大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型bac載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體及其構(gòu)建方法，該BAC載體含有多克隆位點(diǎn)MCS，Am抗性基因，整合酶基因int，整合位點(diǎn)attp，接合轉(zhuǎn)移片段oriT，BAC載體的復(fù)制區(qū)oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位點(diǎn)和loxP位點(diǎn)。本發(fā)明從pBeloBAC11出發(fā)，用Red同源重組技術(shù)將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉(zhuǎn)移（oriT）、定點(diǎn)整合（attp-int）和抗性篩選（Am）的oriT-attp-int-Am的DNA片段（稱之為替換盒），得到載體pBTIBAC1，為實(shí)現(xiàn)大片段基因簇在鏈霉菌中的異源表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體及其構(gòu)建方法，具體涉及一種可由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌并整合至其基因組的BAC載體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]鏈霉菌是微生物中產(chǎn)抗生素種類最多的種屬，目前世界上發(fā)現(xiàn)的5000多種抗生素中，60%以上是由鏈霉菌合成的，作為抗生素的生產(chǎn)菌，鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用有著悠久的歷史，而分子遺傳學(xué)的發(fā)展則為鏈霉菌的基因重組展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，自1980年首次報(bào)導(dǎo)鏈霉菌基因克隆以來，鏈霉菌基因工程日益興起。
[0003]載體作為基因工程的重要工具是鏈霉菌基因工程首先遇到的問題。起初科學(xué)家們根據(jù)對(duì)一部分鏈霉菌遺傳背景已有的認(rèn)識(shí)，構(gòu)建了一系列鏈霉菌質(zhì)粒和噬菌體克隆載體系統(tǒng)，后來為了研究鏈霉菌基因功能和構(gòu)建其基因文庫(kù)，須將鏈霉菌基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行一些遺傳操作，然后再轉(zhuǎn)移到某些模式鏈霉菌中作進(jìn)一步研究，于是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室紛紛開始構(gòu)建大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體，文獻(xiàn)記載最早的是1982年Richardson MA等構(gòu)建的大腸桿菌-鏈霉菌雙功能載體PFJ123，然后就是1989年Hill RT等構(gòu)建的大腸桿菌-鏈霉菌正篩選穿梭載體PLR591，國(guó)內(nèi)有關(guān)這方面較早的研究是譚華榮等1990年構(gòu)建的鏈霉菌和大腸桿菌穿梭質(zhì)粒載體 pSE-3。
[0004]與此同時(shí)鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)也開始建立，文獻(xiàn)記載較早的是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，包括PEG介導(dǎo)和脂質(zhì)體協(xié)助，但在實(shí)際應(yīng)用中常常遇到不少障礙，主要由于鏈霉菌特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，要么其原生質(zhì)體難以制備，要么其難以被外源質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化，還有電擊轉(zhuǎn)化法，效率也很低，自Trien-Cuot等人首次闡明大腸桿菌與許多革蘭氏陽性細(xì)菌之間可進(jìn)行質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，兩年后Mazodier發(fā)展了質(zhì)粒在大腸桿菌和鏈霉菌之間進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的方法，即在大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體上引入接合轉(zhuǎn)移順式作用元件oriT，將其轉(zhuǎn)化到攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌中，載著目的基因的載體就在RP4上的反式作用元件tra的誘導(dǎo)下由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移到鏈霉菌中去。這種方法不但易于操作，而且可避開鏈霉菌的甲基化限制作用，提高外源基因的存活率。
[0005]已有報(bào)導(dǎo)，重組質(zhì)粒在鏈霉菌中顯示結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，人們就嘗試構(gòu)建一種可整合至鏈霉菌基因組的載體，其中主要包括由Streptomyces ambofaciens質(zhì)粒pSAM2衍生和鏈霉菌噬菌體cpC31衍生的載體，而cpC31衍生載體因有較高的轉(zhuǎn)化效率而頗受偏愛，如PSET152就是由目前研究較熱的鏈霉菌噬菌體OC31的整合系統(tǒng)衍生而來的，即在載體上引入attP序列(phage attachment site)和整合酶基因(int),整合酶可介導(dǎo)attP與鏈霉菌基因組內(nèi)的attB (bacterial attachment site)間位點(diǎn)特異性重組,從而將整個(gè)載體包括外源基因整合進(jìn)鏈霉菌基因組中，使外源基因在沒有選擇壓力的情況下在鏈霉菌中穩(wěn)定存在，這可作為其用于大規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)極大的優(yōu)勢(shì)。
