一種快速制備高密度高純藻種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于藻類應用【技術(shù)領(lǐng)域】的一種快速制備高密度高純藻種的方法。它包括一種高效培養(yǎng)基及其配制方法。利用高效培養(yǎng)基，藻依次經(jīng)過三角瓶中搖動培養(yǎng)、柱形玻璃管和平板光生物反應器中通空氣培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)過程中藻類密度變化，漸進式提高光強（200-10000lux）；同時調(diào)節(jié)通入的CO2量，保持培養(yǎng)液pH在6.5-8.5間，較優(yōu)的滿足藻類不同生長期光照和碳源需求，避免高強度光對藻類生長的危害，保持在最佳生長狀態(tài)，從而提高光合作用效率。在柱形玻璃管和平板生物反應器中可以實現(xiàn)每升培養(yǎng)基日產(chǎn)1.2g和0.65g干重的藻，每升培養(yǎng)基最終藻干重可分別達12g和8g以上。本發(fā)明可以大大縮短藻類規(guī)?；囵B(yǎng)周期，減少培養(yǎng)過程中藻類被污染的幾率，是獲得高純藻產(chǎn)品的有效方案。
【專利說明】一種快速制備高密度高純藻種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藻類應用【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種快速獲得高密度高純藻種的培養(yǎng)方法。具體說是通過調(diào)控光強和通氣，利用不同培養(yǎng)裝置，實現(xiàn)在短時間內(nèi)獲得高密度高純藻種，作為規(guī)?；B(yǎng)殖的接種物，用以生產(chǎn)魚蝦貝類的開口餌料、功能性食品、高附加值次生代謝產(chǎn)物以及生物柴油等。

【背景技術(shù)】
[0002]藻類是一類結(jié)構(gòu)簡單的光能自養(yǎng)生物，在有水和一些無機營養(yǎng)鹽存在時，能夠高效利用光和CO2合成有機物。藻類具有很高的經(jīng)濟價值，如小球藻是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源，雨生紅球藻經(jīng)過誘導后可以獲得大量蝦青素，螺旋藻是一種很好的功能食品，杜氏藻可用于大量生產(chǎn)類胡蘿卜素，某些海洋微藻則是植物性EPA和DHA主要來源，很多微藻可以直接作為魚、蝦、貝、蟹等水產(chǎn)經(jīng)濟動物幼苗的開口餌料。微藻還可以快速去除污水中的有機和無機營養(yǎng)物質(zhì)，而利用微藻生產(chǎn)生物柴油則是目前生物能源研究中的一個熱點。
[0003]和高等植物相比，藻類具有個體小、光合效率高、細胞分裂快、適應環(huán)境范圍廣和單位面積產(chǎn)量高等特點。在糧食 、能源和土地資源日益緊張的今天，藻類規(guī)模培養(yǎng)和綜合開發(fā)利用在解決人類面臨的諸多問題中具有很好的應用前景。藻類規(guī)模化培養(yǎng)中，“種子”的數(shù)量制約了生產(chǎn)規(guī)模，而其質(zhì)量和純度決定了收獲物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此如何在短時間內(nèi)快速獲得大量活性好的高純藻種是藻類規(guī)模培養(yǎng)和應用中至關(guān)重要的核心技術(shù)。
