人源化小鼠模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人源化小鼠模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用，具體涉及人源Nbs1c.657del5基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用，包括構(gòu)建人源Nbs1基因中含5bp缺失突變的BAC載體，原核顯微注射，篩選獲得高表達(dá)和低表達(dá)人源Nbs1基因的3個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠在其中一個(gè)系中以一定比例出現(xiàn)了發(fā)育延遲、體長均勻縮短、骨發(fā)育異常的表型，為奈梅亨破碎綜合癥疾病建立了新的小鼠模型。同時(shí)，由于Nbs1基因功能損傷與癌癥密切相關(guān)，因此該轉(zhuǎn)基因模型可應(yīng)用于藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)中的短期致癌實(shí)驗(yàn)，為傳統(tǒng)的兩年期致癌實(shí)驗(yàn)提供了有潛力的替代模型，也為癌癥發(fā)生機(jī)理的研究提供了有效的工具。
【專利說明】人源化小鼠模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，具體涉及一種在不同發(fā)育階段和器官中較高水平表達(dá)NBSlpro的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，以及該動(dòng)物模型以及由其衍生的胚胎、細(xì)胞、組織和器官在藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)、致癌物篩選及治療NBS (奈梅亨破碎綜合癥)藥物篩選中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]DNA修復(fù)系統(tǒng)和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)系統(tǒng)與基因組的穩(wěn)定性直接相關(guān)。若細(xì)胞無法正常發(fā)揮DNA雙鏈斷裂修復(fù)功能(同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù))，會(huì)導(dǎo)致染色體重排和突變積累，進(jìn)而激活細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，抑制生長。但若作為最后的檢測(cè)，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)阻止功能也同時(shí)受損，才使細(xì)胞更容易惡性增殖和組織癌變，如奈梅亨破碎綜合癥(K.K.Khanna 等，2001，Nature, 27:247-254 ;Μ.0，Driscoll 等，2006，Nature ReviewsGenetics, 7:45-54)。
[0003]95%的奈梅亨破碎綜合征病人為Nbslc.657del5突變的純合子(缺失cDNA657_661位點(diǎn)5nt，屬常染色體隱性遺傳)。攜帶Nbslc.657del5突變的雜合子人群與正常人群相比也表現(xiàn)出癌癥發(fā)生機(jī)率的顯著性提高(E.Seemanovdi等，2007，J Natl CancerInst.，99:1875-1880 ；E.Seemanova 等，2006，Cas LekCesk.，145:138-143)，因此研究人員推斷:與經(jīng)典“two- hit”腫瘤發(fā)生模型中的腫瘤抑制基因不同，Nbsl屬于單倍不足腫瘤抑制基因群，腫瘤的發(fā)生僅僅取決于基因劑量的下降程度(M.Santarosa等，2004, B1chimB1phys Acta, 1654:105-122)。該疾病的主要癥狀可概括如下:傾向在青年時(shí)期患淋巴癌、血液系統(tǒng)或固態(tài)惡性腫瘤(C.Cybulski 等,2004, Cancer Research, 64:1215-1219 ；J.P.Ehlers 等，2005，Cl in Cancer Res., 11:1849-1853 ；B.Gorski等，2003，Internat1nal Journal of Cancer., 106:379-381 ；J.Steffen 等，2004，Int.J.Cancer.，111:67-71 ；H.Tauchi 等，2002，Oncogene.，21:8967-8980)，成長緩慢，體長均勻縮短，頭小畸形，面部特征異常，骨發(fā)育異常，染色體不穩(wěn)定，免疫系統(tǒng)缺陷，易反復(fù)感染，腦發(fā)育異常，皮膚異常(K.H.Chrzanowska 等，2012，Orphanet Journal of RareDiseases, 7:1-19 ；K.Szczaluba等，2012，Journal of Applied Genetics, 53:189-191)，女性卵巢發(fā)育障礙(1.v.d.Burgt 等,1996, J Med Genet., 33:153-156 ;Κ.H.Chrzanowska等，2010，J Clin Endocrinol Metab.，95:3133-3140)、男性第二性征發(fā)育推遲(http://www.emedicine.com/ derm/ topic725.htm)。奈梅亨破碎綜合征病人的細(xì)胞具有如下顯著特點(diǎn):intra-S期、G1到S期、G2期到M期的檢測(cè)功能缺陷，即在離子射線或類福射藥物(如bleomycin)處理后，無法停止DNA的合成和阻止細(xì)胞進(jìn)入S期(或M期)。導(dǎo)致這些病人對(duì)直接或間接引起DNA雙鏈斷裂的所有致變劑敏感(1.Demuth等，2007，Oncogene, 26:7792-7798)。
[0004]Nbsl與Mrell、Rad50相互結(jié)合形成的MRN復(fù)合物是DNA的同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)系統(tǒng)中雙鏈斷裂的識(shí)別和啟始元件，并參與信號(hào)傳導(dǎo)和修復(fù)(R.S.Williams等，2009，Cell., 139:87-99)。此外，NbsI在細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和端粒穩(wěn)定性維持系統(tǒng)中也發(fā)揮了重要的功能(S.E.R.P.，2009，GENES&DEVELOPMENT.，23:171-180 ；Y.L.ErinR.P.Shull, Hironobu Nakane, 2009, Genes Dev, 23:171-180 ;Β.J.Lamarche 等,2010, FEBSLetters.,584:3682-3695)。
[0005]Nbsl蛋白由N-端的FHA結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)相鄰的BRCT結(jié)構(gòu)域(BRCT1、BRCT2)(J.Lloyd等，2009，Cell.，139:100-111)，和C-端的Mre11結(jié)合結(jié)構(gòu)域及ATM結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。FHA-BRCT1-BRCT2協(xié)助MdcI和CtpI綁定在DSB位置，進(jìn)行同源重組修復(fù)(R.S.Wi Iliams等，2009, Cell.，139:87-99);該結(jié)構(gòu)域還介導(dǎo)與ATR的相互作用，其缺失不僅抑制正常的同源重組修復(fù)，也會(huì)使S期檢測(cè)點(diǎn)的功能受損(E.0lson等，2007, Journal of B1logicalChemistry.，282:22939-22952)。T細(xì)胞、卵母細(xì)胞的發(fā)育或其它體內(nèi)或外界壓力造成DNA雙鏈斷裂引起的G2/M、S期檢測(cè)點(diǎn)停滯均依賴于N-端FHA結(jié)構(gòu)域的功能，而非ATM的磷酸化激活和 C-端區(qū)域的功能(S.Difilippanton1 等，2007，Journal of ExperimentalMedicine.，204:1003-1011)。