[0006]鏈霉菌基因組測(cè)序完成后人們發(fā)現(xiàn)，在鏈霉菌基因組中與某一天然產(chǎn)物生物合成途徑相關(guān)的基因往往成簇存在，因此都比較大(>60kb)，要想完整地克隆這些基因簇就必須要有能裝載大片段的載體。目前應(yīng)用較廣的大片段克隆載體有酵母人工染色體(YAC)和細(xì)菌人工染色體(BAC)，BAC的插入片段不如YAC長(zhǎng)，但其有很多優(yōu)點(diǎn)可彌補(bǔ)YAC的不足，這就使得其應(yīng)用和發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 YAC。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的是提供一種大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體，本發(fā)明成功構(gòu)建了一種可由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌，并整合至其基因組的穿梭型BAC載體pBTIBACll，以實(shí)現(xiàn)大片段基因簇在大腸桿菌中完成遺傳操作后轉(zhuǎn)移至鏈霉菌中異源表達(dá)。
[0008]本發(fā)明由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌的BAC載體，其含有多克隆位點(diǎn)MCS，安普抗性基因Am，整合酶基因int，整合位點(diǎn)attp，接合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)oriT，BAC載體的復(fù)制區(qū)oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位點(diǎn)和1xP位點(diǎn)。
[0009]多克隆位點(diǎn)(MCS )，序列如SEQ N0.1 ；
[0010]安普抗性基因(Am)，序列如SEQ N0.2 ；
[0011]整合酶基因(int)，序列如SEQ N0.3 ;
[0012]整合位點(diǎn)(attp)，序列如SEQ N0.4 ；
[0013]接合轉(zhuǎn)移片段(oriT)，序列如SEQ N0.5 ；
[0014]BAC載體復(fù)制區(qū)(oriS)，序列如SEQ N0.6 ；
[0015]BAC載體的repA基因，序列如SEQ N0.7 ；
[0016]BAC載體的sopA基因，序列如SEQ N08 ；
[0017]BAC載體的sopB基因，序列如SEQ N09 ；
[0018]BAC載體的sopC片段,序列如SEQ N010 ；
[0019]BAC載體的cos位點(diǎn)，序列如SEQ NOll ；
[0020]BAC載體的1xP位點(diǎn)，序列如SEQ N012。
[0021]所述的BAC載體pBTIBACll，其具有SEQ N0.13所示的序列。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明上述BAC載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明從原始載體pBeloBACll出發(fā)，將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉(zhuǎn)移(oriT)、定點(diǎn)整合(attp-1nt)和抗性篩選(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段(稱之為替換盒),為了精確替換，本發(fā)明采用了 Red同源重組的方法，即將一段兩端與染色體(或載體)特定靶序列兩翼各有40~60bp同源序列的PCR線性DNA片段導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞，利用λ噬菌體Red重組酶使該線性片段與靶序列發(fā)生同源重組，線性DNA片段即可替換靶序列，得到的替換子命名為pBTIBACl。其中Red重組酶由輔助質(zhì)粒pKD46攜帶，其表達(dá)受L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，且具有溫度敏感型的復(fù)制子，在溫度高于37°C時(shí)，自動(dòng)從宿主菌中清除。
[0023]為了驗(yàn)證pBTIBACl是否具有接合和整合的功能，在其原多克隆位點(diǎn)反向插入鏈霉菌的組成型啟動(dòng)子ermEPA和綠色熒光蛋白基因(GFP )，得到重組質(zhì)粒pBTIBACl-ermEPiP^GFP,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ET12567 (pUZ8002)(接合轉(zhuǎn)移供體菌)，再通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至變鉛青鏈霉菌中，通過EnSpire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀)和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果都顯示了綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明載體pBTIBACl具有預(yù)期的功能，為實(shí)現(xiàn)大片段基因簇在鏈霉菌中的異源表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
