專利名稱：一種制備重組人干擾素α2b的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，尤其涉及一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。
背景技術：
隨著基因工程技術的發(fā)展，工程菌的發(fā)酵工藝得到極為廣泛的應用，生物工程菌發(fā)酵的目的是獲得大量的外源性的基因產物，盡可能減少宿主細胞及外來因素的污染，所以高密度、高產率高表達的培養(yǎng)已經成為發(fā)酵工業(yè)的目標和方向。在高密度表達方面，大腸桿菌是最具代表性及應用最廣的宿主菌，大腸桿菌中重組蛋白表達方式有二種，一種為組成型表達，一種為誘導性表達， 目前，在重組蛋白工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)中，大多為誘導性表達的菌種，其優(yōu)點在于通過溫度誘導或化學誘導，可使工程菌在短時間內迅速生長，達到高比生長速率，同時達到最大表達量，缺點在于在細菌迅速生長的過程中細菌的代謝產物也會迅速產生，如有機酸、二氧化碳等有害物質的迅速積累會抑制細菌的生長和產物的表達，而最大的副產物乙酸的產生，一般認為細菌在低比生長速率條件下，通過氧化代謝作用產生的能量中足以滿足合成和異化作用的需求，不會產生乙酸，而在高比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH，這樣就會過多產生乙酸，而酸的增加會對細菌繁殖及產物表達抑制作用，同時也會對后續(xù)提純帶來很大的負擔。大腸桿菌中重組蛋白的組成型表達方式是一種緩慢表達的方式，無需誘導，在細菌生長的過程中持續(xù)生長及表達，其生長周期內因沒有誘導迅速生長的過程，生長速度均勻，代謝產物中乙酸含量低，可獲得理想的產物表達率，但很難實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。因此，現(xiàn)有技術還有待于更進一步的改進和發(fā)展。

發(fā)明內容
鑒于上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，通過一種特定培養(yǎng)基及發(fā)酵過程的控制，實現(xiàn)組成型表達的重組人干擾素a 2b工程菌的高密度培養(yǎng)及高效表達。本發(fā)明的技術方案如下:
一種適用于組成型表達的重組人干擾素a 2b工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，其按照重量份其包括以下組分:
胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4_8份，磷酸二氫鉀2_4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇10-20份。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，胰蛋白胨濃度為25-35 g/L，酵母提取物的濃度為15-25g/L,磷酸氫二鈉濃度為4-8 g/L,磷酸二氫鉀濃度為2-4 g/L,氯化銨濃度為0.4-0.6g/L，氯化鈉濃度為0.4-0.6 g/L，硫酸鎂濃度為0.2-0.4g/L，氯化鈣濃度為0.05-0.15 g/L與丙三醇濃度為10-20g/L。一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵方法，其包括以下步驟:
A、按照重量份將胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4_8份，磷酸二氫鉀2-4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇10-20份加入發(fā)酵罐中，并向所述發(fā)酵罐中加入注射用水充分混合得到培養(yǎng)基;
B、再向所述發(fā)酵罐中加入磷酸與50%的氫氧化鈉溶液，調節(jié)所述培養(yǎng)基的PH值到7.0±0.2，然后再將工程菌菌種接種到所述培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述發(fā)酵罐中培養(yǎng)溫度為37°C，得到發(fā)酵產物；
C、將所述發(fā)酵產物采用低溫離心法得到菌體，并對所述菌體進行裂解及一系列提純，獲得重組人干擾素a 2b蛋白。所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其中，所述步驟B還包括:
B1、向所述發(fā)酵罐中加入所述磷酸，將所述培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至4.2±0.2，并在121°C條件下滅菌15分鐘；
B2、將滅菌后的所述培養(yǎng)基溫度控制在37°C，然后向所述發(fā)酵罐中加入50%的氫氧化鈉溶液，將所述培養(yǎng)基的PH值調整至7.0±0.2 ;
