調(diào)控水稻開花時(shí)間和育性的基因OsRRMh及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首次揭示了OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸與水稻開花時(shí)間、結(jié)實(shí)率或穗型有關(guān)。所述多肽或編碼多核苷酸可用于改善水稻的性狀或制備轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明的OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸及使用方法對(duì)于水稻栽培具有廣泛應(yīng)用價(jià)值，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻性狀或者研究水稻的性狀提供了很好的平臺(tái)。
【專利說明】調(diào)控水稻開花時(shí)間和育性的基因 OsRRMh及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及利用OsRRMh基因及其蛋白控制 水稻開花時(shí)間和育性的方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] Split ends (Spen)家族蛋白是一類由N端的RRM結(jié)構(gòu)域和C端的1個(gè)SP0C結(jié)構(gòu) 域構(gòu)成的分子量很大的蛋白[1，2]。Spen基因在神經(jīng)發(fā)育研究中最先被克隆，spen果蠅突 變體呈現(xiàn)多樣的免疫缺陷表型[1，3]。Spen蛋白利用其RRM結(jié)構(gòu)域結(jié)合到特定的RNA片段 上，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的修飾等進(jìn)而起到共激活子的作用，并調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)水平。
[0003] 在真核生物中，RNA結(jié)合蛋白（RBP)在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的調(diào)控涉及可變剪接、多 聚腺苷?；?、RNA穩(wěn)定性及RNA輸出等所有方面。它們通過調(diào)節(jié)特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)對(duì)許多 發(fā)育過程起著調(diào)控作用[4]。盡管對(duì)動(dòng)物中RBP的功能鑒定有越來越多的報(bào)道，但對(duì)植物而 言，對(duì)RBP編碼基因的克隆和功能分析還非常少。
[0004] RiceRBP數(shù)據(jù)庫為研究水稻中的RNA結(jié)合蛋白提供了便利條件。根據(jù)Morris等
[5] 2011年的報(bào)道，此數(shù)據(jù)庫中至少包含有由221個(gè)基因編碼的257個(gè)已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過有 功能的RNA結(jié)合蛋白。數(shù)據(jù)庫中收錄的大多數(shù)蛋白與RNA的結(jié)合能力都未得到證實(shí)，目前 只能預(yù)測(cè)出它們可以結(jié)合RNA。我們預(yù)測(cè)其將大力推動(dòng)對(duì)植物中的RNA結(jié)合蛋白的研究。
[0005] 對(duì)擬南芥中的一個(gè)Spen家族蛋白FPA的最新研究[6]揭示，其與另一個(gè)RNA結(jié)合 蛋白FCA在控制mRNA不同模式3'末端形成上是功能冗余的。FPA和FCA通過控制開花抑 制因子FLC(Flowering Locus C)不同模式的3'多聚腺苷?；男纬啥{(diào)節(jié)開花時(shí)間。在 擬南芥中對(duì)FPA、FCA和FLC的功能研究比較詳細(xì)，但在水稻中Spen基因還未見研究。
[0006] 水稻（Oryza sativa)是重要的禾谷類作物，特別是對(duì)于我國(guó)這樣人口眾多的國(guó)家 尤其具有重要意義。因此，本領(lǐng)域急需了解水稻中Spen家族蛋白對(duì)于水稻開花、育性、結(jié)實(shí) 等諸方面的作用，進(jìn)而能夠針對(duì)性地改造現(xiàn)有的水稻。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于揭示與水稻開花時(shí)間、結(jié)實(shí)率或穗型有關(guān)的OsRRMh多肽或其 編碼多核苷酸；所述多肽或編碼多核苷酸可用于改善水稻的性狀或制備轉(zhuǎn)基因水稻；因而 本發(fā)明對(duì)于水稻栽培具有廣泛應(yīng)用價(jià)值，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻性狀或者研究水稻的性狀 提供了很好的平臺(tái)。
[0008] 在第一方面，本發(fā)明提供一種分離的OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的用途，所述 多肽或多核苷酸用于改善水稻的性狀，所述水稻的性狀包括水稻開花時(shí)間、結(jié)實(shí)率、穗型； 或者，
[0009] 所述多肽或多核苷酸用于制備轉(zhuǎn)基因水稻。
[0010] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述改善水稻的性狀包括延遲水稻開花時(shí)間、提高或降低 水稻的結(jié)實(shí)率、增大或減小水稻的穗型；或者 toon] 所述轉(zhuǎn)基因水稻的開花時(shí)間延遲、結(jié)實(shí)率提高或降低、穗型增大或減小。
[0012] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述改善水稻的性狀包括提高水稻的結(jié)實(shí)率、增大水 稻的穗型；或者
[0013] 所述轉(zhuǎn)基因水稻的結(jié)實(shí)率提高、穗型增大；
[0014] 從而提1?水稻的廣量。
[0015] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽或多核苷酸具有以下特征：