[0024]為便于以后使用，合成新的多克隆位點(diǎn)MCS，其上包含EcoR 1、Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa I ,BamH I酶切位點(diǎn)，通過EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相應(yīng)位點(diǎn)(插入原載體MCS的EcoR I和BamH I之間)，得到最終載體pBTIBACll (見圖1)。
[0025]其具體構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0026](I)首先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，5’端帶有待替換氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通過PCR擴(kuò)增出含接合轉(zhuǎn)移(oriT)、定點(diǎn)整合(attp-1nt)和抗性篩選(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段,稱之為替換盒；
[0027](2)將Red同源重組輔助質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)至含待替換質(zhì)粒pBeloBACll的大腸桿菌k-12 內(nèi)，得至Ij E.coli k_12/pBeloBACll/pKD46 ；
[0028](3)30°C培養(yǎng)Ε.coli k_12/pBeloBACll/pKD46 過夜，次日按 1:100 轉(zhuǎn)接，加入終濃度為0.2%的L-阿拉伯糖，30°C培養(yǎng)至0D_=0.4~0.6，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，將上述替換盒電轉(zhuǎn)至其中，通過安普抗性篩選得到氯霉素抗性基因被替換了的替換子，命名為pBTIBACl ；
[0029](4)體外合成鏈霉菌組成型啟動(dòng)子ermEP^，并與綠色熒光蛋白基因(GFP)正確連接，由EcoR I和BamH I酶切連入pBTIBACl，得到重組質(zhì)粒pBTIBACl_eGFP，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ET12567/pUZ8002 (接合轉(zhuǎn)移供體菌)，再通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至變鉛青鏈霉菌中，EnSpire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀)和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察都檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)；
[0030](5)合成新的多克隆位點(diǎn) MCS,其上包含 EcoR I > Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa 1、BamH I酶切位點(diǎn)，通過EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相應(yīng)位點(diǎn)，得到最終載體pBTIBAClI ο
[0031]本發(fā)明的BAC載體，具有以下特點(diǎn):
[0032]1.載體上的oriT片段，方便其由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌中，克服了鏈霉菌難于轉(zhuǎn)化和鏈霉菌嚴(yán)格限制系統(tǒng)的問題；
[0033]2.attP-1nt元件，可使插入的外源基因(簇)連同載體一起整合至鏈霉菌基因組中，提聞了外源基因(族)的穩(wěn)定性；
[0034]3.安普霉素抗性基因可用于載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和鏈霉菌的特異性篩選標(biāo)記；
[0035]4.保留了 BAC載體克隆大片段的特點(diǎn)；
[0036]5.保留了 LacZ，可使用藍(lán)白斑篩選重組克?。?br> [0037]6.已用綠色熒光蛋白驗(yàn)證其接合和整合功能；
[0038]7.重新合成了多克隆位點(diǎn)，方便外源片段的酶切連入。
[0039]本發(fā)明從pBeloBACll出發(fā)，用Red同源重組技術(shù)將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉(zhuǎn)移(oriT)、定點(diǎn)整合(attp-1nt)和抗性篩選(Am)的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段(稱之為替換盒)，得到載體pBTIBACl，用綠色熒光蛋白驗(yàn)證其功能后，又重新合成MCS插入原載體MCS的EcoR I和BamH I之間，得到載體pBTIBACll，為實(shí)現(xiàn)大片段的基因簇在大腸桿菌中完成遺傳操作后轉(zhuǎn)移至鏈霉菌中異源表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1是pBTIBACll結(jié)構(gòu)示意圖。
[0041] 圖2是pBTIBACll構(gòu)建的示意圖。
