專利名稱：用于促進(jìn)油菜生長的促生菌及其微生物有機(jī)肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)油菜生長的促生菌株及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
油菜是我國重要的油料作物，在國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)中占有重要的地位。促進(jìn)油菜生長，提高油菜產(chǎn)量始終是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的重要話題。在油菜種植過程中，由于長期大量的化肥投入，破壞了油菜生長的土壤環(huán)境，土壤生物活性嚴(yán)重下降，土壤有益微生物種類減少、數(shù)量逐減，導(dǎo)致油菜產(chǎn)量連年下降。因此，開發(fā)促進(jìn)油菜生長的新型肥料，對于油料作物的生產(chǎn)
至關(guān)重要。我國作物秸桿就地焚燒、規(guī)?；B(yǎng)殖后的畜禽糞便隨地棄置等不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，也極大地浪費(fèi)了能作為有機(jī)肥和生物有機(jī)肥產(chǎn)品的原料；大量的養(yǎng)分資源流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，明顯地削弱了我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力。如何將從土壤中因作物收獲而帶走的營養(yǎng)元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機(jī)廢棄物制成商品有機(jī)肥料再施入土壤。如果將這些固體有機(jī)廢棄物高溫發(fā)酵制備成腐熟堆肥，再將其用作制備生物(含特定有益微生物)有機(jī)肥料的載體將會有很好的應(yīng)用前景。生物有機(jī)肥是指特定功能微生物與主要以動植物殘體(如農(nóng)作物秸桿、畜禽糞便等)為來源并經(jīng)無害化處理、腐熟的有機(jī)物料復(fù)合而成的一類兼具微生物肥料和有機(jī)肥效應(yīng)的肥料。其本質(zhì)特征是含有特定功能的、表現(xiàn)出一定肥料效應(yīng)的有益微生物，這些特定有益微生物的生命活動是生物有機(jī)肥優(yōu)于其它肥料的關(guān)鍵因素。大量研究表明:農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物有機(jī)肥在增強(qiáng)作物抗逆性、提供作物養(yǎng)分、增加肥效、改善作物對養(yǎng)分的吸收、調(diào)節(jié)土壤酸堿度等方面發(fā)揮著積極的作用。本研究擬從油菜長期生長的田塊中生長健康的油菜植株根系 及根際土壤(冬季，土壤溫度在零度左右)中篩選促生菌株，再與腐熟堆肥和其他合適載體采用合適的工藝生產(chǎn)促進(jìn)油菜生長微生物有機(jī)肥料，為油菜規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
1.技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供用于促進(jìn)油菜生長的促生菌及其微生物有機(jī)肥料，促生功能明顯，能確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案用于促進(jìn)油菜生長的促生菌NJZJSB3，均屬解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens), 2012年12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，NJZJB3的菌種保藏號為CGMCC N0.6966。NJZJSB3菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞為桿狀，端生芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶陽性、氧化酶陰性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗陰性，發(fā)酵葡萄糖、果糖、纖維二糖、蔗糖、糊精、半乳糖、甘露醇、木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵山梨醇，可以利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。用上述促進(jìn)油菜生長的促生菌所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，該微生物有機(jī)肥料中含有l(wèi)X108cfu/g以上的NJZJSB3、全氮含量質(zhì)量比為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量質(zhì)量比不低于45%。所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其特征為:(I)將權(quán)利要求1所述的促生菌NJZJSB3，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)液為NA培養(yǎng)基，pH6.0 7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量> lX1010cfu/ml ;所用NA培養(yǎng)液配制方法為(以配制IL培養(yǎng)基為例):葡萄糖IOg,蛋白胨5g,牛肉膏3g,酵母粉0.5g,定容至1000ml, pH 值調(diào)至 7.2-7.4，115°C滅菌 30min。(2)將腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物酶解混合物按質(zhì)量比6: 4的比例混合均勻。再將上述NJZJSB3發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞和菜柏微生物酶解混合物的6: 4的混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆I次，溫度不超過50°C，發(fā)酵7天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJZJSB3含量達(dá)到I X 108cfu/g以上，獲得促生菌NJZJSB3的豬糞堆肥和菜柏微生物酶解混合物的固體混合菌劑。最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進(jìn)油菜植株生長的微生物有機(jī)肥。其中，所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 45%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2.0%，含水量質(zhì)量比25-30% ；菜柏的微生物酶解混合物制備方法為，將保藏號為CGMCC N0.1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5.0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物酶解混合物；所用腐熟后的雞糞堆肥其發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量彡45%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為2-3%，含水量為25-30%。3.