專利名稱：人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列及其克隆方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，更具體的是涉及一種從人少突膠質(zhì)瘤細胞分離的人內(nèi)源性博爾納樣核蛋白序列 I (endogenous Borna-1ike N element-1, EBLN-1)基因的 cDNA全長序列及其克隆方法。
背景技術：
博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)是1885年在德國首先發(fā)現(xiàn)的一種非節(jié)段單股負鏈RNA病毒，具有嚴格的嗜神經(jīng)性，其基因組編碼6個病毒蛋白，核蛋白(N)為主要的感染標志物和致病蛋白。1996年德國科學家從抑郁癥病人中成功分離出BDV，證明人體中亦存在BDV感染(Bode L, et al.Mol Psychiatry.1996)。近年來國內(nèi)外的大量流行病學調(diào)查研究均提示人類精神疾病包括抑郁癥的發(fā)生與BDV感染可能存在相關性，因此在2008年的國際博爾納病病毒研究會議上BDV作為“情感病毒”這一概念被提出。2010 年 I 月，日本科學家 Masayuki Horie, Tomoyuki Honda 在《Nature》發(fā)表文章，報道在包括人類、非人靈長類、嚙齒類和象類在內(nèi)的多種哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn)與博爾納病毒N基因(編碼核蛋白)相類似的片段，命名為內(nèi)源性博爾納樣核蛋白序列(endogenous Borna-1ike N Element, EBLN)。文章的作者推斷這可能是遠古時期,博爾納病病毒感染宿主后，其基因整合進入宿主的基因組，并被遺傳保留下來，成為宿主基因組中的病毒“化石”。(Horie，et al.Nature 2010)這是首個報道的存在于哺乳動物中的內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄病毒片斷，為人們理解內(nèi)源性病毒序列的形成和博爾納病病毒在宿主遺傳進化中的作用提供了新的視角。存在于人類基因組中的EBLN有四個，分別命名為EBLN-1、EBLN-2、EBLN-3、EBLN-4，其中EBLN-1ID L0C340900)與BDV N核苷酸序列相似性最高，為58%，而EBLN-2因存在移碼突變，開放讀碼框略短于EBLN-1。2010 年 7 月，Belyi 等(Belyi VA, et al.PLoS Pathog.2010)將非逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中的單鏈RNA病毒的5666個基因與48種脊椎動物基因組進行了比對，發(fā)現(xiàn)在19種脊椎動物基因組內(nèi)存在80個高保守性的內(nèi)源性病毒DNA序列，而且所有這些序列都限于單分子負鏈RNA病毒目下的兩個科:Bornaviruses and the Filoviruses。并且可能有如下機制:宿主對外源病毒致病性的抵御作用與EBLN的表達潛力有關聯(lián)，例如BDV的易感宿主馬、羊的基因組內(nèi)不存在EBLN。提示EBLN對外源性病毒感染存在抵抗效應，體現(xiàn)出對宿主的保護作用，從而降低宿主對BDV的易感性。亦有研究報道一種黑冠鼠具有可遺傳的天然對BDV的免疫力，此種特性與宿主內(nèi)一種未知基因有關(Herzog S，F(xiàn)rese K, Rott R, etal.J Gen Virol.1991 )，很有可能這種未知基因就是嚙齒類動物中的EBLN。從另一方面來說，EBLN-1為BDV整合入人類基因組的片斷，與BDV N基因有同源性，序列相似度58%，可能具有潛在相似的生物學特征，如果激活或高表達亦可能對人體產(chǎn)生有害作用而導致抑郁癥等精神疾病。因此，E BLN-1基因可能是抑郁癥的一個潛在易感基因，其編碼蛋白或參與抑郁癥的病理生理過程，對其進行深入系統(tǒng)的研究，對于進一步明確抑郁癥的分子遺傳學基礎和尋找藥物治療靶標有著重要意義。
對于新基因的常用研究策略主要包括新基因的生物信息學及體內(nèi)表達規(guī)律分析、功能獲得與功能失活策略研究、基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究等方面，而這些都有賴于該基因結(jié)構(gòu)模式的闡明，目前為止，EBLN-1基因的全長cDNA序列尚不清楚，嚴重滯后了對于EBLN-1的后續(xù)生理功能及病理作用研究?；诖?，本發(fā)明應用利用5’ -RACE和3’ -RACE技術克隆人EBLN-1基因全長cDNA序列，并對其開放讀碼框和非翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)以及編碼氨基酸進行了初步分析預測，為深入開展EBLN-1基因后續(xù)研究提供了重要基礎和客觀依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種通過5’ -RACE和3’ -RACE技術克隆得到EBLN-1基因cDNA全長序列，還提供了所述EBLN-1基因cDNA的克隆方法。本發(fā)明采用的技術方案是:給出一種人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列為SEQID N0.1。該核苷酸序列對應的氨基酸序列為SEQ ID N0.7。上述人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列的克隆方法，包括如下步驟:
