專利名稱：一株章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株及其蛋白酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一株章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株及其蛋白酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國水域遼闊，魚類資源十分豐富，水產(chǎn)品加工的過程中，必然會產(chǎn)生大量的下腳料，這些廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、軟骨素、維生素等。如果不進行有效的處理，不僅會造成環(huán)境的污染，而且浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源。目前，這些廢棄物的利用僅限于加工成魚粉、飼料等低值制品，未能充分利用蛋白質(zhì)資源。隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)的高速發(fā)展，酶工程技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用也越來越廣泛。國內(nèi)外常用的蛋白酶主要是植物來源的蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等)，動物來源的蛋白酶(胃蛋白酶、胰·蛋白酶、糜蛋白酶等)和微生物產(chǎn)生的堿性蛋白酶。但是應(yīng)用于下腳料的酶解中的研究報道甚少。國內(nèi)有酶法水解烤鰻和羅非魚下腳料中的報道[1_2]。國外也已經(jīng)有報道對小沙丁魚和烏賊等下腳料的酶解報道，并指出酶解產(chǎn)物的生物活性，如抗氧化火性、抗菌活性、乳化作用等[3_5]。本發(fā)明以章魚為供試材料進行腸道產(chǎn)蛋白酶菌株的分離，其屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、八腕目(Octopoda)、章魚科(Octopodidae)、章魚屬(Octopus) [6]。廣泛分布于我國南、北沿岸海域。我國常見的種類有飯蛸(短蛸，0.0cellatus),長腕蛾(長蛾,0.variabilis)和真蛾(0.vulgaris)等。章魚對溫度的適應(yīng)范圍廣泛，屬于喜鹽動物，其食性廣泛，以肉食為主，尤其喜食蟹類、海蛞蝓和貝類，不同種之間存在著一定差異[7]。魚類腸道菌群是機體生長發(fā)育等生命活動的影響因素之一[8_9]。研究表明，腸道菌群是在與宿主共同進化過程中形成的正常組成部分，并且與消化、營養(yǎng)以及急慢性感染等有關(guān)[1°-12]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對魚類病原細菌分離鑒定研究較多，而對于魚類腸道細菌報道不太多，特別是章魚腸道細菌的分離鑒定研究，目前尚未見文獻報道。而且腸道細菌的研究主要是分離鑒定和產(chǎn)酶能力方面，針對下腳料上的應(yīng)用未見報道。國內(nèi)對魚類腸道中產(chǎn)蛋白酶細菌的研究報道主要是菌株的分離。許提森從健康鱸魚腸道中共篩選出18株產(chǎn)蛋白酶的益生菌，其中4株的產(chǎn)酶活力特別強[13]。王富強等從牙鲆魚腸道內(nèi)分離25株產(chǎn)蛋白酶菌株，其中Y2-2菌株對牙鲆幼魚生長有促進作用[14_15]。馮新忠等從額爾齊斯河野生丁(鐡)中分離40株產(chǎn)蛋白酶的菌株，其中8株蛋白水解圈較大[16]。另外國內(nèi)還有軍曹魚、九孔鮑、牡蠣、黃鱔、草魚、銀鯽魚等腸道中也分離了產(chǎn)蛋白酶菌株[17」1]。國外對內(nèi)臟蛋白酶的研究比較多，但專門研究內(nèi)生菌產(chǎn)的蛋白酶的研究并不多。Sudeepa從海產(chǎn)內(nèi)臟中分離得到了蛋白酶產(chǎn)生菌[22], Bhaskar進一步利用這種菌發(fā)酵產(chǎn)生堿性蛋白酶[23] ;IzVek0Va也研究了淡水鱈腸道中的共生微生物會產(chǎn)生蛋白酶，并可以幫助寄主消化[24]。Esakkiraj等鯔魚腸道中分離了產(chǎn)蛋白酶活性的蠟狀芽孢桿菌，該菌產(chǎn)生的蛋白酶的最佳pH為7.0，最佳溫度為60°C，為下腳料的精加工及去污劑工業(yè)上的應(yīng)用可能性提供了科學(xué)依據(jù)[25]。Izvekova等從梭子魚中分離蛋白酶活性的5株菌株[26]。參考文獻[I]黃志勇，賴海濤，許偉雄，等.酶法提取烤鰻下腳料中水解動物蛋白的研究.食品科學(xué)，2002, 23 (10): 76-78.