[0016] 所述多肽是：⑴具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；或（ii)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有 OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0017] 所述多核苷酸是：⑴具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0018] 在第二方面，本發(fā)明提供一種改善水稻性狀的方法，所述方法包括：促進(jìn)或抑制水 稻中OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的表達(dá)或活性。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述改善水稻的性狀包括延遲水稻開花時(shí)間、提高或降低 水稻結(jié)實(shí)率、增大或減小水稻的穗型。
[0020] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽是：（i)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多 肽；或（ii)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0021] 所述多核苷酸是：⑴具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0022] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括：抑制水稻中OsRRMh多肽或其編碼多核 苷酸的表達(dá)或活性。
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過RNAi、反義RNA、基因敲除、或基因失活等方法來抑制 OsRRMh多肽的表達(dá)或活性。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過外源性導(dǎo)入OsRRMh多肽的編碼多核苷酸來促進(jìn) OsRRMh多肽的表達(dá)或活性。
[0025] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用SEQ ID N0:57所示的dsRNA抑制水稻中OsRRMh 多肽或其編碼多核苷酸的表達(dá)或活性。
[0026] 在第三方面，本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法，所述方法包括步驟：
[0027] (a)促進(jìn)或抑制水稻細(xì)胞中OsRRMh多肽的編碼多核苷酸的表達(dá)；和
[0028] (b)培養(yǎng)（a)所述的水稻細(xì)胞，將其再生成水稻。
[0029] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽是：（i)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多 肽；或（ii)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0030] 所述多核苷酸是：⑴具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0031] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括步驟：
[0032] (a)通過RNAi、反義RNA、基因敲除、或基因失活等方法抑制水稻細(xì)胞中OsRRMh多 肽的編碼多核苷酸；和
[0033] (b)培養(yǎng)（a)得到的水稻細(xì)胞，將其再生成水稻。
[0034] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括步驟：
[0035] (a)利用SEQ ID N0:57所示的dsRNA抑制水稻細(xì)胞中OsRRMh多肽的編碼多核苷 酸；和
[0036] (b)培養(yǎng)（a)得到的水稻細(xì)胞，將其再生成水稻。
[0037] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括步驟：
[0038] (a)將OsRRMh多肽的編碼多核苷酸導(dǎo)入水稻細(xì)胞；和
[0039] (b)培養(yǎng)（a)得到的水稻細(xì)胞，再生成水稻。
[0040] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括步驟：
[0041] (a)提供OsRRMh多肽的編碼多核苷酸的表達(dá)載體；
[0042] (b)將（a)的表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌；
[0043] (c)將水稻細(xì)胞或組織或器官與（b)的農(nóng)桿菌接觸，從而使OsRRMh多肽的編碼多 核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞、組織或器官；
[0044] (d)篩選轉(zhuǎn)入OsRRMh多肽的編碼多核苷酸的水稻細(xì)胞或組織或器官；和
[0045] (e)將步驟（d)的水稻細(xì)胞或組織或器官再生成水稻。
[0046] 在第四方面，本發(fā)明提供OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑的用途，所述 OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑可用于延遲水稻開花時(shí)間、提高水稻的結(jié)實(shí)率、增 大水稻的穗型。
[0047] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽是：（i)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多 肽；或（ii)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0048] 所述多核苷酸是：⑴具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0049] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑是SEQ ID NO:57 所示的 dsRNA。
[0050] 在第五方面，本發(fā)明提供一種OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑，所述拮抗 劑抑制或下調(diào)OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的活性或表達(dá)。
[0051] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述拮抗劑是dsRNA。
[0052] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述dsRNA的序列如SEQ ID NO:57所示。