[0006]Nbsl的c.657del5突變導(dǎo)致表達(dá):N端26KD蛋白片段(包括FHA-BRCT1，不能與其它蛋白相互作用)和翻譯起始位點(diǎn)移位的70KD片段(有完整的MrelUATM的結(jié)合基序)(R.S.Maser 等，2001，Nature Genetics.，27:417-421)。這種不連續(xù)導(dǎo)致FHA-BRCT1-BRCT2介導(dǎo)的相互作用與Mre 11、ATM間的相互作用隔離(R.S.Wi 11 iams等，2009，Cell.，139:87-99)。而且使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定和豐度降低，導(dǎo)致NBS病人具有離子射線敏感性和易發(fā)癌癥(L.Kruger 等，2007，Carcinogenesis., 28:107-111 ；R.S.Maser 等,2001, Nature Genetics., 27:417-421)。已有體內(nèi)數(shù)據(jù)表明:hNbslp70 可以與mMre 11、mRad50 (鼠源Mre 11和Rad50 )形成部分功能損傷的MRN復(fù)合物，對(duì)ATM及ATM下游信號(hào)通路的激活有一定程度的影響(S.Difilippanton1等，2005, Nature CellB1logy., 7:675-685) 。
[0007]已有體內(nèi)外數(shù)據(jù)表明:Nbsl過表達(dá)或單倍不足均與腫瘤的發(fā)生率聯(lián)系緊密。40-52%的晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌和食管癌病人被檢測(cè)出NBSl呈過表達(dá)狀態(tài)。Nbsl雜合子敲除小鼠模型(Nbsl+/_)與野生型小鼠相比，腫瘤的自發(fā)率和Y-輻射誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生率都顯著性提高(V.Dumon-Jones等，2003, Cancer Res, 63:7263-7269)。與對(duì)照組相比，NBSl過表達(dá)細(xì)胞系的克隆形成能力、遷移和入侵活性及惡性轉(zhuǎn)化能力都顯著性上升(Y.-C.Chen 等，2005，Journal of B1logical Chemistry, 280:32505-32511 ；C._Υ.Wu等，2011，Journal of B1medical Science, 18:1-6 ;M._H.Yang等，2006，ClinicalCancer Research, 12:507-515)。
[0008]比較已有的NBS疾病模型發(fā)現(xiàn)，雖暗示了 NBS細(xì)胞具有惡性增殖的傾向，但在人源化地模擬因Nbsl的突變(c.657del5)，導(dǎo)致腫瘤易發(fā)方面還有改進(jìn)的空間(如模型不育、未用致癌劑誘導(dǎo)等)。
[0009]致癌性實(shí)驗(yàn)是藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)中的重要內(nèi)容，是為評(píng)價(jià)人體長期用藥的致癌風(fēng)險(xiǎn)，以考察藥物對(duì)動(dòng)物的潛在致癌作用為主進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究(宋征等，2010，中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志.，6:557-561)。1997年，ICH的SlB發(fā)布了可采用遺傳修飾小鼠模型作為臨床前致癌性評(píng)價(jià)中大鼠長期致癌性實(shí)驗(yàn)附加試驗(yàn)的指導(dǎo)原則(Testing for carcinogenicity of pharmaceuticals[S], 1997, CurrentStep4versonl-7)。通過將致癌基因或抑癌基因轉(zhuǎn)入(或敲除)而建立的5種遺傳修飾小鼠模型(包括 CB6F「Tg RasH2、Tg.AC、C57BL/6 (N5) -Trp53+/\ Xpav' Xpa+/P53+/0 雖然有實(shí)驗(yàn)周期僅需24-26周、假陽性和假陰性的發(fā)生率較低等優(yōu)點(diǎn)，但它們也普遍存在對(duì)基因毒性和非基因毒性致癌物的反應(yīng)不一致、對(duì)鼠類致癌劑而非人類致癌劑區(qū)分界限不明顯等缺陷(E.M.Agency, 2004, Evaluat1n of Medicines for Human Use, CPMP/SWP/2592/02Revl:1-12 ；J.MacDonald 等，2004，Toxicological Sciences.，77:188-194 ；J.B.Pritchard 等，2003，Environmental Health Perspectives, 111:444-454)。我國在利用遺傳修飾動(dòng)物進(jìn)行致癌性評(píng)價(jià)領(lǐng)域，目前仍處于“四無”狀態(tài):無商業(yè)化動(dòng)物模型可售，無技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可查，無關(guān)鍵技術(shù)可用，無背景數(shù)據(jù)可考(范昌發(fā)等，2009，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，26:59-61)。
[0010]本申請(qǐng)將來源于人的Nbsle 657del5基因整合到小鼠基因組中，然后通過基因型鑒定、表達(dá)分析和回交繁殖建立了 3個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系。以期通過致癌劑的誘導(dǎo)來篩選出具有理想短期致癌特點(diǎn)的人源化模型。本發(fā)明彌補(bǔ)了 NBS模型方面的空白，同時(shí)具有區(qū)分鼠類致癌劑而人類非致癌劑和在各個(gè)器官(含內(nèi)分泌、生殖器官)的致癌敏感性上獲得比較一致表型的潛力。有利于最終實(shí)現(xiàn)借助藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息、基因毒性實(shí)驗(yàn)(如Ames突變實(shí)驗(yàn))、大鼠的2-年致癌性實(shí)驗(yàn)等其它體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來充分且真實(shí)地預(yù)測(cè)待上市藥物對(duì)人體致癌的潛在威脅(J.B.Pritchard等，2003，Environmental Health Perspectives, 111:444-454)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供基于BAC顯微注射技術(shù)，產(chǎn)生可穩(wěn)定表達(dá)不同水平NBSlpro的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠， 彌補(bǔ)現(xiàn)有NBS疾病模型的缺陷，并為藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)中的短期致癌實(shí)驗(yàn)建立替代模型。