(O從人少突膠質(zhì)瘤細胞株中提取總RNA。(2)3’末端序列的擴增:
以步驟(I)中的總RNA為模板，使用3’-RACE cDNA擴增試劑盒提供的3’RACE Adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA第一條鏈；
以cDNA第一條鏈為模板，利用3’ -外引物、3’ -RACE cDNA擴增試劑盒提供的3’ RACE外引物、3 ’ -內(nèi)引物和3 ’ -RACE cDNA擴增試劑盒提供的3 ’ RACE內(nèi)弓丨物進行套式PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物I，所述3’ -外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.2，3’-內(nèi)引物的核苷酸序列為 SEQ ID N0.3 ；
將PCR擴增產(chǎn)物I克隆入pMD19-T載體進行測序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列。(3)5’末端序列的擴增:
使用5’ -RACE cDNA擴增試劑盒對步驟(I)中的總RNA進行去磷酸化處理和“去帽子”反應，得到mRNA，所述mRNA的5’端連接5’-RACE cDNA擴增試劑盒提供的5’RACE Adaptor引物，然后進行反轉(zhuǎn)錄反應，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；
以所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用5’-外引物、5’末端序列的擴增5’RACE外引物、5’-內(nèi)弓I物和5 ’末端序列的擴增5 ’ RACE內(nèi)弓丨物進行套式PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物II，所述5，-外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4，5，-內(nèi)引物核的苷酸序列為SEQ ID N0.5 ；
將PCR擴增產(chǎn)物II克隆入pMD19-T載體進行測序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列。(4)根據(jù)所述人EBLN-1基因CDNA的3’末端序列和5’末端序列，以及公開的人EBLN-1基因cDNA的部分序列拼接得到人EBLN-1基因的cDNA全長序列。步驟(2)所述套式PCR擴增的擴增體系為:
3’第一輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:步驟(2)的反轉(zhuǎn)錄反應液2 μ ，IXcDNA稀釋緩沖液II 8 μ 1,10 μΜ的3’-外引物2 μ 1,10 μ M的3’ RACE外引物2μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II 4 μ 1,25 mM 的 MgCl2 3 μ 1,5 U/μ I 的 TaKaRa LA Taq 0.25μ I, dH20 28.75 μ I ;反應條件:94°C 3 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分鐘，20個循環(huán)；72 °C 10分鐘。3’第二輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:3’第一輪PCR產(chǎn)物I μ 1，dNTP 8μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II 5 μ 1,25 mM 的 MgCl2 5 μ 1,5 U/μ I 的 TaKaRa LA Taq 0.5μ 1,10 μΜ 的 3’-內(nèi)引物 2μ 1，10 μΜ 的 3' RACE 內(nèi)引物 2 μ 1，dH20 26.5 μ I ；
反應條件:94°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。步驟(3)所述套式PCR擴增的擴增體系為:
5’第一輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:步驟(3)的反轉(zhuǎn)錄反應液2 μ ，IXcDNA稀釋緩沖液II 8 μ 1，10μΜ的5’-外引物2 μ 1，10 μ M的5’RACE外引物2 μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II 4μ 1,25 mM 的 MgCl2 3μ 1,5 U/μ I 的 T aKaRa LA Taq 0.25 μ I,dH20 28.75 4 1;反應條件:941: 3 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分鐘，20 個循環(huán)；72°C 10分鐘；
5’第二輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:5’第一輪PCR產(chǎn)物I μ 1，dNTP 8 μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II 5μ 1,25 mM 的 MgCl2 5μ 1,5 U/μ I TaKaRa LA Taq 0.5μ I, 10μΜ 的 5’-內(nèi)引物 2 μ 1，10 μΜ 的 5' RACE 內(nèi)引物 2μ l，dH2 O 26.5μ I ;反應條件:94°C3分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，25個循環(huán)；72°C 10分鐘。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用3’RACE及5’RACE技術首次從人少突膠質(zhì)瘤細胞株中得到人EBLN-1基因的cDNA全 長序列，初步分析了其開放讀碼框和非翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)，并提供了由此推斷的氨基酸序列，可以為后續(xù)通過表達重組蛋白用于制備相應抗體或進行結(jié)構(gòu)生物學研究，通過RNA干擾和過表達研究EBLN-1基因功能，通過RT-PCR檢測該基因的組織表達分布情況，或進一步研究其非翻譯區(qū)在該基因表達調(diào)控中的作用，并最終為闡明所述EBLN-1基因在人體中的生理作用及與疾病尤其是精神疾病的關系奠定基礎。


圖1為3’端陽性克隆子的驗證電泳 圖2為5’端陽性克隆子的驗證電泳 圖3為人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列圖譜；
圖1和圖2中的M:DL2000Marker, 1-6:分別為調(diào)取的陽性克隆子。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應將此理解為本發(fā)明的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術思想情況下，根據(jù)本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一、人少突膠質(zhì)瘤細胞株中總RNA的提取
采用Trizol法對人少突膠質(zhì)瘤細胞株(購自美國ATCC細胞庫)進行細胞總RNA提取。取-80°C保存的細胞樣品，加I ml Trizol，劇烈振蕩30秒，確保完全溶解，室溫放置10分鐘，4度離心10分鐘。加入200ul氯仿,顛倒混勻15秒，12000rpm,4°C離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加入200ul氯仿和200ul水飽和酚，顛倒混勻15秒，12000rpm,4°C離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加入400ul氯仿顛倒混勻15秒，12000rpm,4°C離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加入等體積的異丙醇,充分混勻，冰上沉淀30分鐘。12000rpm，4°C離心15分鐘，棄上清留沉淀，使用預冷的70%乙醇洗滌，并除凈乙醇后超凈臺內(nèi)風吹干燥。RNA干燥物溶于50 ul DEPC水中，充分溶解后取1.5ul紫外檢測濃度和260/280值。根據(jù)濃度取lug RNA經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，完整性良好。二、3’末端序列的獲取