B3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中向所述發(fā)酵罐中適時加入磷酸與50%的氫氧化鈉溶液，控制所述培養(yǎng)基的PH值為7.0±0.2 ;隨著細菌生長培養(yǎng)基的溶解氧自90%逐漸降低至零。本發(fā)明提供了一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，以丙三醇為唯一碳源，以適量磷酸鹽濃度調整目的蛋白的表達速率，并將培養(yǎng)基于酸性條件下滅菌，減少滅菌時間以減少培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的流失，培養(yǎng)過程中以50%的磷酸及50%氫氧化鈉作為酸堿調節(jié)劑來調節(jié)發(fā)酵液的PH值，保證了工程菌良好的生長狀態(tài)，實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)和高效表達，本發(fā)明工藝簡單，代謝副產物少，有利于表達產物的后續(xù)提純，降低了重組人干擾素a 2b的制造成本。


圖1為本發(fā)明中發(fā)酵方法的流程示意 圖2為本發(fā)明中工程菌生長曲線與目的蛋白表達的動態(tài) 圖3為本發(fā)明中發(fā)酵產物的電泳圖譜的示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，為使本發(fā)明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種適用于組成型表達的重組人干擾素a 2b工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其按照重量份其包括以下組分:胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉
4-8份，磷酸二氫鉀2-4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇10-20份。更進一步的，胰蛋白胨濃度為25-35 g/L，酵母提取物的濃度為15-25 g/L，磷酸氫二鈉濃度為4-8 g/L,磷酸二氫鉀濃度為2-4 g/L,氯化銨濃度為0.4-0.6g/L，氯化鈉濃度為
0.4-0.6 g/L,硫酸鎂濃度為0.2-0.4g/L，氯化鈣濃度為0.05-0.15 g/L與丙三醇濃度為10-20g/L。以丙三醇為唯一碳源，以適量磷酸鹽濃度調整目的蛋白的表達速率，并將培養(yǎng)基于酸性條件下滅菌，減少滅菌時間以減少培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的流失，培養(yǎng)過程中以50%的磷酸及50%氫氧化鈉作為酸堿調節(jié)劑來調節(jié)發(fā)酵液的PH值，保證了工程菌良好的生長狀態(tài)，實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)和高效表達。本發(fā)明提供了一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵方法，如圖1所示的，其包括以下步驟:
步驟101:按照重量份將胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4_8份，磷酸二氫鉀2-4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣
0.05-0.15份與丙三醇10-20份加入發(fā)酵罐中，并向所述發(fā)酵罐中加入注射用水充分混合
得到培養(yǎng)基；
步驟102:再向所述發(fā)酵罐中加入磷酸與50%的氫氧化鈉溶液，調節(jié)所述培養(yǎng)基的PH值到7.0±0.2，然后再將工程菌菌種接種到所述培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述發(fā)酵罐中培養(yǎng)溫度為37°C，得到發(fā)酵產物；
步驟103:將所述發(fā)酵產物采用低溫離心法得到菌體，并對所述菌體進行裂解提純，獲得重組干擾素a 2b蛋白。其更為具體的:
先按照重量份將胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4_8份，磷酸二氫鉀2-4份，氯化銨0. 4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇10-20份加入發(fā)酵罐中，并向所述發(fā)酵罐中加入規(guī)定數(shù)量的注射用水充分混合溶解上述培養(yǎng)基。然后以50 %磷酸調整PH至4.2±0.2，121°C滅菌15分鐘；
在將上述培養(yǎng)基冷卻至37°C，以50%氫氧化鈉溶液調整PH到7.0±0.2，接種合適的工程菌種子液進行培養(yǎng)；
其中發(fā)酵過程中培養(yǎng)參數(shù)為:培養(yǎng)溫度37°C，pH值為7.0 土 0.2，溶解氧90 %，攪拌轉數(shù) 200rpm ；