[0004]藻類生長中兩個至關(guān)重要的因子就是光和碳源(C02)。光能供應不足，就會降低藻類生長速率，而光能供應過多則會產(chǎn)生光抑制現(xiàn)象，對藻類細胞產(chǎn)生危害，嚴重的還會導致藻類細胞死亡。在藻類培養(yǎng)過程中，藻細胞密度不斷發(fā)生變化，對光的需求也在增加，如何根據(jù)藻細胞密度變化來調(diào)節(jié)光強，使其既能滿足藻類對光的需求而又不致產(chǎn)生危害，就可獲得最大藻類生物量。在藻類培養(yǎng)中，CO2不僅是光合作用的重要底物，還是一種重要的PH調(diào)節(jié)劑。藻類細胞密度較高時如不添加額外C02，pH會升高到11以上，而大多數(shù)藻生長的最佳PH為7-8，這樣會嚴重抑制藻類生長。因此，CO2作為pH調(diào)節(jié)劑的作用，在藻類細胞高密度培養(yǎng)時顯得尤為重要。按常規(guī)方法進行藻類培養(yǎng)時，經(jīng)常采用單一容器、單一光照強度、單一 CO2濃度的方法，不僅造成能源和營養(yǎng)浪費，還使藻類的產(chǎn)量偏低，最終收獲物的產(chǎn)量多在2 g(dw)L-1以下。本發(fā)明正是針對這種現(xiàn)狀，采用新的生產(chǎn)流程，提高單位時間和單位體積內(nèi)的藻產(chǎn)量，為相關(guān)藻類開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種快速獲得高密度高純藻種的方法。將在固體培養(yǎng)基上保種的藻類接種到一種高效培養(yǎng)基中，依次經(jīng)過在三角瓶中搖動培養(yǎng)、在柱形玻璃管和平板光生物反應器中通入添加CO2的空氣培養(yǎng)。在此過程中，根據(jù)藻類密度變化，漸進式提高光強；同時通過PH的反饋，調(diào)節(jié)通入的CO2量，來滿足藻類不同生長期光照和碳源需求，避免了高強度光對藻類生長的危害，使其保持在最佳生長狀態(tài)，從而提高藻類光合作用效率，實現(xiàn)藻類細胞的快速增殖。本發(fā)明提供的技術(shù)能在短時間內(nèi)獲得大量高純度的藻種，在藻類相關(guān)產(chǎn)業(yè)的藻種制備環(huán)節(jié)有廣泛應用。
[0006]本發(fā)明首先提供了一種高效液體培養(yǎng)基，其包含成分如下:KNO30.125-1.0gl/1，NaNO30.125-1.0 gl/1，KH2PO40.04-0.5 gL-1，Na2HPO40.05-0.5 gl/1，MgSO4 7H200.06-0.3 gL-1，CaCl20.02-0.1 gL' NaHCO30.02-3 gL' FeCl23_20 mgL-1，Na2EDTA 1-10mgL'H3BO31-1O mgL-1，MnCl2 4H20 0.5-5 mgL'ZnSO4 7H20 0.1-0.6 mgL' CuSO4 5H200.02-0.2 mgL' Na2MoO4 2H20 0.01-0.8 mgL-1，CoCl2 6H20 0.02-4 mgL' 配制培養(yǎng)基時，可以利用蒸餾水或經(jīng)放置12h的自來水。
[0007]液體培養(yǎng)基各營養(yǎng)鹽的優(yōu)選用量如下=KNO30.44 gL—1，NaNO30.60 gL—1，KH2PO40.136gl/1，Na2HPO40.142 gL' MgSO4 7H20 0.06-0.3 gL' CaCl20.(?gl/1，NaH⑶30.2 gl/1，F(xiàn)eCl27.542 mgL-1，Na2EDTA 5 mgL'H3B033.15 mgL-1，MnCl2 H2O 2 mgL'ZnSO4 7H20 0.222mgL' CuSO4 5H20 0.08 mgL' Na2MoO4 2H20 0.041 mgL-1，CoCl2 6H20 0.04 mgL'
[0008]為方便取用，營養(yǎng)鹽被分成四組配成不同濃度的母液，各母液如下:KNO3、NaNO3、KH2PO4和Na2HPO4依次溶解于蒸餾水中配成100X母液1，CaCl2和FeCl2依次溶解于蒸餾水中配制成1000 χ母液2 ,MgSO4.7Η20和NaHCO3依次溶解于蒸餾水中配成 1000 '母液 3，Na2EDTA, H3BO3^MnCl2.4Η20,ZnSO4.7Η20,CuSO4.5Η20、Na2MoO4.2Η20和CoCl2.6Η20依次溶解于蒸餾水中配制成1000 χ母液4。配制培養(yǎng)基時各母液分別滅菌，待冷卻后取1ml母液1，Iml母液2、Iml母液3和Iml溶液4依次加入700ml水中，待充分攪拌后再加入另外一種，防治沉淀產(chǎn)生，最后補水至1L。