[0012]本發(fā)明的目的部分通過提供一種基因載體而實(shí)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明的基因載體含有人的Nbsr 657tte15基因，通過顯微注射該基因載體、使之整合到小鼠基因組，產(chǎn)生人源Nbsl基因表達(dá)特征與內(nèi)源Nbsl —致的轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)而使部分功能受損的NBSIp7q參與到影響染色體的穩(wěn)定性、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)等相關(guān)信號(hào)通路中，提高細(xì)胞和個(gè)體惡性轉(zhuǎn)化和癌變的概率。
[0013]本發(fā)明借助rpsl-neo反向篩選系統(tǒng)將Nbsl基因的大量上下游調(diào)控元件(如c_Myc介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于Nbsl基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游493-439bp的啟動(dòng)子區(qū)和其第I個(gè)內(nèi)含子中)與Nbsl的c.657del5突變串聯(lián)起來，從而構(gòu)建本發(fā)明的基因載體。
[0014]因此，本發(fā)明第一方面提供一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列含有人的Nbsla 657de15 基因。
[0015]在一【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸含有Nbsl基因的上下游調(diào)控元件。
[0016]在一【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸含有Nbsl及其上下游至少40kb、至少50kb、或至少60kb的DNA序列。在一【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸序列長度在40-60kb的范圍內(nèi)。
[0017]在一【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸序列還含有人源CALBl和DECRl。
[0018]在一【具體實(shí)施方式】中,所述多核苷酸序列是載體。
[0019]在一【具體實(shí)施方式】中，所述載體是BAC載體。
[0020]在一【具體實(shí)施方式】中，所述BAC載體是CH17-246C15。
[0021]本發(fā)明第二方面提供一種構(gòu)建小鼠模型的方法，所述方法包括:
[0022](1)將本發(fā)明的BAC載體顯微注射到小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，體外培育該受精卵至2細(xì)胞期后，移植入假孕受體輸卵管內(nèi)，獲得Nbsl基因5’、3’端調(diào)控序列以及突變位點(diǎn)均為陽性的子代小鼠；和
[0023](2)將步驟(1)所得的子代小鼠分別與WT C57BL/6N品系小鼠進(jìn)行回交，通過基因的自由組合與分離來獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系。
[0024]在一【具體實(shí)施方式】中，所述方法還包括:篩選人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄的、且BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)的、穩(wěn)定的Nbsle 657de15轉(zhuǎn)基因系。
[0025]本發(fā)明還涉及Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中，Nbsr 657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代采用本發(fā)明構(gòu)建小鼠模型的方法獲得。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代表現(xiàn)為人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄、BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)、具有穩(wěn)定的
NbsIa 657de15轉(zhuǎn)基因特征。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代中，人源Nbsl可以在胸腺、脾臟、睪丸、腦中較高水平地轉(zhuǎn)錄，在肝臟、肌肉、心臟、腎臟、肺臟和結(jié)腸中也可以被活躍地轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄特征與內(nèi)源Nbsl—致，可參與到相關(guān)功能的信號(hào)通路中。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代中，NBSlp70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺組織、脾臟組織和激活的B細(xì)胞中表達(dá)；其表達(dá)水平接近內(nèi)源NBSl或高于內(nèi)源NBSl的表達(dá)水平。暗示人源Nbslp7tl在胎鼠和成年鼠的免疫器官中可代替部分內(nèi)源的NBSl蛋白，影響DNA DSB引起的同源重組修復(fù)、非同源末端連接或細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)等功能的正常發(fā)揮。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代中，人源CALBl和DECRl基本不表達(dá)或表達(dá)水平非常微弱，基本可忽略。
[0031 ] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的NbsI657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代具有發(fā)育遲緩、體長均勻縮短和骨發(fā)育異常(如上肢或下肢腳趾彎曲)的表型，與臨床上NBS病人的癥狀類似。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代還可在長時(shí)間,例如至少1個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少5個(gè)月、至少6個(gè)月、至少7個(gè)月、至少8個(gè)月、至少9個(gè)月、至少10個(gè)月、至少11個(gè)月、至少12個(gè)月或更長時(shí)間的生長期間內(nèi)不發(fā)生自發(fā)腫瘤。
[0033]本發(fā)明也包括本發(fā)明Nbsr 657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物，所述小鼠后代、其細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物的特征是人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄的、且BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)的、以及具有穩(wěn)定的Nb s Ia 657de15 轉(zhuǎn)基因。