以前述所提取總RNA為模板，按3’ -RACE cDNA快速擴增試劑盒(3’Full RACE CoreSet,寶生物工程有限公司)操作說明使用3’RACE Adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應,合成cDNA第一條鏈。反應條件:42°C，60 min, 70°C，15 min。為提高靈敏度和特異度，采用套式PCR方法擴增EBLN-1基因的cDNA 3’末端。首先利用EBLN-1 cDNA的已知部分序列作為模板設計基因特異性引物，3’ -外引物:AGCAAAGCACAGATGATGACC (SEQ ID N0.2)和 3，-內(nèi)引物:CCGCTGTTGTGTTGGAGATT (SEQ IDN0.3),并與試劑盒中所提供的3’RACE外引物、3’RACE內(nèi)引物作為套式PCR反應用的引物。擴增反應以cDNA第一條鏈為模板。3’ RACE外引物和3’ RACE內(nèi)引物由3’-RACE cDNA快速擴增試劑盒提供。3’第一輪PCR反應體系50 μ 1:上述進行逆轉(zhuǎn)錄反應后的反轉(zhuǎn)錄反應液2 μ I,I XcDNA 稀釋緩沖液 II 8 μ 1，3’-外引物(10 μ Μ) 2 μ1，3’ RACE 外引物(10 μ Μ) 2μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II (Mg2+ Free) 4 μ 1，MgCl2 (25 mM) 3 μ I, TaKaRa LA Taq (5U/μ 1)0.25 μ LdH2O 28.75 μ I。反應條件:94°C 3 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°CI分鐘，20個循環(huán)；72 °C 10分鐘。3’第二輪PCR反應體系50 μ 1:第一輪PCR擴增產(chǎn)物I μ l，dNTP (含 A、G、C、T，各 2.5 mM)8 μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II (Mg2+ Free)5 μ IjMgCl2(25 mM) 5 μ I, TaKaRa LA Taq (5 U/μ 1)0.5 μ1，3，_ 內(nèi)引物(10 μΜ)2μ1，3' RACE內(nèi)引物(10 μΜ)2 μ LdH2O 26.5 μ I。反應條件:94°C 3 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I分鐘，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收目的條帶，按照pMD 19-T克隆載體操作說明書完成連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(DH10B)，經(jīng)氨芐青霉素抗性板篩選，菌落PCR鑒定(鑒定結(jié)果見圖1)，最后選擇有陽性片段的單克隆菌液測序，得到EBLN-1基因的cDNA 3’末端序列。三、5’末端序列的獲取
按5’-RACE cDNA擴增試劑盒(5’-Full RACE KU，寶生物工程有限公司)操作說明對前述所提取總RNA先后進行去磷酸化處理和“去帽子”反應，獲得mRNA。去磷酸化處理反應體系為 50 μ 1:提取的總 RNA 2μ I (I μ g/ μ I), RNase Inhibitor 1μ I (40U/ μ I),IOX堿性磷酸酶緩沖液(MgCl2 Free) 5 μ 1，堿性磷酸酶(16υ/μ I) 0.6 μ I,去酶水41.4μ 1，反應條件50°C lh，并對反應產(chǎn)物進行純化。“去帽子”反應體系10 μ 1:經(jīng)去磷酸化處理后的RNA 7μ I, RNA酶抑制劑(40U/μ I) I μ 1，IOX煙草酸焦磷酸緩沖液I μ 1，煙草酸焦磷酸(0.5U/μ I) 1μ 1，反應條件37°C，lh。

在mRNA的5’端連接5’ RACE Adaptor引物，其后進行反轉(zhuǎn)錄反應。利用EBLN-1cDNA的已知部分序列作為模板設計基因特異性引物5’ -外引物(SEQ ID N0.4)和5’ -內(nèi)引物(SEQ ID N0.5)，并與試劑盒中所提供的5’RACE外引物、5’RACE內(nèi)引物用于套式PCR反應。5’第一輪PCR反應體系50 μ 1:上述進行反轉(zhuǎn)錄反應后的反轉(zhuǎn)錄反應液2 μ I,IXcDNA 稀釋緩沖液 II 8 μ1，5’_ 外引物(10 μ Μ) 2 μ 1，5’ RACE 外引物(10 μ Μ) 2μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II (Mg2+ Free) 4 μ 1，MgCl2 (25 mM) 3 μ I, LA Taq (5 U/μ I)