[0042]圖3是替換盒連pMD18T vector菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0043]圖4是陽性克隆質(zhì)粒BsaI酶切瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0044]圖5是替換子菌液PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0045]圖6是變鉛青鏈霉菌TK24轉(zhuǎn)化子的EnSpire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀)結(jié)果處理圖表。
[0046]圖7是變鉛青鏈霉菌1326轉(zhuǎn)化子的EnSpire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀)結(jié)果處理圖表。
[0047]圖8是變鉛青鏈霉菌TK2412#轉(zhuǎn)化子表達(dá)綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對(duì)照；12:TK2412#轉(zhuǎn)化子。
[0048]圖9是變鉛青鏈霉菌132617s轉(zhuǎn)化子表達(dá)綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對(duì)照；17:132617s轉(zhuǎn)化子。

【具體實(shí)施方式】
[0049]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0050]下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了列舉說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0051]在實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所使用試劑的來源、商品名以及必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0052]實(shí)施例中所用到的質(zhì)粒和菌株如下:
[0053]pMD18T vector為商品化載體，用于PCR膠回收產(chǎn)物的克隆和測(cè)序，購(gòu)于TaKaRa公司。
[0054]pBeloBACll (U-JIN KIM et al.(1996).“Construct1n and Characterizat1nof a Human Bacterial Artificial Chromosome Library，，GEN0MICS34, 213 - 218),本實(shí)施例中所使用的pBeloBACll (保存在E.coli k-12內(nèi))購(gòu)自NEB公司。
[0055]pESPBAC (Huang Huiying,Song Jie,Shang Guangdong (2010).“Construct1nof an E.col1-Streptomyces-Pseudomonas Shuttle Express1n BAC Vector，，.JOURNALOF NANJING NORMAL UNIVERSITY (Natural Science Edit1n).33 (2): 104-108)，用于替換盒擴(kuò)增模板，為南京師范大學(xué)尚廣東老師饋贈(zèng)。
[0056]pKD46 (Kiri 11 A.Datsenko and Barry L.Wanner (2000 ).u One-stepinactivat1n of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products，，.PNAS.97(12):6640-6645)，為Red同源重組輔助質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0057]pET28a-EGFP為擴(kuò)增GFP基因的模板，由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0058]E.coli DH5 α感受態(tài)用于DNA片段克隆，購(gòu)于北京康為生物科技有限公司。
[0059]Ε.coli ET12567 (pUZ8002) (Paget,M.S.B., L.Chamberlin, A.Atrih, S.J.Foster,and M.J.Buttner.1999.Evidence that the extracytoplasmic funct1n sigma factorsE is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3(2).J.Bacter1l.181:204 - 211.)為接合轉(zhuǎn)移供體菌，由上海交通大學(xué)陶美鳳博士饋贈(zèng)。
[0060]變鉛青鏈霉菌TK24和1326為接合轉(zhuǎn)移受體菌，由上海交通大學(xué)陶美鳳博士饋贈(zèng)。
[0061]ermEPlP2為鏈霉菌組成型啟動(dòng)子，序列由GenBank(登錄號(hào)為AB093584)獲得，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成部合成。
[0062]本發(fā)明的由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌的BAC載體pBTIBACll的構(gòu)建，請(qǐng)參見圖2。
[0063]一、載體平BTIBAC1的構(gòu)建(參見圖1)
[0064]1、以pESPBAC為模板，PCR擴(kuò)增替換盒
[0065]引物為:
[0066]P1
[0067]5jGGTCTC| TTATTCAGGCGTAGCAACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGC CTTAAAAAAAGT