[0034] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明多核苷酸序列，尤其是BAC載體，在構(gòu)建Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)用，包括用于制備構(gòu)建Nbsr 657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠用的物質(zhì)中的應(yīng)用。
[0035]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代、Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物作為模型的用途，包括用于檢測(cè)化合物在如下實(shí)驗(yàn)或疾病中的效果或用來研究可誘發(fā)下述疾病化合物的敏感性:藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的廣泛性檢測(cè)；雙鏈斷裂修復(fù)失常與癌癥或其它相關(guān)疾病發(fā)生的關(guān)系研究；免疫毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)；發(fā)育障礙如頭小畸形、發(fā)育遲緩；面部特征異常如前額退化、下頜骨退化、耳大、頭發(fā)稀疏；骨發(fā)育異常如趾畸形、髖骨發(fā)育不良、骶骨發(fā)育不良；性發(fā)育障礙如卵巢早熟性發(fā)育不足、雄性不育；易反復(fù)感染如竇炎、肺炎；免疫缺陷如體液免疫缺陷、細(xì)胞免疫缺陷；腦發(fā)育異常如腦積水、大腦額葉發(fā)育不良；認(rèn)知功能變差；皮膚異常如淺褐色斑點(diǎn)、白癜風(fēng)斑點(diǎn)。
[0036]本發(fā)明也提供方法，所述方法包括給予本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代、Nbslc-657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物某些物質(zhì)、化合物、分子，例如化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗體、核酸分子等等，以檢測(cè)和/或評(píng)價(jià)所述物質(zhì)、化合物、分子等在如下實(shí)驗(yàn)或疾病中的效果或用來研究可誘發(fā)下述疾病化合物的敏感性:藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的廣泛性檢測(cè)；雙鏈斷裂修復(fù)失常與癌癥或其它相關(guān)疾病發(fā)生的關(guān)系研究；免疫毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)；發(fā)育障礙如頭小畸形、發(fā)育遲緩；面部特征異常如前額退化、下頜骨退化、耳大、頭發(fā)稀疏；骨發(fā)育異常如趾畸形、髖骨發(fā)育不良、骶骨發(fā)育不良；性發(fā)育障礙如卵巢早熟性發(fā)育不足、雄性不育；易反復(fù)感染如竇炎、肺炎；免疫缺陷如體液免疫缺陷、細(xì)胞免疫缺陷；腦發(fā)育異常如腦積水、大腦額葉發(fā)育不良；認(rèn)知功能變差；皮膚異常如淺褐色斑點(diǎn)、白癜風(fēng)斑點(diǎn)。
[0037]特別地，本發(fā)明提供一種檢測(cè)藥物致癌性的方法，所述方法包括對(duì)本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代、Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物施加所述藥物；和檢測(cè)所述Nbsr 657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代、Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物中與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的因子的水平，從而確定該藥物的致癌性。
[0038]本發(fā)明還包括來自本發(fā)明提供的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物；組織或器官型切片培養(yǎng)物；組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物；組織提取物或細(xì)胞提取物作為工具的用途，包括用于評(píng)定評(píng)定環(huán)境致癌因子(如電離輻射、核輻射和紫外輻射等污染物)的強(qiáng)度是否達(dá)到了致癌水平、分析人和鼠源Nbsl功能的一致和差異性、確定作用于NBS1p7°的化合物的特異性、研究NBSlpro或其他與NBS1p7°相關(guān)聯(lián)細(xì)胞成分的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和鑒定NBSlpro的未知配體。
[0039]本發(fā)明還提供評(píng)定環(huán)境致癌因子(如電離輻射、核輻射和紫外輻射等污染物)的強(qiáng)度是否達(dá)到了致癌水平的方法，所述方法包括:對(duì)本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物施與所述環(huán)境致癌因子；檢測(cè)所述Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、組織提取物或細(xì)胞提取物的與癌發(fā)生相關(guān)的因子的水平；以及評(píng)價(jià)所述環(huán)境致癌因子(如電離輻射、核輻射和紫外輻射等污染物)的強(qiáng)度是否達(dá)到了致癌水平。
[0040]本發(fā)明構(gòu)建了人源Nbsl基因中含5bp缺失突變的BAC載體，原核顯微注射后，獲得了人源Nbsl的表達(dá)特征與內(nèi)源Nbsl —致的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠。人源NBSlp7tl可以在不同轉(zhuǎn)基因系后代的胚胎期，成年期的胸腺、脾臟和激活的B細(xì)胞中表達(dá)。通過篩選不同的轉(zhuǎn)基因系，獲得了高表達(dá)和低表達(dá)人源Nbsl基因的3個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系。在這3個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因系中，BAC載體上同時(shí)存在的人源CALBl和DECRl基本不轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過表型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，上述轉(zhuǎn)基因小鼠在其中一個(gè)穩(wěn)定低表達(dá)系中以一定比例出現(xiàn)了發(fā)育延遲、體長均勻縮短、骨發(fā)育異常的表型。本發(fā)明的有益結(jié)果在于:建立了一個(gè)新的NBS (奈梅亨破碎綜合癥)疾病小鼠模型。同時(shí)，部分功能受損的NBSlp7tl影響染色體的穩(wěn)定性、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)等與癌癥發(fā)生密切相關(guān)的信號(hào)通路，因此Nbsr 657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠為藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)中的短期致癌實(shí)驗(yàn)提供了有潛力的替代模型，也為癌癥發(fā)生機(jī)理的研究提供了有效的工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為BAC克隆的結(jié)構(gòu)示意圖。+表示:基因型鑒定的上下游引物所在的位置。