[0009]本發(fā)明提供的藻種培養(yǎng)流程如下所述。
[0010]I).實驗用具滅菌
實驗中所用三角瓶和玻璃管等玻璃儀器采用高溫高壓法滅菌，光生物反應器則在清洗晾干后，移入經(jīng)過紫外線殺菌的培養(yǎng)室內(nèi)，在內(nèi)壁噴灑75%的酒精進行滅菌，待晾干后，封口備用。保種、活化和在柱形玻璃管中培養(yǎng)時所用培養(yǎng)基采用高溫高壓滅菌。在平板式反應器中培養(yǎng)基經(jīng)負壓過濾滅菌，濾膜孔徑為0.45 μ m。
[0011]2).藻種保存用上述優(yōu)化培養(yǎng)基配制含1.5%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基，將藻劃線或涂平板后用置于5001ux光照，20-30°C下培養(yǎng)。
[0012]3)藻種活化將保種在固體培養(yǎng)基上的藻種轉(zhuǎn)移到經(jīng)滅菌的50_500ml三角瓶中。三角瓶中培養(yǎng)液體積不超過其容量的2/3。滅菌條件為103.5 kPa，121°C，20min。單細胞綠藻或藍藻可以直接接種，形成較大群體的藻則先用滅菌的勻漿器或研缽在不添加石英砂等輔助物的情況下輕輕研磨，制備成單細胞或更小群體后再接種物。接種完成后，置于搖床上，培養(yǎng)條件為20-30°C，24h供光，光強為200-1200 lux, 20-120 rmirT1搖動，轉(zhuǎn)速控制以不使瓶定有明顯細胞沉淀為宜。剛從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶中時，培養(yǎng)光強為200lux，2-3天培養(yǎng)后，培養(yǎng)液呈明顯綠色，將光強提高到600 lux，培養(yǎng)兩天后光強升高到1200lux，再培養(yǎng)兩天后即可接種到柱形玻璃管中。光強度通過調(diào)節(jié)光源功率大小(如日光燈管數(shù)目)或添加濾網(wǎng)遮光實現(xiàn)。
[0013]4)藻種的快速培養(yǎng)將上述活化好的藻種按1:5體積比例接種到柱形透明玻璃培養(yǎng)管中，接種量以不超過玻璃管總體積的75%為宜，以避免藻在培養(yǎng)過程中被氣體沖出。柱形玻璃培養(yǎng)管的直徑為2-5 cm，優(yōu)選直徑為3.5cm，長度為30-80 cm，底部為U型或尖三角錐形。培養(yǎng)條件為:溫度控制在20-30°C，24h供光，光強為1000-6000 lux, pH 7-12，通氣培養(yǎng)。通入氣體經(jīng)孔徑為0.45 μ m濾膜過濾的氣體，流量為每升培養(yǎng)基0.04-2 L mirT1，以使細胞不產(chǎn)生沉淀為最小通氣量。通入的氣體為添加0.2-2%C02的空氣，CO2可以來自高壓鋼瓶(99%)或其它含高濃度CO2的氣體，如經(jīng)處理過的火電廠煙道廢氣。通入的CO2體積比經(jīng)由流量計調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)時以培養(yǎng)液PH為參照，高于pH8.5，則加大流量，低于pH6.5則降低流量。
[0014]初始光強為1000 lux，2天后升高為3000 lux，再培養(yǎng)2天后升高到6000 lux，再培養(yǎng)2天，此時藻生物量可達^Ug(Ck)L'即可轉(zhuǎn)移到平板光反應器中進行大量培養(yǎng)。