0.25 μ 1，ClH2O 28.75 μ I。反應條件:94°C 3 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分鐘，20個循環(huán)；72°C 10分鐘。5’第二輪PCR反應體系50 μ I =Outer PCR產(chǎn)物I μ I, dNTP(含 A、G、C、T，各 2.5 mM)8 μ 1，10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)5 μ IjMgCl2 (25 mM)5 μ l，TaKaRa LA Taq (5 U/μ 1)0.5 μ1，5’_ 內(nèi)引物(10 μΜ)2μ1，5' RACE 內(nèi)引物(10μ Μ) 2 μ l,dH2 O 26.5 μ I。反應條件:94°C 3 分鐘；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分鐘，25個循環(huán)；72°C 10分鐘。PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收目的條帶，按照pMD 19-T克隆載體操作說明書完成連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(DHlOB)，經(jīng)氨芐青霉素抗性板篩選，菌落PCR鑒定(鑒定結(jié)果見圖2)，最后選擇有陽性片段的單克隆菌液測序，得到EBLN-1基因的cDNA 5’末端序列。四、cDNA全長序列及分析
采用DNAMAN軟件，根據(jù)所得到的人EBLN-1基因cDNA的3’端序列、5’端序列及已知的cDNA部分序列(GenBank id=NM_001199938.1)的重疊區(qū)域拼接出人EBLN-1基因的cDNA全長序列(SEQ ID N0.1)。并進行開放讀碼框分析，結(jié)果顯示第337-1437 bp位置為其開放讀碼框，其序列見SEQ ID N0.6，讀碼框上游的5’UTR (非翻譯區(qū))區(qū)域長336 bp，讀碼框下游的3’UTR區(qū)域長69 bp。EBLN-1基因cDNA序列圖譜見圖3。根據(jù)開放讀碼框推導的編碼EBLN-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。通過分析獲得了 EBLN-1基因的開放讀碼框和非翻譯區(qū)，對明確抑郁癥的分子遺傳學基礎和尋找藥物治療靶標有著重要意義。并根據(jù)開放讀碼框推導獲得氨基酸序列，可以利用該開放閱讀框的序列或者氨基酸序列，按照制備多克隆抗體或單克隆抗體的步驟制備抗EBLN-1的多克隆或單克隆抗體。也可以建立EBLN-1基因相應研究模型，通過RNA干擾和過表達進一步研究EBLN-1基因功能，或進一步研究其非翻譯區(qū)在該基因表達調(diào)控中的作用。
權利要求
1.一種人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列，其特征在于:該cDNA全長序列的核苷酸序列為 SEQ ID N0.1。
2.根據(jù)權利要求1所述人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列，其特征在于:所述核苷酸序列對應的氨基酸序列為SEQ ID N0.7。
3.一種權利要求1所述的人EBLN-1基因cDNA全長核苷酸序列的克隆方法，包括如下步驟: (1)從人少突膠質(zhì)瘤細胞株中提取總RNA； (2)3’末端序列的擴增: 以步驟(I)中的總RNA為模板，使用3’-RACE cDNA擴增試劑盒提供的3’RACE Adaptor引物進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA第一條鏈； 以cDNA第一條鏈為模板，利用3’ -外引物、3’ -RACE cDNA擴增試劑盒提供的3’ RACE外引物、3 ’ -內(nèi)引物和3 ’ -RACE cDNA擴增試劑盒提供的3 ’ RACE內(nèi)弓丨物進行套式PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物I，所述3’-外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.2，3’-內(nèi)引物的核苷酸序列為 SEQ ID N0.3 ； 將PCR擴增產(chǎn)物I克隆入pMD19-T載體進行測序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列； (3)5’末端序列的擴增: 使用5’ -RACE cDNA擴增試劑盒對步驟(I)中的總RNA進行去磷酸化處理和“去帽子”反應，得到mRNA，所述mRNA的5’端連接5’-RACE cDNA擴增試劑盒提供的5’RACE Adaptor引物，然后進行反轉(zhuǎn)錄反應，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； 以所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用5’ -外引物、5’ -RACE cDNA擴增試劑盒提供的5’ RACE外引物、5 ’ -內(nèi)引物和5 ’ -RACE cDNA擴增試劑盒提供的5 ’ RACE內(nèi)弓丨物進行套式PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物II，所述5’-外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4，5’-內(nèi)引物核的苷酸序列為 