[0053] 在第六方面，本發(fā)明提供一種篩選OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的促進(jìn)劑或拮 抗劑的方法，所述方法包括以下步驟：
[0054] a)將待測(cè)物質(zhì)給予水稻；
[0055] b)檢測(cè)水稻中OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的活性或表達(dá)情況；
[0056] 如果與未給予待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照水稻相比，所述OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的 活性或表達(dá)上調(diào)，則所述待測(cè)物質(zhì)是OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的促進(jìn)劑；
[0057] 如果與未給予待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照水稻相比，所述OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的 活性或表達(dá)下調(diào)，則所述待測(cè)物質(zhì)是OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑。
[0058] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽是：（i)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多 肽；或（ii)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0059] 所述多核苷酸是：（i)具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0060] 在第七方面，本發(fā)明提供OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的用途，所述OsRRMh多肽 或其編碼多核苷酸用于制備預(yù)測(cè)水稻性狀的試劑或試劑盒，所述水稻性狀包括開花早晚、 結(jié)實(shí)率或穗型。
[0061] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽是：（i)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多 肽；或（ii)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0062] 所述多核苷酸是：（i)具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0063] 在第八方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)水稻性狀的方法，所述水稻性狀包括開花早晚、 結(jié)實(shí)率或穗型，所述方法包括以下步驟：
[0064] (a)檢測(cè)待測(cè)水稻中OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的活性或表達(dá)；和
[0065] (b)將（a)檢測(cè)到的OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的活性或表達(dá)值與標(biāo)準(zhǔn)品的相 應(yīng)檢測(cè)值比較；
[0066] 如果（a)的檢測(cè)值顯著高于標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)值，則所測(cè)水稻有可能結(jié)實(shí)率降低、或 穗型減??；
[0067] 如果（a)的檢測(cè)值顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)值，則所測(cè)水稻有可能開花延遲、結(jié)實(shí) 率提高、或穗型增大。
[0068] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法還包括：（c)根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果選擇有可能結(jié)實(shí)率提 高、或穗型增大的水稻作為候選水稻以供進(jìn)一步測(cè)定。
[0069] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽是：（i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多 肽；或（ii)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有OsRRMh多肽功能的由（i)衍生的多肽；或
[0070] 所述多核苷酸是：（i)具有SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO: 1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
[0071] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0072] 圖1顯示OsRRMh基因的序列、結(jié)構(gòu)示意及基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果。其中，A ：OsRRMh 基因 （SEQ ID N0:1)及其編碼蛋白（SEQ ID NO:2)的全長(zhǎng)序列。內(nèi)含子序列用小寫字母表 示。Southern blot標(biāo)記探針片段用下劃線標(biāo)出；B :Southernblot分析OsRRMh基因在水稻 基因組中的拷貝數(shù)；C:0sRRMh結(jié)構(gòu)示意圖。數(shù)字表示內(nèi)含子在基因中的位置（翻譯起始點(diǎn) ATG的A作為+1位)
[0073] 圖2顯示OsRRMh在ZH11中的表達(dá)模式。其中，A :qRT_PCR檢測(cè)OsRRMh在水稻各組 織中的表達(dá)；B :用Western blot檢測(cè)ZH11各組織部位中OsRRMh蛋白的表達(dá)水平。OsRRMh 蛋白的分子量為97kD ;陽性對(duì)照是在BL21 (DE3)中表達(dá)的帶His標(biāo)簽的OsRRMh蛋白。