[0015]5)藻種的大量培養(yǎng)將上述柱形玻璃管中培養(yǎng)的藻按照1:10體積比例轉(zhuǎn)入平板光生物反應器中，初始接種量為0.4-1 gWw)!/1，接種總體積以不超過總體積的80%為宜。平板光生物反應器的光路徑為2-6cm，優(yōu)選光路徑為3.5cm，深度為50-150 cm。培養(yǎng)條件為20-30°C，24h供光，光強為2000-10000 lux, pH 7-12，通氣培養(yǎng)。通入的氣體為添加0.2-2%C02的空氣。CO2可以來自高壓鋼瓶(99%)或其它含高濃度CO2的氣體，如經(jīng)處理過的火電廠煙道廢氣。通入的CO2體積比經(jīng)由流量計調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)時以培養(yǎng)液pH為參照，高于pH8.5，則加大流量，低于pH6.5則降低流量。平板光生物反應器中的起始光強設為2000lux,培養(yǎng)2天后提高至4000 lux,再培養(yǎng)2天后光強提高至80001ux,再培養(yǎng)兩天,藻生物量可達4-8 gWw)!/1，此時可以收獲進行分析，或接種到更大體積的生物反應器中進行生產(chǎn)。
[0016]和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明快速獲得高密度高純藻種的方法具有如下特點:
I獲得的藻密度高，經(jīng)過6天的光自養(yǎng)生長，藻類生物量可高達12 g(dw)L-10
[0017]2培養(yǎng)過程中根據(jù)藻細胞密度和pH變化，動態(tài)調(diào)控光照和CO2，使它們能滿足藻類生長的需求但又不至于產(chǎn)生危害，同時節(jié)約了能源和資源。
[0018]3根據(jù)藻的不同生長階段特點，采用不同反應器，進行階段式培養(yǎng)，使得藻細胞能夠快速生長。
[0019]4能在短時間內(nèi)獲得足夠量的高純藻種，用于室外半開放或開放式規(guī)模培養(yǎng)的高密度接種，縮短培養(yǎng)周期，有效遏制雜藻和其他生物生長，獲得高純培養(yǎng)物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為普通小球藻(CX7ori?77a在柱形玻璃管中的生長及pH變化(25。。，1.5%C02)。
[0021]圖2為普通小球藻(CX7ore77a vugaris)在平板光生物反應器中的生長及pH變化(25°C，1.5%C02)。

【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明提供一種快速制備高濃度高純藻種方法。具體說就是利用本發(fā)明提供的高效液體培養(yǎng)基，將藻類依次在三角瓶中震蕩培養(yǎng)、在柱形玻璃培養(yǎng)管和平板式光生物反應器中進行通氣培養(yǎng)。在不同培養(yǎng)階段，提供不同的光照強度和不同的CO2濃度，滿足藻類生長過程對于光照和碳源需求，避免光抑制和碳限制，使藻類保持在最佳生長狀態(tài)，從而獲得最大生物量產(chǎn)率。下面以具體實例對本發(fā)明進行進一步闡述。實施例
[0023]小球藻(CX7ore77a購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種保藏中心。
[0024]所用培養(yǎng)基為優(yōu)選培養(yǎng)基(KNO30.44 gL—1，NaNO30.60 gL—1，KH2PO40.136 gL—1，Na2HPO40.142 gL-1，MgSO4 7H20 0.06-0.3 gL_1, CaCl20.03gL_1, NaHCO30.2 gL' FeCl27.542mgL-1, Na2EDTA 5 mgL'H3B033.15 mgL-1, MnCl2 H2O 2 mgL'ZnSO4 7H20 0.222 mgL' CuSO45H20 0.08 mgL' Na2MoO4 2H20 0.041 mgL' CoCl2 6H20 0.04 mgL’。培養(yǎng)基配制時采用蒸餾水，培養(yǎng)基在103.5 kPa, 121°C下滅菌20min，冷卻后備用。
[0025]從平板上挑取健康藻落，接種到50ml三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 rmirT1的搖床上，于25°C，24h照光下，進行初步活化。初始培養(yǎng)光強為200 lux, 2-3天培養(yǎng)后，培養(yǎng)液呈明顯綠色，將光強提高到600 lux，再培養(yǎng)兩天后光強升高到1200 lux，再培養(yǎng)兩天后按1:3比例接種到直徑3cm，長60cm的玻璃管中。