[0042]圖2為利用rpsl-neo反向篩選系統(tǒng)進(jìn)彳丁兩步同源重組的基本原理不意圖。
[0043]圖3為測(cè)序峰值結(jié)果(上)和比對(duì)結(jié)果(下)，表明ACAAA5bp的缺失突變成功修飾在BAC載體上的人源Nbsl 基因c.657-661位點(diǎn)。
[0044]圖4為Nbsle 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠Founder的基因型鑒定圖。BAC:作為陽性對(duì)照的BAC載體DNA，G:作為陰性對(duì)照的WT C57BL/6N小鼠的基因組DNA，hNbsl-5’:引物位于人源Nbsl基因的5’端調(diào)控序列，hNbsl-3’:引物位于人源Nbsl基因的3’端調(diào)控序列，hNbsl-M:引物位于人源Nbsl基因突變位點(diǎn)的附近，mNbsl:引物位于內(nèi)源Nbsl編碼序列中。
[0045]圖5為在WT C57BL/6N和Nbs 1。_657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠中，人源Nbs I及內(nèi)源Nbs I在10種組織中的轉(zhuǎn)錄情況RT-PCR結(jié)果圖。L1:肝臟，Th:胸腺，Mu:肌肉，He:心臟，Br:大腦,Lu:肺，Co:結(jié)腸，K1:腎臟，Sp:脾臟，Te:睪丸，N:未加cDNA模板的陰性對(duì)照，hNbslm_5:引物位于突變位點(diǎn)的5’端，hNbslm-3’:引物位于突變位點(diǎn)的3’端，GAPDH:作為內(nèi)參基因。
[0046]圖6為在Nbsle 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠后代的WT和轉(zhuǎn)基因胎鼠中，人源NBSlp7tl及內(nèi)源NBSl的表達(dá)情況Western blot結(jié)果圖。27#FQ:胎鼠為轉(zhuǎn)基因27#FQ與WT C57BL/6N回交第一代的陽性胚胎，1SN1:胎鼠為轉(zhuǎn)基因1ftN1與WT C57BL/6N回交第二代的陽性胚胎，WT:胎鼠為基因型鑒定結(jié)果為陰性的胚胎，mNbsl:內(nèi)源Nbsl，hNbslm:人源NBSlp'
[0047]圖7為在成年的WT和Nbsle 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠中，人源NBSlp7ci及內(nèi)源NBSl在胸腺(A)、脾臟(B)和激活的B細(xì)胞(C)中的表達(dá)情況Westernblot結(jié)果圖。
[0048]圖8為在成年WT和I個(gè)穩(wěn)定高表達(dá)、2個(gè)穩(wěn)定低表達(dá)的Nbsle 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠中，人源Nbsl及內(nèi)源Nbsl的轉(zhuǎn)錄水平Real-time PCR結(jié)果圖。20#TG:穩(wěn)定高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系，“22#TG”和“94#TG”分別代表2個(gè)穩(wěn)定低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系，WT:WT C57BL/6N小鼠作為陰性對(duì)照。
[0049]圖9為在成年WT和I個(gè)穩(wěn)定高表達(dá)、2個(gè)穩(wěn)定低表達(dá)及I個(gè)作為陽性對(duì)照的Nbsle 657del5人源化轉(zhuǎn)基因小鼠中，人源CALBl和DECRl的轉(zhuǎn)錄情況Real-time PCR結(jié)果圖。3#TG:人源CALBl和DECRl轉(zhuǎn)錄水平較高的陽性對(duì)照轉(zhuǎn)基因系。
[0050]圖10為同窩4周齡雄性WT C57BL/6N (左)和NbsIe 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠(右)的發(fā)育遲緩表型的代表圖。

【具體實(shí)施方式】
[0051]本發(fā)明的多核苷酸序列含有人的Nbsle 657del5基因。人Nbsl基因的Genbank登陸號(hào)為 NG_008860。
[0052]本文中，人Nbsle 657del5基因指缺失cDNA第657-661位點(diǎn)共5個(gè)堿基(即ACAAA)的人的Nbsl基因。
[0053]本發(fā)明的多核苷酸序列為分離的多核苷酸序列。術(shù)語“分離的”意味著所指的分子從發(fā)現(xiàn)該分子天然存在的整個(gè)生物體中分離和分開，或基本不存在其它相同類型的生物大分子。術(shù)語“分離”對(duì)于多核苷酸序列是指一種核酸分子，它完全或部分缺乏與其天然結(jié)合的序列；或一條序列，因?yàn)樗烊淮嬖?，但具有與其結(jié)合的異源序列；或從染色體分離的分子。
[0054]本發(fā)明的多核苷酸序列優(yōu)選為基因載體，其含有Nbsl基因的上下游調(diào)控元件，例如，含有Nbsl及其上下游至少40kb、至少45kb、至少50kb、或至少55kb的DNA序列。通常，所述多核苷酸序列長度可在40-60kb的范圍內(nèi)。
[0055]本發(fā)明的基因載體可以是例如BAC載體。BAC載體可從市售途徑獲得，例如購自Children’ s Hospital Oakland Research Institute (BACPAC Resource at CHORI)? 如本文所述，可借助rpsl-neo反向篩選系統(tǒng)進(jìn)行兩步同源重組，在BAC載體上造成上述5bp的缺失，從而構(gòu)建得到本發(fā)明的載體。
[0056]在一具體實(shí)施例中，載體構(gòu)建可如下進(jìn)行:
[0057]1.擴(kuò)增含有rpsl-neo的同源片段用于反向篩選，合成含點(diǎn)突變的同源序列并退火獲得雙鏈；和
[0058]2.將可發(fā)揮同源重組功能的PSM18質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入BAC載體的宿主菌，然后采用rpsl-neo反向篩選系統(tǒng)進(jìn)行兩步同源重組，將5bp缺失突變制作在BAC載體的目的位置(見圖1)。
[0059]此外，還可實(shí)施PCR和測(cè)序來驗(yàn)證所構(gòu)建的BAC載體修飾是否正確，以及在已修飾好的BAC載體上隨機(jī)選擇10個(gè)500bp左右的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證BAC載體內(nèi)部未發(fā)生大片段同源重組。
[0060]獲得本發(fā)明的BAC載體后，可將過柱純化。使用時(shí)可先稀釋。
[0061]進(jìn)行顯微注射的BAC載體上除完整的Nbsl的序列外還存在CALBl和DECRl的完整序列。由于轉(zhuǎn)基因在隨機(jī)插入的過程中會(huì)發(fā)生斷裂和部分片段的丟失，因此可通過Genotyping和Real-time PCR來篩選CALBl和DECRl未插入或基本不表達(dá)、但目的基因可表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系來進(jìn)行深入研究。
[0062]陽性Founder小鼠的篩選和后代的繁殖可如下進(jìn)行:
[0063]1.將本發(fā)明的BAC載體顯微注射到小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，之后將體外培養(yǎng)到2細(xì)胞期的胚胎，移植入假孕受體輸卵管內(nèi)；
[0064]2.使用分別對(duì)應(yīng)于位于Nbsl基因-5’、3’端調(diào)控序列和突變位點(diǎn)附近的3對(duì)特異性引物鑒定基因型，三陽性的小鼠稱為Founder ；
[0065]3.將每只Founder分別與WT C57BL/6N品系小鼠進(jìn)行回交，通過基因的自由組合與分離來獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系，即本發(fā)明的人源Nbsr 657tte15轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0066]在一具體實(shí)施例中，對(duì)應(yīng)于位于Nbsl基因_5’、3’端調(diào)控序列和突變位點(diǎn)附近的3對(duì)特異性引物選自SEQ ID NO:27-32ο
[0067]本發(fā)明也涉及SEQ ID NO:27_32和/或本文所公開的其它引物中的一條或任意多條的組合在構(gòu)建、篩選和鑒別本發(fā)明的陽性Founder小鼠或在構(gòu)建、篩選和鑒別本發(fā)明Nbslc-657de15轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代中的應(yīng)用。
[0068]進(jìn)一步地，可采用以下的方法來分析Nbsle 657del5轉(zhuǎn)基因小鼠中人源Nbsl的轉(zhuǎn)錄特征及NBSIp7q的表達(dá)情況:
[0069]1.分別提取WT和不同轉(zhuǎn)基因系鼠中10個(gè)組織的RNA，進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)人源Nbsl在不同組織中的轉(zhuǎn)錄特征。
[0070]2.分別提取WT和不同轉(zhuǎn)基因系的后代胎鼠蛋白，進(jìn)行Western blot，檢測(cè)NBSIp7q在轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎期的表達(dá)情況。
[0071]3.分別提取W T和不同轉(zhuǎn)基因系小鼠的胸腺，脾臟和激活的B細(xì)胞中的蛋白，進(jìn)行Western blot，檢測(cè)NBSlp7tl在成年轉(zhuǎn)基因小鼠免疫器官中的表達(dá)情況。
[0072]最后，篩選人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄的、且BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)的，穩(wěn)定的Nbsr 657tte15轉(zhuǎn)基因系，并對(duì)相關(guān)的表型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括:
[0073]1.分別提取不同轉(zhuǎn)基因系小鼠的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR，分析并篩選出可穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄人源Nbsl的轉(zhuǎn)基因系。
[0074]2.通過Real-time PCR檢測(cè)篩選出的轉(zhuǎn)基因系中，人源CALBl和DECRl的轉(zhuǎn)錄情況。
[0075]3.統(tǒng)計(jì)這幾個(gè)系中，發(fā)育遲緩、體長均勻縮短、骨發(fā)育異常等NBS疾病相關(guān)癥狀的表型出現(xiàn)率。
[0076]本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠指轉(zhuǎn)化了人Nbsr 657de15基因且穩(wěn)定表達(dá)人Nbsr_657de15基因的小鼠。
[0077]本發(fā)明的Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代具有以下一種或多種特征:
[0078](I)人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄；
[0079](2) BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)，或表達(dá)水平非常微弱，基本可忽略；
[0080](3)具有穩(wěn)定的Nbsr 657de15轉(zhuǎn)基因特征；
[0081](4)人源Nbsl可以在胸腺、脾臟、睪丸、腦中較高水平地轉(zhuǎn)錄，在肝臟、肌肉、心臟、腎臟、肺臟和結(jié)腸中也可以被活躍地轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄特征與內(nèi)源Nbsl—致，可參與到相關(guān)功能的信號(hào)通路中；
[0082](5)NBS1P7°在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺組織、脾臟組織和激活的B細(xì)胞中表達(dá)；其表達(dá)水平接近內(nèi)源NBSl或高于內(nèi)源NBSl的表達(dá)水平；
[0083](6)具有發(fā)育遲緩、體長均勻縮短和骨發(fā)育異常(如上肢或下肢腳趾彎曲)的表型，與臨床上NBS病人的癥狀類似；
[0084](7)在長時(shí)間，例如至少I個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少5個(gè)月、至少6個(gè)月、至少7個(gè)月、至少8個(gè)月、至少9個(gè)月、至少10個(gè)月、至少11個(gè)月、至少12個(gè)月或更長時(shí)間的生長期間內(nèi)不發(fā)生自發(fā)腫瘤。
[0085]本發(fā)明包括本發(fā)明Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物，所述小鼠后代、其細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物的特征是人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄的、且BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)的、以及具有穩(wěn)定的Nb s Ia 657de15 轉(zhuǎn)基因。
[0086]本發(fā)明中，來自所述Nbsr 657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代可以是具有分化功能的干細(xì)胞，也可以是體細(xì)胞。所述細(xì)胞培養(yǎng)物可以是干細(xì)胞培養(yǎng)物，也可以是體細(xì)胞培養(yǎng)物。所述組織或器官可以是各種組織器官，包括但不限于胚胎、胸腺、脾臟、睪丸、腦、肝臟、肌肉、心臟、腎臟、肺臟和結(jié)腸等。
[0087]下文將以具體實(shí)施例的方式產(chǎn)生本發(fā)明。應(yīng)理解，除非另有說明，否則所采用的方法、條件、試劑等都是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段。
[0088]實(shí)施例
[0089]實(shí)施例1:人源BAC克隆的查詢、訂購和PCR鑒定。