[0074] 圖3顯示了 OsRRMh mRNA形成過程中存在可變剪切。其中，A :Northernblot方法 檢測(cè)到水稻不同組織中OsRRMh存在不同轉(zhuǎn)錄本；B :0sRRMh可變剪切產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)錄本的 剪切模式；黑框顯示為檢測(cè)到的cDNA片段。剪切模式圖右側(cè)標(biāo)注對(duì)應(yīng)條帶大小。模式圖中 用數(shù)字標(biāo)注內(nèi)含子的位置信息（翻譯起始點(diǎn)ATG的A作為+1位）。
[0075] 圖4顯示了 OsRRMh下調(diào)表達(dá)植株的表型分析。其中，A :0sRRMh下調(diào)表達(dá)質(zhì)粒 pRiG-OsRRMh的構(gòu)建圖；B :0sRRMh下調(diào)表達(dá)植株的開花延遲表型；C :qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因 植株中OsRRMh的下調(diào)表達(dá)程度；pRiG，轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pRiG的轉(zhuǎn)基因植株；1-3, T2代OsRRMh dsRNAi獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株；D :0sRRMh下調(diào)表達(dá)植株的穗型變化；E :對(duì)OsRRMh下調(diào)表達(dá)植 株開花時(shí)間和每穗粒數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*和**分別表示用t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示為 P〈0. 05或P〈0. 01的差異顯著或極顯著。下同此描述。
[0076] 圖5顯示了 OsRRMh下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片組織中控制水稻開花時(shí)間基因的表 達(dá)程度變化。其中，pRiG為轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pRiG的轉(zhuǎn)基因植株；1-3, T2代OsRRMh dsRNAi獨(dú) 立轉(zhuǎn)基因植株。
[0077] 圖6顯示了 OsRRMh或其SP0C結(jié)構(gòu)域過量表達(dá)植株的表型分析。其中，A : ρΗΒ-OsRRMh構(gòu)建圖；B :pHB-〇sRRMh轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為穗型變小和結(jié)實(shí)率降低；C :qRT-PCR 分析轉(zhuǎn)基因植株中OsRRMh的表達(dá)；1-3代表pHB-〇sRRMh T2代轉(zhuǎn)基因純合株；D :0sRRMh過 量表達(dá)植株的每穗著粒數(shù)和結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；E :pHB-〇sRRMh SP0C轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出結(jié)實(shí) 率降低和小穗表型；F :qRT_PCR檢測(cè)SP0C過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中SP0C構(gòu)域的表達(dá)水平；G :SP0C結(jié)構(gòu)域過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的每穗著粒數(shù)和結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；Η和I分別為SP0C過 量表達(dá)和對(duì)照轉(zhuǎn)基因植株花粉在1%Ι2-ΚΙ溶液中的染色結(jié)果；Β和Ε的標(biāo)尺為lcm，Η和I的 標(biāo)尺為10 μ m ;Β和Ε中的紅色箭頭指示不育的小花穗，Η中指示不育的花粉顆粒。
[0078] 圖7顯示了在fpa(Ler)和Col-Ο中過量表達(dá)OsRRMh的表型分析。其中，A :在 擬南芥fpa中過量表達(dá)OsRRMh產(chǎn)生的表型；B :半定量RT-PCR分析fpa+35s: :OsRRMh中 OsRRMh和FPA的表達(dá)水平；C :Col-0中過量表達(dá)OsRRMh造成晚開花；D :Col+35s: : OsRRMh 相比Col-Ο在蓮座葉數(shù)和延遲開花天數(shù)上的差異；1-5代表獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株篩選到的T3代 純合植株；E :半定量RT-PCR檢測(cè)自主開花控制途徑部分基因的表達(dá)水平。
[0079] 圖8顯示了水稻中的Spen-like蛋白組成元件及序列同源性。其中，A :由OsRRM、 OsRRMh、0s01g0765300編碼的水稻Spen-like蛋白的構(gòu)成特征；B :用MEGA4[7]對(duì)水稻 和擬南芥中的Spen-like蛋白作系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；所用算法為Neighbor-Joining(NJ)， bootstrap重復(fù)為1000。系統(tǒng)進(jìn)化樹中所顯示數(shù)字代表占 bootstrap值的百分比（%)。標(biāo) 尺標(biāo)注進(jìn)化距離。C、D、E :水稻與擬南芥中的Spen-like蛋白之間分別進(jìn)行RRM結(jié)構(gòu)域和 SP0C結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)。
[0080] 圖9顯示了對(duì)水培30天ZH11小苗在不同光照周期處理下OsRRMh的表達(dá)進(jìn)行分 析。其中，A :長(zhǎng)日照條件下（14小時(shí)光照，10小時(shí)黑暗）0sRRMh的表達(dá)模式；B:在短日照條 件下（10小時(shí)光照，14小時(shí)黑暗）0sRRMh的表達(dá)模式。白色、黑色標(biāo)尺分別顯示光照和黑暗 時(shí)間。
[0081] 圖10顯示了 OsRRMh參與調(diào)控水稻開花時(shí)間的模式圖。

【具體實(shí)施方式】