培養(yǎng)過程中根據細菌生長環(huán)境的需要補加50 %磷酸和50 %.的氫氧化鈉調整pH值，泡沫用消泡劑來控制，最初溶解氧設定為90 %,隨著細菌生長溶解氧漸漸下降為零；
而當繼續(xù)培養(yǎng)至12 14小時，細菌的生長率和目的蛋白的合成量達到高峰時，停止培
養(yǎng);
最后，采用低溫離心法收集菌體，以SDS-PAGE電泳法及ELISA法檢測干擾素純度及含量，檢測合格后將對菌體進行裂解及提純，得到重組干擾素a 2b蛋白。更進一步的，所述步驟102還包括:
向所述發(fā)酵罐中加入所述磷酸，將所述培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至7.0 土 0.2，并在121°〇條件下滅菌15分鐘；
將滅菌后的所述培養(yǎng)基溫度控制在37°C，然后向所述發(fā)酵罐中加入50%的氫氧化鈉溶液，將所述培養(yǎng)基的PH值調整至7.0±0.2 ;
發(fā)酵培養(yǎng)過程中向所述發(fā)酵罐中適時加入磷酸與50%的氫氧化鈉溶液，控制所述培養(yǎng)基的PH值為7.0±0.2 ;隨著細菌生長培養(yǎng)基的溶解氧自90%逐漸降低至零。本發(fā)明工藝簡單，代謝副產物少，有利于表達產物的后續(xù)提純，降低了重組干擾素a2b的制造成本。為了更進一步描述本發(fā)明，以下列舉更具體的實施例進行說明。實施例1
發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:胰蛋白胨6000g，酵母提取物4000g，磷酸氫二鈉1200g，磷酸二氫鉀600g，氯化銨100g，氯化鈉100g，硫酸鎂60g，氯化鈣20g與丙三醇3000g。制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)方法包括以下步驟:
按照重量將上述組分制作成培養(yǎng)基；
在300L發(fā)酵罐中以適量的注射用水中溶解所述培養(yǎng)基，總體積定容至200L ；
以磷酸調整所述培養(yǎng)基的PH值至4.2±0.2，并在121°C條件下滅菌15分鐘；
然后再將所述培養(yǎng)基冷卻至37 °C，以50%氫氧化鈉溶液調整所述培養(yǎng)基PH值到7.0±0.2，接種重組人干擾素工程菌種子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)進行培養(yǎng)；
然后將接種后的所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度37土 0.5°C，pH值控制在7.0 土 0.2，攪拌速度200+/- 5 r.p.m ,通氣量0.5 vvm.,操作壓力0.5 atm.,溶解氧90 % min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)；并且根據細菌生長環(huán)境的需要定時補加50 %的磷酸和50 %的氫氧化鈉調整pH值在7.0 土 0.2;在發(fā)酵過程中產生泡沫時用消泡劑來控制；如圖2所示的，采用本發(fā)明方法實現(xiàn)了組合型表達的工程菌的高密度培養(yǎng)和目的蛋白的高效表達；
將上述培養(yǎng)基連續(xù)續(xù)培養(yǎng)至12 14小時，檢測OD6tltl為24.00，停止培養(yǎng)；
最后將停止培養(yǎng)后的所述培養(yǎng)基采用低溫離心法收集菌體，獲得菌體4370g，以SDS-PAGE電泳法檢測，蛋白表達量為30.9%，ELISA法檢測干擾素含量200.44g/L，對菌體進行裂解及提純后，可獲得重組干擾素a 2b蛋白。實施例2
發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:胰蛋白胨6000g，酵母提取物4000g，磷酸氫二鈉1200g，磷酸二氫鉀600g，氯化銨100g，氯化鈉100g，硫酸鎂60g，氯化鈣20g與丙三醇3000g。制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)方法包括以下步驟:
按照重量將上述組分制作成培養(yǎng)基；
在300L發(fā)酵罐中以適量的注射用水中溶解所述培養(yǎng)基，總體積定容至200L ；
以磷酸調整所述培養(yǎng)基的PH值至4.2±0.2，并在121°C條件下滅菌15分鐘；
然后再將所述培養(yǎng)基冷卻至37 °C，以50%氫氧化鈉溶液調整所述培養(yǎng)基PH值到
7.0±0.2，接種重組人干擾素工程菌種子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)進行培養(yǎng)；