[0090]通過搜索Ensemble Genome Browser來確定Nbsl及其上下游至少50kb的DNA序列在染色體上的區(qū)域，并將其它基因的存在降到最低，從NCBI Clone DB中篩選出編號(hào)為CH17-246C15的人源BAC克隆符合條件(見圖1)。訂購的BAC克隆(CHORI)保存在DHlOB的宿主細(xì)胞中，以瓊脂為載體郵寄過來。將該菌種劃線培養(yǎng)，接種后擴(kuò)增培養(yǎng)。然后使用位于c.657del5突變位點(diǎn)5’、3’的2對(duì)特異性引物對(duì)購回的BAC菌種進(jìn)行菌液PCR鑒定，引物序列如下:
[0091]hNbsl-657tF:TGTCACCTGCCACCATATTTCTAG (SEQ ID NO:1)
[0092]hNbsl-657tR:CCGTAATCACAGCCATGATCACT (SEQ ID NO:2)
[0093]PCR 擴(kuò)增條件:94°C 5min，35* (94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec),72°C 5min,4°C保溫(dNTP、Mg2+、Taq酶、10*buffer均購自博彩)。產(chǎn)物片段為494bp，鑒定結(jié)果表明BAC克隆正確。
[0094]實(shí)施例2:基因載體的構(gòu)建
[0095]步驟一、以pRpsl-neo質(zhì)粒(由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所載體組惠贈(zèng))為模板，通過 PrimeSTAR 高保真性 PCR (TaKaRa)獲得 rpsl-neo 片段，其包含:1319bp 的 rpsl-neo,c.657del5突變位點(diǎn)5’端61bp同源臂(l_hm)和其3’端61bp同源臂(r_hm)。引物序列如下:
[0096]hNbsl-657hF:CTCTTGATGAACCATCTATTGGAAGTAAAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAAGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG (SEQ ID NO:3)
[0097]hNbsl-657hR:TTAGCTTATAACATAATTACCTGTTTGGCATTCAAAAATATAAATGTTTTCCCTTTGAAGATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG (SEQ ID NO:4)
[0098]PCR 擴(kuò)增條件:95 °C 5min，5* (98 °C 15sec，55 °C 15sec，72 °C 2min)，26*(98°C 15sec，65°C 15sec，72°C 2min)，72°C 5min，4°C保溫。產(chǎn)物片段為 1441bp，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收(B1Flux)并確定回收產(chǎn)物濃度。
[0099]步驟二、人工合成攜帶突變的序列，其包含引入的c.657del5缺失突變、突變位點(diǎn)5’端51bp同源臂(1-hm)和其3’端51bp同源臂(r_hm)。合成的序列如下:
[0100]hNbsl-657mF:ACCATCTATTGGAAGTAAAAATGTTGATCTGTCAGGACGGCAGGAAAGAAATCTTCAAAGGGAAAACATTTATATTTTTGAATGCCAAACAGGTAATTATGT (SEQ ID NO:5)
[0101]hNbsl-657mR:ACATAATTACCTGTTTGGCATTCAAAAATATAAATGTTTTCCCTTTGAAGATTTCTTTCCTGCCGTCCTGACAGATCAACATTTTTACTTCCAATAGATGGT (SEQ ID NO:6)
[0102]將20ull0uM的上述序列混合，95°C變性lOmin，室溫退火2h，形成雙鏈。
[0103]步驟三、制作BAC宿主菌的電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入PSM18質(zhì)粒(由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所載體組惠贈(zèng)，也可使用其它已知的用于同源重組的質(zhì)粒，例如pSC101-BAD-gbaA質(zhì)粒)，用具有 Hygromycin B (150ug/ml,溶于 MilliQ 水，上海生工)、Chloramphenicol (50ug/ml，溶于無水乙醇，上海生工)的LB平板篩選，并用特異性引物pSiml8-F/pSiml8-R (由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所載體組惠贈(zèng)，或可根據(jù)所使用的用于同源重組的質(zhì)粒的序列設(shè)計(jì)其特異性引物)進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR擴(kuò)增條件-MV 5min，28* (94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec)，72°C 5min，4°C保溫。產(chǎn)物片段約為 550bp。
[0104]制作已含pSM18質(zhì)粒的BAC宿主菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入rpsl-neo片段，用具有Kanamycin (50ug/ml，溶于MilliQ水，上海生工)、C+的LB平板篩選，并用特異性Nbsl-657tF/Nbsl-657tR(序列同“實(shí)施例1”)進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR擴(kuò)增條件:94°C 5min，28* (94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 2min)，72°C 5min，4°C保溫。產(chǎn)物片段為 1809bp。然后將K+、C+并PCR鑒定正確的菌株在K+、Streptomycin (50ug/ml，溶于Mi 11 iQ水，上海生工)LB平板上劃線驗(yàn)證菌株對(duì)鏈霉素敏感。
[0105]制作已完成第一步同源重組的BAC宿主菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入攜帶突變的合成片段，用S+、C+抗性的LB平板篩選，并用Nbsl-657tF/Nbsl-657tR (序列同“實(shí)施例1”)進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。PCR 擴(kuò)增條件:94°C 5min，28* (94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec),72°C 5min，4°C保溫。產(chǎn)物片段為490bp。然后將S+、C+并PCR鑒定正確的菌株在K+C+LB平板上劃線驗(yàn)證菌株失去卡那霉素抗性。
[0106]將已完成第二步同源重組的菌株，用Nbsl-657tF/Nbsl_657tR(序列同“實(shí)施例1”)進(jìn)行 PrimeSTAR 高保真性 PCR。PCR 擴(kuò)增條件:94°C 5min，35* (98 °C 15sec，55°C 15sec,72°C 30sec), 72°C 5min,4°C保溫。回收PCR產(chǎn)物、送與上海invitrogen公司測(cè)序,驗(yàn)證BAC修飾成功(見圖3)。
[0107]以上步驟的原理為利用rpsl-neo反向篩選系統(tǒng)進(jìn)行兩步同源重組(見圖2)。更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作步驟可以參考 Counter-Select1n BAC Modificat1n KitCGene Bridges)。