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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以章魚為供試材料，從其腸道中進行產(chǎn)蛋白酶菌株的分離。通過酪蛋白培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)生的透明圈(圖1)，篩選出具產(chǎn)酶能力菌株L-2。提取的該菌株基因組DNA經(jīng)1%和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增后，經(jīng)檢測產(chǎn)物均在1500bp左右，條帶清晰，無雜帶，可用于菌株16S rDNA序列的測定(圖2)。測序結(jié)果在NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫上通過Blast進行序列比對,為交替假單胞菌(Pseudoalteromonasokeanokoites)。章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株，交替假單胞菌菌株L-2，保藏編號CGMCCN0.6638。所述的章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵蛋白酶在洗滌劑中的應(yīng)用。蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶，可以在機體內(nèi)自然產(chǎn)生，主要存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實、微生物細胞等。蛋白酶種類繁多，商品蛋白酶不下100種。不同來源的蛋白酶在工業(yè)上有不同的用途。蛋白酶已廣泛使用在皮革、毛紡、絲綢、日化、食品、釀造、醫(yī)藥等許多行業(yè)中。在食品工業(yè)中利用蛋白酶制劑，可以避免酸水解、堿水解對氨基酸的破壞作用及變旋，保證蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不受影響。


圖1為L-2菌的酪蛋白透明圈；圖2為16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物； 圖3為蛋白酶的SDS-PAGE電泳；
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。I)微生物本身以章魚為供試材料，從其腸道中進行產(chǎn)蛋白酶菌株的分離。通過酪蛋白培養(yǎng)基對菌株進行培養(yǎng)，觀察其產(chǎn)生的透明圈(圖1)，篩選出具產(chǎn)酶能力菌株L-2。提取的該菌株基因組DNA經(jīng)1%和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增后，經(jīng)檢測產(chǎn)物均在1500bp左右，條帶清晰，無雜帶，可用于菌株16S rDNA序列的測定(圖2)。測序結(jié)果在NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫上通過Blast進行序列比對，為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas okeanokoites)。交替假單胞菌(Pseudoalteromonasokeanokoites)菌株 L-2 已經(jīng)于 2012 年 9月28日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCC N0.6638，分類命名為Pseudoalteromonasokeanokoites)。2)微生物的培養(yǎng)方法或繁殖方法本發(fā)明通過平板劃線分離法從章魚胃腸道中篩選獲得一株高產(chǎn)酶活力菌株交替假單胞菌(Pseudoalteromonas okeanokoites)菌株L-2。并通過單因素實驗對該菌株進行搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定了適于該菌最佳產(chǎn)酶條件的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。(I)培養(yǎng)基的組成與配制:蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，磷酸高鐵0.01%，淀粉0.5%，ρΗ7.6 7.8，海水配制。(2)發(fā)酵步驟:取3-4環(huán)菌種，接于發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵24h，制備種子液，以4%的接種量，發(fā)酵溫度為19°C，pH7.0，轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時間84h，酶活力最高達1250U/mL。3.發(fā)酵產(chǎn)物如圖3所示，該菌株產(chǎn)的蛋白酶在SDS-PAGE電泳上顯示有4條亮帶，條帶較寬，說明至少有4種蛋白酶，分子量范圍30.1 144.9kDa。4.微生物發(fā)酵產(chǎn)物的用途洗滌劑中的應(yīng)用試驗在洗滌劑中加入蛋白酶能使衣服等上的血跡、汗跡、奶跡等含蛋白質(zhì)等之類的污垢分解成可溶性氨基酸等小分子物質(zhì)，使不溶物變?yōu)榭扇堋３Ｓ玫拿钢苿┦菈A性蛋白酶。本實驗為P.0keanokoites L2蛋白酶在洗漆劑中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。4.1、抗氧化性
取300 μ I的發(fā)酵產(chǎn)物樣品與300 μ I濃度為1%、5%、10%、15%的H2O2在40°C下分別處理15min、45min、75min取樣測活性。結(jié)果如表I。當(dāng)濃度為5%的H2O2處理15min后，P.0keanokoites L2蛋白酶的活性保持86.01%,處理75min后保持57.16%,甚至15%的H2O2處理15min后還能保持45.58%的活性。P.0keanokoites L2蛋白酶對常用漂白劑H2O2的穩(wěn)定性特點說明此酶應(yīng)用在蛋白酶工程的可能性。表I H2O2濃度對P.0keanokoites L2蛋白酶活性影響
權(quán)利要求
1.章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株，交替假單胞菌菌株L-2，保藏編號CGMCCN0.6638。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵蛋白酶在洗滌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株章魚腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶菌株及其蛋白酶的應(yīng)用，保藏編號CGMCC No.6638。蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶，可以在機體內(nèi)自然產(chǎn)生，主要存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實、微生物細胞等。蛋白酶種類繁多，商品蛋白酶不下100種。不同來源的蛋白酶在工業(yè)上有不同的用途。蛋白酶已廣泛使用在皮革、毛紡、絲綢、日化、食品、釀造、醫(yī)藥等許多行業(yè)中。在食品工業(yè)中利用蛋白酶制劑，可以避免酸水解、堿水解對氨基酸的破壞作用及變旋，保證蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不受影響。
文檔編號C12R1/38GK103146612SQ20131008079
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者金玉蘭, 樸美子, 曲田麗, 王玉榮 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)