有益效果本發(fā)明與目前市場上的有機(jī)肥料產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點:I)該肥料產(chǎn)品中含有促進(jìn)油菜生長的專一性高效菌株NJZJSB3，其促生效果非常顯著。試驗結(jié)果表明，油菜生長促生率達(dá)到114.7 % 154.6 %，如果連年這樣施用，可以有效提高油菜的產(chǎn)量。2)該肥料為有機(jī)肥，含有豐富的有機(jī)質(zhì)(30 35%)，有機(jī)氮含量為4%，而且大部分為氨基酸和小分子多肽。本產(chǎn)品總磷含量為4.0%，而且生物有效性特別高，使用本產(chǎn)品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。3)由于是生物菌株制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬菜的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)肥料的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于農(nóng)產(chǎn)品的出口。同時，該微生物肥料還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。

4)該微生物有機(jī)肥可以在營養(yǎng)缽使用，也可以在大田使用，不僅具有有機(jī)肥的功能，而且其中所含的促生菌通過多種促生機(jī)制起作用，從而達(dá)到促進(jìn)油菜生長的效果。
四

圖1復(fù)篩NJZJSB3對油菜苗生長的影響(注:CK:單施化肥；0F 為B3中的有機(jī)肥-豬糞堆肥與菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:為含有NJZJSB3的生物有機(jī)肥)圖2含促生菌NJZJSB3的生物有機(jī)肥對油菜幼苗生長的影響(注:CK:單施化肥；0F 為B3中的有機(jī)肥-豬糞堆肥與菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:為含有NJZJSB3的生物有機(jī)肥)圖3促生菌株NJZJSB3的形態(tài)特征生物保藏菌株NJZJSB3,為解淀粉芽抱桿菌屬(Bacillus amyloliquefaciens), 2012 年 12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中國科學(xué)院微生物研究所，NJZJB3的菌種保藏號為=CGMCC N0.6966。
五具體實施例方式(一 )促生菌株的分離促生菌株的初篩:采集紫金山森林土壤十字花科植物根際土壤，80°C水浴30min，采用稀釋涂布技術(shù)初篩芽孢桿菌， 初篩共獲得5株促生菌株，將菌種凍干_20°C保存，用于進(jìn)一步篩選。促生菌株的復(fù)篩:取初篩后的促生菌，在NA液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后，8000rpm/min離心，等量無菌水重懸，獲得彡I X 1010cfu/ml菌懸液，一半菌懸液121°C滅活20min。將長勢相當(dāng)?shù)挠筒俗鋈缦绿幚?處理1:苗根系部分在清水中浸泡IOmin ;處理2:苗根系部分在121°C滅活20min菌懸液中浸泡IOmin ;處理3:苗根系部分在正常菌懸液中浸泡lOmin。將經(jīng)過處理的油菜苗分別種到裝有300g滅菌土壤的營養(yǎng)缽中，觀察測試促生菌對油菜幼苗生長情況的影響。最終篩選得到菌株NJZJSB3，NJZJSB3菌株的促生效果圖1。( 二)促生菌株的鑒定促生菌株NJZJSB3鑒定為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillus amyloliquefaciens)。NJZJSB3菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞為桿狀，端生芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗陰性，發(fā)酵葡萄糖、果糖、纖維二糖、蔗糖、糊精、半乳糖、甘露醇、木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵山梨醇，可以利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。(三)茵劑生產(chǎn)(I)將促生菌株NJZJSB3，接種到NA培養(yǎng)液中進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:pH6.0 7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量彡lX1010cfu/mL.
(2)將NJZJSB3發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物分解混合物按質(zhì)量比6: 4混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆I次，溫度不超過500C，發(fā)酵7天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJZJSB3含量均達(dá)到I X 108cfu/g以上，獲得含促生菌株NJZJSB3的豬糞堆肥和經(jīng)微生物分解過的菜柏堆肥混合物的固體菌劑。最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進(jìn)油菜生長的微生物有機(jī)肥。所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)含量> 45%，有機(jī)氮含量為 1.2-2.0 %，含水量 25-30 %。該微生物有機(jī)肥料(促進(jìn)油菜生長的專用微生物有機(jī)肥)中含有I X IO8個/g以上的NJZJSB3、全氮含量質(zhì)量比為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量質(zhì)量比不低于45%。其中經(jīng)微生物分解過的菜柏堆肥的制備方法為(公知公用，見發(fā)明專利ZL200610086126.0，一種農(nóng)用氨基酸的生物制取方法及其肥料產(chǎn)品)，菌株37_1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C (共5天)，固體發(fā)酵開始后，堆物的PH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65 %和6.0-7.0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5.0左右，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)一菜柏堆肥。(四)盆栽促生試驗試驗設(shè)3個處理:CK:化肥對照，未施用有機(jī)肥或微生物有機(jī)肥；0F:為B3中的有機(jī)肥-豬糞堆肥與菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:施用含促生菌NJZJSB3的微生物有機(jī)肥。微生物有機(jī)肥料用量:油菜育苗時按土重的2%施用(育苗時所用的土壤均為健康土壤)，待油菜長至第2片真葉時將其移栽到油菜連作土壤中，油菜苗移栽前，連作土壤中微生物有機(jī)肥料用量也按土重I %的用量施入。所有處理的氮磷鉀用量一致，常規(guī)管理。20天之后觀察其生長情 況，確認(rèn)促生菌株是否有促進(jìn)油菜生長的效果。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著油菜生長時間的延長，施用含促生菌NJZJSB3的微生物有機(jī)肥處理(B3)，其長勢遠(yuǎn)好于施用化肥(CK)和有機(jī)肥(OF)的油菜苗(表1、圖1、圖2、)。與CK比較，施用含有NJZJSB3促生菌的微生物有機(jī)肥后，油菜地上部、地下部及整株鮮重分別重17.64g/株、2.42g/株和20.06g/株，地上部、地下部及單株的促生率分別為154.6%、114.7%和148.4%。與OF比較，施用含有NJZJSB3促生菌的微生物有機(jī)肥后，油菜地上部、地下部和整株鮮重分別重12.65g/株1.95g/株和14.60g/株，地上部、地下部和整株的促生率分別為77.1%、75.6%和76.9%。表I施用含NJZJSB3促生菌株的微生物有機(jī)肥對油菜地上部生長的影響