CAGCCAATCGACTGGCGAGCG3，，
[0068]P2
[0069]SlGGTCTCl ACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAG GAAGCTAAAACCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG3，。
[0070]其中加邊框的為BsaI酶切位點(diǎn)(酶切后為5’突出端，且沒有酶切位點(diǎn)堿基殘留)，加下劃線的堿基序列為待替換氯霉素抗性基上下游同源臂，擴(kuò)增片段大小為3365bp。
[0071]PCR 體系(50 μ L):10 X KOD Buffer (K0D 緩沖液)5μ L,2mM dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸)5 μ L，25mM MgSO4 (硫酸鎂)2 μ L，1mM引物各1.5 μ L，模板I μ L，ddH20 (雙蒸水)33 μ L, KOD plus DNA 聚合酶 I μ L。PCR 反應(yīng)條件 94°C 2min, (94°C 15s，68°C 4min) 30cycles,68 °C 7min。
[0072]2、替換盒PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收，末端加A，連pMD18T載體，轉(zhuǎn)化DH5a
[0073]膠回收用AXYGEN膠回收試劑盒，操作按其說明書；末端加A反應(yīng)如下:PCR膠回收產(chǎn)物30 μ L，10mMdATP (三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸)0.2 μ L，1XDyNAzyme buffer(DyNAzyme 緩沖液)5 μ L，ddH2013.8 μ L，DyNAzyme II DNA 聚合酶 I μ L，72°C 20min ；TA 克隆反應(yīng)如下:末端加 A 后溶液 6.5 μ L，pMD18T vector (pMD18T 載體)1 μ L, Slout1nI7.5 μ L,16°C 30min。取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μ LDH5 a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。
[0074]3、轉(zhuǎn)化子菌液PCR鑒定，陽性克隆提質(zhì)粒酶切鑒定
[0075]菌液PCR如下:弓丨物P15，~GGTCICITATOGG03TAG(M-3，，P25，~GGICIU\CrA003GG03TATnT-3，，PCR體系(20 μ L):10XIA Buffer II OA緩沖澈5μ L，1(MVMR).8μ L，模板 I μ L，引物各 0.8μ L，dcH014 4μ L，TaKafe IA Taq DNA 聚合酶 0.2μ L。PCR 射牛:94°C 3tain, (94°C 30s,55°C 30s,72°C 4^^30^,72^ lQnin。
[0076]圖3是替換盒連pMD18T載體菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M:Trans5K Marker ；+:替換盒擴(kuò)增PCR膠回收產(chǎn)物；1~10:克隆菌液；陽性片段大小為3373bp。確定3#和7#為陽性克隆，提其質(zhì)粒，用BsaI酶切，反應(yīng)體系如下:10XNEBuffer4 (NEB緩沖液4)2 μ L，100XBSA0.2μ L，質(zhì)粒 10 μ L, ddH207.3 μ L, Bsa10.5 μ L, 37°C 3h，然后跑瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4，7#為陽性質(zhì)粒，命名為pMD18T-r印box。
[0077]4、pMD18T-替換盒質(zhì)粒測(cè)序
[0078]測(cè)序引物如下:
[0079]M13F GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG
[0080]M13R GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
[0081]WlF GGGCCTCGATCAGTCCAAGTG
[0082]W2F TTCCGCAACGAACTTGTCGAG
[0083]與理論序列用DNAssist2.2軟件作序列比對(duì)，結(jié)果正確。
[0084]5、替換盒從pMD18T_repbox上切下,用DpnI消化
[0085]用BsaI 酶切 pMD18T_repbox 質(zhì)粒，反應(yīng)體系如下:10XNEBuffer420 μ L,100XBSA02 μ L，質(zhì)粒100 μ L，ddH2073 μ L，BsaI5 μ L，37°C過夜，然后跑瓊脂糖凝膠電泳，并用AXYGEN膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物用DpnI酶切，反應(yīng)體系如下:膠回收產(chǎn)物80 μ L，10XNEBuffer420y L，ddH2070 y L，DpnI5y L，37°C放置 4h，用 AXYGEN PCR清潔試劑盒回收。
[0086]6、Ε.coli k-12/pBeloBACll轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及pKD46的轉(zhuǎn)化(可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)
[0087]電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備:
[0088]⑴接菌，搖過夜；
[0089]⑵按1:100 轉(zhuǎn)接，搖 2 ~2.5h, 0D600 約為 0.4 ；
[0090]⑶分裝到5mL預(yù)冷離心管，4°C 100g離心5min,倒去上清；
[0091]⑷用4mL預(yù)冷的無菌水重懸(注:操作要輕柔，不要吹打，上下翻轉(zhuǎn)即可)；
[0092](5) 40C 100g 離心 5min，倒去上清；
[0093](6)重復(fù)上一步驟2次；
[0094](7傭10%的甘油重懸，_70°C冰箱中保存。
[0095]電擊轉(zhuǎn)化:
[0096]取300ng的pKD46質(zhì)粒與上述制備好的50 μ L感受態(tài)細(xì)胞混合，加入預(yù)冷的0.1cm電擊杯中，電轉(zhuǎn)儀設(shè)置1.8kV5ms,電擊后迅速加入ImL預(yù)冷的無抗LB液體培養(yǎng)基將細(xì)菌洗出移至小試管中，搖約2h后將菌液涂布于LB+Cm (氯霉素)+Amp (氨芐青霉素)固體培養(yǎng)基平板上，37°C溫育14~18h，獲得的克隆即為轉(zhuǎn)化子，命名為E.coli k-12/pBeloBACll/PKD46。
[0097]7、替換盒電轉(zhuǎn)至E.coli k-12/pBeloBACll/pKD46及替換子的獲得
[0098]接50 μ L E.coli K_12/pBeloBACll/pKD46 至 5ml LB+Cm+Ap3(TC搖過夜；次日，取200 μ L過夜培養(yǎng)菌液接種到含有20ml液體LB+Cm+Ap培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C培養(yǎng)至OD600~0.3，加入終濃度0.2%L-阿拉伯糖，30°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約lh，至OD6tltl = 0.4-06,誘導(dǎo)表達(dá)Red重組酶；誘導(dǎo)完成后，將菌液于冰上放置20min左右，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)^fDpnI消化后的替換盒電轉(zhuǎn)至E.coli K-12/pBeloBACll/pKD46中，菌液涂布到LB+Am (安普霉素)平板，37°C過夜培養(yǎng)；挑單克隆，用特定的引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，設(shè)E.coli K-12/pBeloBACll/pKD46菌液為陽陰性對(duì)照，陰性條帶為811bp，陽性條帶為3406bp ；PCR結(jié)果見圖5，M:DL2000DNA Marker ;1~5:替換子菌液；-:陰性對(duì)照(K-12/pBeloBACll);陽性片段大小為3406bp，陰性片段大小為811bp。陽性菌42°C搖菌(清除pKD46)，提質(zhì)粒測(cè)序，序列正確的命名為pBTIBACl。
[0099]二、pBTIBACl 功能驗(yàn)證
[0100]PCR擴(kuò)增ermEPlP2和EGFP片段，分別連入pMD18T載體，測(cè)序正確后取正向連入的ermEP 1P2重組質(zhì)粒命名為pMD 18T_ermEP 1P2，反向連入的GFP重組質(zhì)粒命名為pMD 18T-GFP，將ermEPlP2從pMD18T_ermEPlP2切下連入pMD18T_GFP的相應(yīng)位點(diǎn)，所得重組質(zhì)粒命名為pMD18T-eGFP，再將ermEPlP2+GFP從其上切下，連入pBTIBACl相應(yīng)位點(diǎn)，所得重組質(zhì)粒命名為pBTIBACl-eGFP，將其通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化到變鉛青鏈霉菌TK24和1326中，得到的接合子可在含Am (50ug/mL)和萘啶酮酸(25ug/mL)的MS平板上傳代生長(zhǎng)三次，刮取接合子孢子至YEME(含50ug/mL安普霉素和25ug/mL萘啶酮酸)液體培養(yǎng)基30°C 200rpm培養(yǎng)72h，將接合子孢子搖出的菌液先用分光光度計(jì)測(cè)濃度，然后用EnSpire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀)檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)，以未轉(zhuǎn)化的變鉛青鏈霉菌菌液為空白對(duì)照，每一樣品加三個(gè)孔，參數(shù)設(shè)置為:激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)510nm，測(cè)量?jī)纱?，相?0s，第一次測(cè)量前振蕩10s，第二次測(cè)量前振蕩15s，所得數(shù)據(jù)取平均值后除以菌濃度繪制成圖表，結(jié)果見圖6、圖7。圖6是變鉛青鏈霉菌TK24轉(zhuǎn)化子的EnSpire酶標(biāo)儀結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)為樣品標(biāo)號(hào)，con為空白對(duì)照，I~12為轉(zhuǎn)化子；縱坐標(biāo)為EnSpire酶標(biāo)儀測(cè)量值/(0D_*1000)。圖7是變鉛青鏈霉菌1326轉(zhuǎn)化子的EnSpire酶標(biāo)儀結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)為樣品標(biāo)號(hào)，con為空白對(duì)照，I~17為轉(zhuǎn)化子；縱坐標(biāo)為EnSpire酶標(biāo)儀測(cè)量值/ (0D6CICI*1000)。