然后將接種后的所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度37土 0.5°C，pH值控制在7.0 土 0.2，攪拌速度200 +/- 5 r.p.m ,通氣 量0.5 vvm.,操作壓力0.5 atm.,溶解氧90 % min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)；并且根據細菌生長環(huán)境的需要定時補加50 %的磷酸和50 %的氫氧化鈉調整pH值在7.0 土 0.2;在發(fā)酵過程中產生泡沫時用消泡劑來控制；如圖3所示的，采用本發(fā)明方法實現(xiàn)了組合型表達的工程菌的高密度培養(yǎng)和目的蛋白的高效表達；
將上述培養(yǎng)基連續(xù)續(xù)培養(yǎng)至12 14小時，檢測OD6tltl為25.20，停止培養(yǎng)；
最后將停止培養(yǎng)后的所述培養(yǎng)基采用低溫離心法收集菌體，獲得菌體5200g，以SDS-PAGE電泳法檢測，蛋白表達量為31.6%，ELISA法檢測干擾素含量253.38g/L，對菌體進行裂解及提純后，可獲得重組干擾素a 2b蛋白。
實施例3
發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:胰蛋白胨6000g，酵母提取物4000g，磷酸氫二鈉1200g，磷酸二氫鉀600g，氯化銨100g，氯化鈉100g，硫酸鎂60g，氯化鈣20g與丙三醇3000g。制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)方法包括以下步驟:
按照重量將上述組分制作成培養(yǎng)基；
在300L發(fā)酵罐中以適量的注射用水中溶解所述培養(yǎng)基，總體積定容至200L ；
以磷酸調整所述培養(yǎng)基的PH值至4.2±0.2，并在121°C條件下滅菌15分鐘；
然后再將所述培養(yǎng)基冷卻至37 °C，以50%氫氧化鈉溶液調整所述培養(yǎng)基PH值到
7.0±0.2，接種重組人干擾素工程菌種子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)進行培養(yǎng)；
然后將接種后的所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度37土 0.5°C，pH值控制在7.0 土 0.2，攪拌速度200 +/- 5 r.p.m ,通氣量0.5 vvm.,操作壓力0.5 atm.,溶解氧90 % min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)；并且根據細菌生長環(huán)境的需要定時補加50 %的磷酸和50 %的氫氧化鈉調整pH值在7.0 土 0.2;在發(fā)酵過程中產生泡沫時用消泡劑來控制；如圖2與圖3所示的，采用本發(fā)明方法實現(xiàn)了組合型表達的工程菌的高密度培養(yǎng)和目的蛋白的高效表達；
將上述培養(yǎng)基連續(xù)續(xù)培養(yǎng)至12 14小時，檢測OD6tltl為24.30，停止培養(yǎng)；
最后將停止培養(yǎng)后的所述培養(yǎng)基 采用低溫離心法收集菌體，獲得菌體4830g，以SDS-PAGE電泳法檢測，蛋白表達量為39.8%，ELISA法檢測干擾素含量445.67g/L，對菌體進行裂解及提純后，可獲得重組干擾素a 2b蛋白。為了更進一步凸顯本發(fā)明的先進性，以下列舉部分現(xiàn)有技術中的制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)方法，進行對比。實施例4
現(xiàn)有技術中重組干擾素a 2b工程菌培養(yǎng)基的組分為:胰蛋白胨20g/L、酵母提取物12g/L、葡萄糖13.7g/L、氯化鈉10g/L、磷酸氫二鉀2.3g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L與硫酸鎂
0.25g/L0現(xiàn)有技術中制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)方法包括以下步驟:
按照重量將上述組分制作成培養(yǎng)基；
在300L發(fā)酵罐中配制200L上述培養(yǎng)基；
以4摩爾氫氧化鈉調整所述培養(yǎng)基pH值為7.0 ±0.2，并在121 °C條件下滅菌30分鐘；將所述培養(yǎng)基冷卻至37°C，接種重組人干擾素工程菌種子液(pADUA-4/ K-12LE392工程菌)進行培養(yǎng)；
然后將接種后的所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為37土 0.5 0C 411值控制在7.0 ±0.2，攪拌速度250 +/- 5 r.p.m ,通氣量0.5 vvm,操作壓力0.5 atm.，溶解氧30-75 % min.的條件下發(fā)酵培養(yǎng)；并且根據細菌生長環(huán)境的需要定時補加50 %的氫氧化鈉調整pH值在7.0± 0.2 ;在發(fā)酵過程中產生泡沫時用消泡劑來控制；
將上述培養(yǎng)基連續(xù)續(xù)培養(yǎng)至14小時，檢測0D_為18.2時，停止培養(yǎng)；