SEQ ID N0.5 ； 將PCR擴增產(chǎn)物II克隆入pMD19-T載體進行測序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列； (4)根據(jù)所述人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列和5’末端序列，以及公開的人EBLN-1基因cDNA的部分序列拼接得到人EBLN-1基因的cDNA全長序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的克隆方法，其特征在于:步驟(2)所述套式PCR擴增的擴增體系為: 3’第一輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:步驟(2)的反轉(zhuǎn)錄反應液2 μ ，IXcDNA稀釋緩沖液II 8 μ 1,10 μΜ的3’-外引物2 μ 1,10 μ M的3’ RACE外引物2μ 1，10XLA PCR 緩沖液II 4 μ 1,25 mM的 MgCl2 3 μ 1,5 U/μΙ 的TaKaRa LA Taq 0.25μ 1，dH20 28.75 μ I ； 反應條件:94°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，20個循環(huán)；72°C 10分鐘； 3’第二輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:3’第一輪PCR產(chǎn)物1μ l，dNTP 8 μ I,.10XLA PCR緩沖液 II 5 μ 1,25 mM 的 MgCl2 5 μ 1,5 U/μ I 的 TaKaRa LA Taq 0.5 μ I,.10 μΜ 的 3’ -內(nèi)引物 2 μ 1，10 μΜ 的 3’ RACE 內(nèi)引物 2 μ 1，dH20 26.5 μ I ；反應條件:94°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。
5.根據(jù)權利要求3所述的克隆方法，其特征在于:步驟(3)所述套式PCR擴增的擴增體系為: 5’第一輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:步驟(3)的反轉(zhuǎn)錄反應液2 μ ，IXcDNA稀釋緩沖液II 8 μ 1，10μΜ的5’-外引物2 μ 1，10 μ M的5’RACE外引物2 μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II 4μ 1,25 mM 的 MgCl2 3μ 1,5 U/μ I 的 T aKaRa LA Taq 0.25 μ I,dH20 28.75 μ I ； 反應條件:94°C 3分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，20個循環(huán)；72°C 10分鐘； 5’第二輪PCR反應體系50 μ I包括如下成分:5’第一輪PCR產(chǎn)物I μ 1，dNTP 8 μ 1，10XLA PCR 緩沖液 II 5μ 1,25 mM 的 MgCl2 5μ 1,5 U/μ I TaKaRa LA Taq 0.5μ I, 10μΜ 的 5’ -內(nèi)引物 2 μ 1，10 μΜ 的 5’ RACE 內(nèi)引物 2 μ 1，dH2 O 26.5 μ I ； 反應條件:94°C 3 分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，25個循環(huán)；72°C 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了人EBLN-1基因的cDNA全長序列及其克隆方法。本發(fā)明通過5’RACE和3’RACE技術分別擴增了人EBLN-1基因cDNA的5’端片段和3’端片段并測序，再根據(jù)3’端序列、5’端序列及已知cDNA部分序列拼接出人EBLN-1基因的cDNA全長序列。并進行開放讀碼框和非翻譯區(qū)分析，根據(jù)開放讀碼框推導得到編碼EBLN-1蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明提供的EBLN-1基因cDNA全長序列可以為后續(xù)通過表達重組蛋白用于制備相應抗體或進行結(jié)構(gòu)生物學研究，通過RNA干擾和過表達研究EBLN-1基因功能，或進一步研究其非翻譯區(qū)在該基因表達調(diào)控中的作用，并最終為闡明所述EBLN-1基因在人體中的生理作用及與疾病尤其是精神疾病的關系奠定基礎。
文檔編號C12N15/10GK103160514SQ20131007972
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權日2013年3月13日
發(fā)明者謝鵬, 張亮, 楊德雨, 雷陽, 黃榮忠 申請人:重慶醫(yī)科大學