[0108]步驟四、將修飾正確的BAC宿主菌于37°C培養(yǎng)，通過菌落或菌液PCR篩選pSM18質(zhì)粒完全丟失的菌株(PSM18質(zhì)粒在30°C以上復(fù)制終止，隨著分裂而丟失)。并再次測(cè)序證實(shí)在37°C培養(yǎng)的過程中目的位置未引入其它突變(Invitrogen，結(jié)果與圖3相同)。
[0109]步驟五、獲得修飾正確且完全丟失pSM18質(zhì)粒的BAC宿主菌后，隨機(jī)選擇10個(gè)500bp左右的片段測(cè)序，結(jié)果與NCBI的序列信息一致，表明BAC載體正確且內(nèi)部未發(fā)生大片段同源重組。10對(duì)引物的序列信息如下:

【權(quán)利要求】
1.一種多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列含有人Nbsl及其上下游長40 —60kb的序列，其中，所述人Nbsl基因?yàn)槿薔bsr 657d615基因。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列為BAC載體。
3.權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸序列在制備構(gòu)建Nbsr657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代用的物質(zhì)中的用途。
4.一種細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、或組織提取物或細(xì)胞提取物，其特征在于， 所述細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物來自經(jīng)權(quán)利要求2所述的BAC載體轉(zhuǎn)基因的Nbslc-657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代；和 所述細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、和組織提取物或細(xì)胞提取物的特征是人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄的、且BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)的、以及具有穩(wěn)定的Nbsle 657de15轉(zhuǎn)基因。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、或組織提取物或細(xì)胞提取物，其特征在于，所述Nbsr 657tte15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠或其后代具有以下一種或多種特征: (1)人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄； (2)BAC載體上 同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)，或表達(dá)水平非常微弱，基本可忽略； (3)具有穩(wěn)定的Nbsr_657de15轉(zhuǎn)基因特征； (4)人源Nbsl在胸腺、脾臟、睪丸、腦中高水平地轉(zhuǎn)錄，在肝臟、肌肉、心臟、腎臟、肺臟和結(jié)腸中被活躍地轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄特征與內(nèi)源Nbsl —致，參與到相關(guān)功能的信號(hào)通路中； (5)NBS1P70在所述小鼠或其后代的胚胎期、成年期的胸腺組織、脾臟組織和激活的B細(xì)胞中表達(dá)；其表達(dá)水平接近內(nèi)源NBSl或高于內(nèi)源NBSl的表達(dá)水平； (6 )具有發(fā)育遲緩、體長均勻縮短和骨發(fā)育異常(如上肢或下肢腳趾彎曲)的表型，與臨床上NBS病人的癥狀類似；和 (7)在至少12個(gè)月的生長期間內(nèi)不發(fā)生自發(fā)腫瘤。
6.權(quán)利要求4或5所述的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、或組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，包括用于檢測(cè)化合物在如下實(shí)驗(yàn)或疾病中的效果或用來研究可誘發(fā)下述疾病化合物的敏感性， 其中，所述實(shí)驗(yàn)選自:藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)；基因毒性和非基因毒性致癌物或抑癌物的廣泛性檢測(cè)；雙鏈斷裂修復(fù)失常與癌癥或其它相關(guān)疾病發(fā)生的關(guān)系研究；免疫毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)； 所述疾病選自:發(fā)育障礙，如頭小畸形、發(fā)育遲緩；面部特征異常，如前額退化、下頜骨退化、耳大、頭發(fā)稀疏；骨發(fā)育異常，如趾畸形、髖骨發(fā)育不良、骶骨發(fā)育不良；性發(fā)育障礙，如卵巢早熟性發(fā)育不足、雄性不育；易反復(fù)感染，如竇炎、肺炎；免疫缺陷，如體液免疫缺陷、細(xì)胞免疫缺陷；腦發(fā)育異常，如腦積水、大腦額葉發(fā)育不良；認(rèn)知功能變差；皮膚異常，如淺褐色斑點(diǎn)、白癜風(fēng)斑點(diǎn)。
7.權(quán)利要求4或5所述的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官型切片培養(yǎng)物、組織外植體或器官外植體或其培養(yǎng)物、或組織提取物或細(xì)胞提取物的用途，包括用于評(píng)定環(huán)境致癌因子(如電離輻射、核輻射和紫外輻射等污染物)的強(qiáng)度是否達(dá)到了致癌水平、分析人和鼠源Nbsl功能的一致和差異性、確定作用于NBSlpro的化合物的特異性、研究NBSlp7tl或其他與NBS1p7°相關(guān)聯(lián)細(xì)胞成分的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和鑒定NBS1p7°的未知配體。
8.—種構(gòu)建小鼠模型的方法，所述方法包括: (1)將權(quán)利要求2所述的BAC載體顯微注射到小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，體外培育該受精卵至2細(xì)胞期后，移植入假孕受體輸卵管內(nèi)，獲得Nbsl基因5’、3’端調(diào)控序列以及突變位點(diǎn)均為陽性的子代小鼠；和 (2)將步驟(1)所得的子代小鼠分別與WTC57BL/6N品系小鼠進(jìn)行回交，通過基因的自由組合與分離來獲得穩(wěn)定 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括:篩選人源Nbsl呈不同水平轉(zhuǎn)錄的、且BAC載體上同時(shí)存在的CALBl和DECRl基本不表達(dá)的、穩(wěn)定的Nbsle 657de15轉(zhuǎn)基因系。
10.采用權(quán)利要求8或9所述的方法構(gòu)建得到的Nbsr657de15人源化轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104046644SQ201310082116
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月14日
【發(fā)明者】魏勤, 徐平 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院