處理地上部鮮重(g/株)地下部鮮重(g/株)總鮮重(g/株)
CK 11.41+1.59 b 2.11+0.62 b 13.52+2.16 b OF 16.40+2.37 b 2.58+0.92 ab 18.98+3.32 b B3_29.05+2.12 a_4.53+0.65 a_33.58+2.06a注:CK:單施化肥；0F:為B3中的有機(jī)肥-豬糞堆肥與菜柏堆肥按一定比例混合的混合物；B3:為含有NJZJSB3的生物有機(jī)肥)
本發(fā)明專利從促進(jìn)油菜幼苗生長這一關(guān)鍵問題著手(表1、圖1、圖2)，研制出一種能顯著促進(jìn)油菜生長的微生物有機(jī)肥料產(chǎn)品，與單施化肥(CK)比較，促生率分別達(dá)154.6% (地上部)、114.7% (地下部)和148.4% (單株)。本肥料產(chǎn)品的作用機(jī)制在于本肥料產(chǎn)品中的有效碳和有效氮源給產(chǎn)品中的功能菌微生物區(qū)系的培育提供了很好的條件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生態(tài)及其食物鏈；另一方面，本肥料產(chǎn)品中含有較高含量的有機(jī)氮和有機(jī)磷，這些營養(yǎng)物質(zhì)對油菜的生長十分有利，大大提高了油菜作物的立苗率和抗逆能力。
權(quán)利要求
1.用于促進(jìn)油菜生長的促生菌，該菌株NJZJSB3，為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillusamyloliquefaciens), 2012年12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，NJZJB3的菌種保藏號為:CGMCC N0.6966。
NJZJSB3菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞為桿狀，端生芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗陰性，發(fā)酵葡萄糖、果糖、纖維二糖、蔗糖、糊精、半乳糖、甘露醇、木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵山梨醇，可以利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。
2.用權(quán)利要求1所述用于促進(jìn)油菜生長的促生菌所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，該微生物有機(jī)肥料中含有l(wèi)X108cfu/g以上的NJZJSB3、全氮含量質(zhì)量比為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮,總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量質(zhì)量比不低于45%。
3.權(quán)利要求2所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其特征為: (1)將權(quán)利要求1所述的拮抗菌NJZJSB3，分別接種到NA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:pH6.0 7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35 °C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量> lX1010cfu/ml ;所用NA培養(yǎng)液配制方法為，葡萄糖10g，蛋白 胨5g，牛肉膏3g，酵母粉0.5g，定容至1000ml, pH值調(diào)至7.2-7.4，115°C滅菌 30min ； (2)將腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物酶解混合物按質(zhì)量比6: 4的比例混合均勻。再將上述NJZJSB3發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞和菜柏微生物酶解混合物的6: 4的混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆I次，溫度不超過50°C，發(fā)酵7天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJZJSB3含量達(dá)到I X 108cfu/g以上，獲得促生菌NJZJSB3的豬糞堆肥和菜柏微生物酶解混合物的固體混合菌劑。最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進(jìn)油菜植株生長的微生物有機(jī)肥；其中 所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 45%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2.0%，含水量質(zhì)量比25-30% ； 菜柏的微生物酶解混合物制備方法為，將保藏號為CGMCC N0.1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5.0,再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物酶解混合物；所用腐熟后的雞糞堆肥其發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量^ 45%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為2-3%，含水量為25-30%。
4.權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于油菜生長的促生菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離到了一株拮抗菌NJZJSB3，接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕的微生物分解混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵制成微生物有機(jī)肥料，肥料中含有1×108cfu/g以上的促生菌、全氮含量為4～5％(90％以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～10％、有機(jī)質(zhì)含量不低于45％。試驗結(jié)果表明，油菜的地上部、地下部和整株鮮重增重分別達(dá)到154.6％、114.7％和148.4％，如果連年這樣施用，可以有效地促進(jìn)油菜生長。
文檔編號C12R1/07GK103173387SQ20131008109
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者沈其榮, 黃啟為, 吳云成, 凌寧 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)