[0101]取TK2412#和132617s轉(zhuǎn)化子菌液用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見圖8、圖9，從左到右分別為明場(chǎng)、暗場(chǎng)和明暗疊加。圖8是變鉛青鏈霉菌TK2412#轉(zhuǎn)化子表達(dá)綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對(duì)照；12:11(2412#轉(zhuǎn)化子。圖9是變鉛青鏈霉菌132617s轉(zhuǎn)化子表達(dá)綠色熒光蛋白照片(1000倍鏡)，con:陰性對(duì)照；17:132617#轉(zhuǎn)化子。
[0102]三、MCS的插入得到載體pBTIBACll
[0103]由兩條寡核苷酸鏈退火得到，兩條寡核苷酸分別為:
[0104]5，AATTCCCTAGGTTAATTAAGTTTAAACATTTAAATG3，，
[0105]5，GATCCATTTAAATGTTTAAACTTAATTAACCTAGGG3，，對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別為EcoR1、Avr I1、Pac1、Pme1、Swa1、BamHI,通過 EcoRI 和 BamHI 酶切插入，得到最終載體pBTIBACll，其結(jié)構(gòu)示意圖參見圖1。
[0106]pBTIBACll 全長(zhǎng) 10117bp，其序列如 SEQ N0.13 所示，其中
[0107]333-374:多克隆位點(diǎn)(MCS);
[0108]1558-782:安普霉素抗性基因(Am)；
[0109]3520-1679:整合酶基因(int);
[0110]3537-3575:整合位點(diǎn)(attp);
[0111]3923-4034:接合轉(zhuǎn)移片段(oriT)；
[0112]4980-5046:BAC 載體的復(fù)制區(qū)(oriS)；
[0113]5375-6130:BAC 載體的 r印A 基因；
[0114]6718-7884:BAC 載體的 sopA 基因；
[0115]7884-8855:BAC 載體的 sopB 基因；
[0116]8928-9401 =BAC 載體的 sopC 片段；
[0117]9651-10059 =BAC 載體的 cos 位點(diǎn)；
[0118]10104-10110:BAC 載體的 1xP 位點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌的BAC載體，其特征在于，其含有多克隆位點(diǎn)MCS, Am抗性基因，整合酶基因int，整合位點(diǎn)attp，接合轉(zhuǎn)移片段oriT，BAC載體的復(fù)制區(qū)oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位點(diǎn)和1xP位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌的BAC載體，其特征在于，所述的BAC載體為pBTIBACll，其核苷酸序列如序列表中序列13所示。
3.權(quán)利要求1所述的由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌的BAC載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟: (O首先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，5’端帶有待替換氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通過PCR擴(kuò)增出含接合轉(zhuǎn)移oriT、定點(diǎn)整合attp-1nt和抗性篩選Am的oriT-attp-1nt-Am的DNA片段，稱之為替換盒； (2MfRed同源重組輔助質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)至含待替換質(zhì)粒pBeloBACll的大腸桿菌k_12內(nèi)，得到 Ecoli k-12/pBeloBACll/pKD46 ； (3)30°C培養(yǎng)E.coli k-12/pBeloBACll/pKD46過夜，次日按1:100轉(zhuǎn)接，加入終濃度為0.2%的L-阿拉伯糖，30°C培養(yǎng)至0D_=0.4~0.6，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，將上述替換盒電轉(zhuǎn)至其中，通過安普抗性篩選得到氯霉素抗性基因被替換了的替換子，命名為pBTIBACl ； (4)體外合成鏈霉菌組成型啟動(dòng)子ermEP^，并與綠色熒光蛋白基因GFP連接，由EcoR I和BamH I酶切連入pBTIBACl，得到重組質(zhì)粒pBTIBACl_eGFP，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ET12567/pUZ8002,再通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至變鉛青鏈霉菌中； (5)合成新的多克隆 位點(diǎn)MCS,其上包含EcoR1、Avr I1、Pac 1、Pme 1、Swa 1、BamH I酶切位點(diǎn)，通過EcoR I和BamH I酶切插入到pBTIBACl的相應(yīng)位點(diǎn)，得到最終載體pBTIBAClI ο
【文檔編號(hào)】C12N15/64GK104046648SQ201310083678
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月15日
【發(fā)明者】劉剛, 戴素琴, 陳惠鵬, 邢玉華, 張部昌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所