最后將停止培養(yǎng)后的所述培養(yǎng)基采用低溫離心法收集菌體，獲得菌體2500g，以SDS-PAGE電泳法檢測，蛋白表達量為18.5%, ELISA法檢測干擾素含量145.22 mg/L，對菌體進行裂解及提純后，可獲得現(xiàn)有技術中重組干擾素a 2b蛋白。將實施例1、實施例2、實施例3獲得之重組干擾素a 2b蛋白與實施例4獲得之現(xiàn)有技術中重組干擾素a 2b蛋白進行檢測，將檢測結果列于表1，從表1、圖2與圖3中可看出實施例1、實施例2、實施例3的培養(yǎng)均值以及菌體重量可達到4.8kg，干擾素的表達量可達34.1%，ELISA檢測干擾素蛋白量為299.83，明顯優(yōu)于對照組實施例4的結果。
權利要求
1.一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵培養(yǎng)基，其按照重量份其包括以下組分: 胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4_8份，磷酸二氫鉀2_4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇10-20份。
2.根據權利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，胰蛋白胨濃度為25-35g/L，酵母提取物的濃度為15-25 g/L，磷酸氫二鈉濃度為4-8 g/L，磷酸二氫鉀濃度為2-4 g/L，氯化銨濃度為0.4-0.6g/L，氯化鈉濃度為0.4-0.6 g/L,硫酸鎂濃度為0.2-0.4g/L，氯化鈣濃度為0.05-0.15 g/L與丙三醇濃度為10-20g/L。
3.一種制備重組人干擾素a 2b的發(fā)酵方法，其包括以下步驟: A、按照重量份將胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4_8份，磷酸二氫鉀2-4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇IO - 2 O份加入發(fā)酵罐中，并向所述發(fā)酵罐中加入注射用水充分混合得到培養(yǎng)基; B、再向所述發(fā)酵罐中加入磷酸與50%的氫氧化鈉溶液，調節(jié)所述培養(yǎng)基的PH值到7.0±0.2，然后再將工程菌菌種接種到所述培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述發(fā)酵罐中培養(yǎng)溫度為37°C，得到發(fā)酵產物； C、將所述發(fā)酵物采用低溫離心法得到菌體，并對所述菌體進行裂解提純，獲得重組干擾素a 2b蛋白。
4.根據權利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟B還包括: B1、向所述發(fā)酵罐中加入所述磷酸，將所述培養(yǎng)基的PH值調節(jié)至4.2±0.2，并在121°C條件下滅菌15分鐘； B2、將滅菌后的所述培養(yǎng)基溫度控制在37°C，然后向所述發(fā)酵罐中加入50%的氫氧化鈉溶液，將所述培養(yǎng)基的PH值調整至7.0±0.2 ; B3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中向所述發(fā)酵罐中適時加入磷酸與50%的氫氧化鈉溶液，控制所述培養(yǎng)基的PH值為7.0±0.2 ;隨著細菌生長培養(yǎng)基的溶解氧自90%逐漸降低至零。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備重組人干擾素α2b的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，包括一種適用于組成型表達的重組人干擾素α2b工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其發(fā)酵培養(yǎng)方法，發(fā)酵培養(yǎng)基配方其按照重量份其包括以下組分胰蛋白胨25-35份，酵母提取物15-25份，磷酸氫二鈉4-8份，磷酸二氫鉀2-4份，氯化銨0.4-0.6份，氯化鈉0.4-0.6份，硫酸鎂0.2-0.4份，氯化鈣0.05-0.15份與丙三醇10-20份，發(fā)酵方法的培養(yǎng)過程中以丙三醇為唯一碳源，以適量磷酸鹽濃度調整目的蛋白的表達速率，保證了工程菌良好的生長狀態(tài)，實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)和高效表達。
文檔編號C12P21/02GK103146787SQ201310084878
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權日2013年3月18日
發(fā)明者郭德本, 劉芃實, 劉長春, 賀永山, 卡特琳娜·阿爾瓦斯 申請人:長春海伯爾生物技術有限責任公司