[0026]玻璃管中的培養(yǎng)時，溫度也控制在25°C。初始光強為1000 lux，第三天升高為3000lux,第五天升高到6000 lux,培養(yǎng)2天,此時普通小球藻生物量可達7.328((^)1^(圖1A);如繼續(xù)培養(yǎng)，在第八天和第十天每升培養(yǎng)液的生物量干重可分別達到9.86g和10.7g。
[0027]如在培養(yǎng)的第六天按照1:10比例轉(zhuǎn)入光路徑為3.5cm,深度為80cm的平板光生物反應器中，在25°C下進行通氣培養(yǎng)。起始光強設為2000 lux，第三天光強提高至4000 lux,第五天光強提高至8000 lux，第六天藻生物量達4.96 g Cdw)^1 (圖2A)，第八天可達到6.04 g (dw)L1 ο
[0028]在玻璃管和平板光反應器中通入添加1.5%C02的空氣，均可將培養(yǎng)液pH維持在
6.5-8.5 之間(圖 1B,圖 2B)。
【權(quán)利要求】
1.一種快速制備高密度高純藻種的方法，其特征在于:保種在固體培養(yǎng)基上的藻種依次轉(zhuǎn)移到滅菌的三角瓶、柱形透明玻璃培養(yǎng)管和平板光生物反應器中，搖動或通氣培養(yǎng)；溫度控制在 20-30°C，24h 供光，光強為 5-100 μ mo I photons mY1，pH 7-12 ;所用高效液體培養(yǎng)基為在蒸餾水或經(jīng)放置12h的自來水中添加以下營養(yǎng)鹽配制而成=KNO30.125-1.0 gL-1，NaNO3 0.125-1.0 gL-1，KH2PO4 0.04-0.5 gL_1, Na2HPO4 0.05-0.5 gL-1，MgSO4.7H20 0.06-0.3 gL-1，CaCl2 0.02-0.1 gL-1，NaHCO3 0.02-3 gL' FeCl2 3-20 mgL-1，Na2EDTA 1-10 mgL-1, H3BO3 1-10 mgL-1, MnCl2.4H20 0.5-5 mgL-1, ZnSO4.7H20 0.1-0.6mgl/1，CuSO4.5H20 0.02-0.2 mgl/1，Na2MoO4.2H20 0.01-0.8 mgL-1, CoCl2.6H200.02-4 mgr1 ;配制時KN03、NaNO3、KH2PO4和Na2HPO4依次溶解于蒸餾水中配成100X母液1，MgSO4.7H20、CaCl2和FeCl2依次溶解于蒸餾水中配制成1000 X的母液2，NaHCO3配成 1000 )(母液 3，Na2EDTA, H3BO3'MnCl2.4H20、ZnSO4.7H20、CuSO4.5H20、Na2MoO4.2H20 和CoCl2.6Η20依次溶解于蒸懼水中配制成1000 的母液4 ;配制培養(yǎng)基時取1ml母液I, Iml母液2、Iml母液3和Iml溶液4依次加入600ml水中，待充分攪拌后再加入另外一種，防治沉淀產(chǎn)生，最后補水至1L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速制備高密度高純藻種的方法，其特征在于:所述藻為單細胞綠藻或藍藻，或形成群體的綠藻或藍藻；對于形成較大群體的藻，用滅菌的勻漿器或研缽在不添加石英砂等輔助物的情況下輕輕研磨，以獲得單細胞或更小群體的接種物。
