管(印pendorf管)中加入4ml CTAB提取液及80ul巰基乙醇，在65°C水浴鍋中預(yù)熱。取材料l_2g于研缽中，加入適量液氮迅速多次研磨成細(xì)粉狀，轉(zhuǎn)至預(yù)熱的CTAB提取液中，用封口膜將離心管封密以防止巰基乙醇揮發(fā)。放回水浴中保溫30分鐘，保溫過(guò)程中輕晃幾次，保持搖勻。取出Eppenedorf管。置于冰上迅速冷卻到室溫，加入等體積的4ml氯仿-異戊醇(24:1)，輕微混合均勻且充分，使其徹底地混合成乳狀液，然后4°C下離心12000rpml0min，輕輕將上清液吸取Iml于1.5ml離心管，放于_20°C冰箱中備用。<3>PCR 擴(kuò)增用上述樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序如下:PCR 反應(yīng)體系:共 IOii L，包括模板 DNA1.2 ii L、10XBufferl u L、2mM_dNTP0.2 y L、25mu-MgCl21.1 u L、r-Taq0.1 U L、F-primer0.25 u L、R-primer0.25 u L、ddH205.9 u L ；PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性9 4 °C 4min;梯度降溫?cái)U(kuò)增16循環(huán)，第一次94 °C 15s，60°C 15s，72°C 30s，此后每個(gè)循環(huán)退火溫度均比前一個(gè)循環(huán)低0.5°C ;一般性擴(kuò)增15循環(huán)940C 15s，52。。15s，72。。30s ;延伸 72°C 20min ;最終保存 4°C ；<4>聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE )將上述PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后銀染檢測(cè)，具體如下:1.涂膠將有耳玻片(耳朝下)泡于反硅化劑中，新液25分鐘，舊液30分鐘；涂無(wú)耳正面玻片硅化劑，均勻點(diǎn)四滴，輕而勻的沿一個(gè)方向涂三次，靜10分鐘。2.封膠將兩玻片對(duì)貼于橡膠框中，放平，用力擰死，夾住橡膠管；溶廢瓊脂膠，分吸2500-3000ul液膠加速沿玻片邊緣快速順下滴，將兩面玻片充分封死，防止漏膠；以水平底線面水平高于底為佳，靜止凝膠15分鐘。3.灌膠用長(zhǎng)細(xì)槍頭透開(kāi)加膠槍頭，從中間加入，等待2小時(shí)，待膠充分凝固。4.加樣5.跑膠6.撬玻片7.銀染取下帶膠玻璃板，用dd H2O沖兩次，每次2分鐘；用固定液固定10分鐘；用ddH20清洗兩次，每次2分鐘；加AgNO3溶液，銀染6到7分鐘；用ddH20清洗兩次，每次2分鐘；加入顯影液，靜候20到30分鐘至顯出圖像為止；用自來(lái)水沖洗，貼上順序標(biāo)簽；拍照近景端平，保持標(biāo)簽清晰。如圖1和圖2所述，應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)馬尾松和濕地松，引物對(duì)PJ164L/R在馬尾松中特異擴(kuò)增出303bp (見(jiàn)SEQ.1D.N0.3)的產(chǎn)物，在濕地松中特異擴(kuò)增出325bp (見(jiàn)SEQ.1D.N0.4)的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: 〈1>DNA提取 采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法提取樣品DNA ； <2>PCR擴(kuò)增 用步驟〈1>的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR 反應(yīng)體系:共 10 ii L，包括模板 DNA1.2 u LUOXBufferl u L、2mM_dNTP0.2 u L,25mu-MgCl21.1 u L> r-Taq0.1 u L> F-primer0.25 y L> R-primer0.25 y L> ddH205.9 u L ； PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94°C 4min ;梯度降溫?cái)U(kuò)增16循環(huán)，第一次94°C 15s, 60°C 15s，72°C 30s，此后每個(gè)循環(huán)退火溫度均比前一個(gè)循環(huán)低0.50C ;一般性擴(kuò)增15循環(huán)94°C 15s,52°C 15s，72。。30s ;延伸 72°C 20min ;最終保存 4°C ； <3>凝膠電泳 將步驟〈2>的PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后銀染檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬尾松和 濕地松快速分子檢測(cè)方法，其特征在于: 所述 F-primer 是引物 PJ164L:CGTCGGTGAATCAGCAGC ； 所述 R-primer 是引物 PJ164R:GATAAGCGAGTGGGAAGTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法的特異性引物對(duì)，其特征在于 該引物對(duì)為PJ164L/R，具有以下序列:引物 PJ164L:CGTCGGTGAATCAGCAGC ；引物 PJ164R:GATAAGCGAGTGGGAAGTA
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法及其特異性引物對(duì)，該引物對(duì)為PJ164L/R，具有序列表中SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的核苷酸序列，該引物在馬尾松中特異擴(kuò)增出303bp的產(chǎn)物，在濕地松中特異擴(kuò)增出325bp的產(chǎn)物。憑借該序列特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，建立了馬尾松和濕地松快速分子檢測(cè)方法，該法僅需進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)凝膠電泳即可直接根據(jù)產(chǎn)物的片段進(jìn)行判斷，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，適用于馬尾松、濕地松的快速可靠的分子檢測(cè)和鑒定，對(duì)將來(lái)濕馬雜交松苗木的鑒定具有重要的科研價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173546SQ20131007604
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者賈婕, 馮源恒, 楊章旗, 黃永利, 黃雪芬 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院