3.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:所述的三角瓶和玻璃管等玻璃儀器采用高溫高壓法滅菌，光生物反應器則在清洗晾干后，移入經(jīng)過紫外線殺菌的培養(yǎng)室內(nèi)，在內(nèi)壁噴灑75%的酒精進行滅菌，待晾干后，封口備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:所述三角瓶規(guī)格為50-500ml ;柱形玻璃培養(yǎng)管的直徑為2-5 cm，長度為30-80 cm，底部為U型或尖三角錐形；平板光生物反應器的光路徑為2-6cm，深度為50-100 cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:所用液體培養(yǎng)基為在蒸餾水或經(jīng)放置12h的自來水中添加以下營養(yǎng)鹽配制而成，各營養(yǎng)鹽的優(yōu)選用量如下:KNO3 0.44 gL-1，NaNO3 0.60 gL-1，KH2PO4 0.136 gL-1，Na2HPO4 0.142 gL-1，MgSO4.7H20 0.06-0.3 gL-1，CaCl2 0.03gL_1, NaHCO3 0.2 gL' FeCl2 7.542 mgL-1，Na2EDTA5 mgL'H3BO3 3.15 mgL-1, MnCl2 *H20 2 mgL-1, ZnSO4.7H20 0.222 mgL' CuSO4.5H20 0.08mgL \ Na2MoO4.2H20 0.041 mgL \ CoCl2.6H20 0.04 mgL、
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:藻在三角瓶中培養(yǎng)時置于搖床上搖動，速度為20-120 rmirT1，在玻璃管或光生物反應器中則通入經(jīng)孔徑為0.45 μπι濾膜過濾的氣體，流量為每升培養(yǎng)基0.04-2 L mirT1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:所述通入氣體為CO2和空氣的混合氣體，其中CO2所占體積比為0.2-5% ;體積比通過調(diào)節(jié)空氣和CO2的流速(流量計控制)；0)2氣體可以來自高壓鋼瓶(純度>99%)或其它含高濃度CO2的氣體，如經(jīng)處理過的火電廠煙道廢氣；C02的比例以控制溶液pH在6.5-8.5為宜，低于此范圍，則降低濃度，高于此范圍則增加濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:所述光強為三角瓶200-1200 lux，透明玻璃管1000-6000 lux，平板光生物反應器2000-10000 Iux ；強度通過調(diào)節(jié)光源功率大小(如日光燈管數(shù)目)或添加濾網(wǎng)遮光實現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種快速制備大量高純藻種的方法，其特征在于:光強調(diào)節(jié)時主要依據(jù)藻細胞密度，剛從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到10ml三角瓶中時，培養(yǎng)光強為200 lux,2-3天培養(yǎng)后，培養(yǎng)液呈明顯綠色，將光強提高到600 lux，培養(yǎng)兩天后光強升高到1200lux，再培養(yǎng)兩天后按1:5比例接種到直徑3cm，長60cm的玻璃管中，初始光強為1000 lux,2天后升高為3000 lux，培養(yǎng)2天后升高到6000 lux，再培養(yǎng)2天，此時藻生物量可達4-12g (dw)L-1 ;按照1:10比例轉(zhuǎn)入光路徑為3.5cm的平板光生物反應器中，起始光強設為20001ux,培養(yǎng)2天后提高至40001ux，培養(yǎng)2天后光強提高至80001ux，再培養(yǎng)兩天，藻生物量可達 4-8 g (dw)L'
10.通過此法獲得的藻種在藻類規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)魚蝦貝類的開口餌料、功能性食品、高附加值次生代謝產(chǎn) 物以及生物能源中的應用。
【文檔編號】C12N1/12GK104046566SQ201310082447
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月15日
【發(fā)明者】李運廣, 羅瑋, 汪靚, 伍陽, 朱艷紅 申請人:李運廣