[0082] 發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)OsRRMh下調(diào)表達(dá)造成轉(zhuǎn)基因植 株開花延遲、每穗粒數(shù)變多以及穗變大，而OsRRMh或其SP0C編碼結(jié)構(gòu)域的過量表達(dá)會(huì)造成 轉(zhuǎn)基因植株育性降低、穗型變小和結(jié)實(shí)率明顯降低；因此，對(duì)OsRRMh進(jìn)行調(diào)控就可能對(duì)水 稻的各種性狀，例如開花時(shí)間、穗型以及結(jié)實(shí)率等等進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)控水稻及稻米的產(chǎn)量 和質(zhì)量。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0083] 本文所用的術(shù)語"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物 質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離 純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離 純化的。因此，本文所用的術(shù)語"分離的OsRRMh多肽"是指OsRRMh蛋白基本上不含天然與 其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù) 純化OsRRMh蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
[0084] 本文所用的術(shù)語"OsRRMh多肽"或"OsRRMh蛋白"具有相同的含義，表示氨基酸序 列如SEQ ID N0:2所示的多肽，而其編碼多核苷酸表示SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸。然 而，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)以及現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白該術(shù)語包括OsRRMh蛋白的 變異形式，所述變異形式具有與OsRRMh蛋白相同或相似的功能，但其氨基酸序列與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列有少量差異。這些變異形式包括（但不限于）：一個(gè)或多個(gè)（通常為 1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè)）氨基酸 的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或多個(gè)（通常為20個(gè)以內(nèi)， 較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi)）氨基酸。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，用性能相近 或相似的氨基酸進(jìn)行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時(shí)，不會(huì)改變所得蛋白質(zhì)的功 能。再例如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，例如為便于分離而添加的標(biāo)簽 通常不會(huì)改變所得蛋白質(zhì)的功能。
[0085] 多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突 變體、在高或低的嚴(yán)格性條件下能與OsRRMh蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用 抗OsRRMh蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含OsRRMh蛋 白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了 OsRRMh蛋白的可溶性片 段。通常，該片段具有OsRRMh蛋白序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù) 氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100 個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0086] 本發(fā)明還提供OsRRMh蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然OsRRMh蛋白的差 別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。 這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射 或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類 似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物，以及具有非天然 存在的或合成的氨基酸（如β、氨基酸）的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上 述例舉的代表性的多肽。
[0087] 修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。
[0088] 在本發(fā)明中，"OsRRMh蛋白保守性變異多肽"指與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列相 t匕，有至多20個(gè)，較佳地至多10個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或 相近的氨基酸所替換而形成多肽。
[0089] 因此，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)，例如下表所示進(jìn)行 氨基酸替換而產(chǎn)生保守性變異的突變體。
[0090]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的用途，其中，所述多肽或多核苷酸用于 改善水稻的性狀，所述水稻的性狀包括水稻開花時(shí)間、結(jié)實(shí)率、穗型；或者， 所述多肽或多核苷酸用于制備轉(zhuǎn)基因水稻。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述改善水稻的性狀包括提高水稻的結(jié)實(shí) 率、增大水稻的穗型；或者 所述轉(zhuǎn)基因水稻的結(jié)實(shí)率提高、穗型增大； 從而提高水稻的產(chǎn)量。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述多肽或多核苷酸具有以下特征： 所述多肽是：（i)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；或（ii)由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有OsRRMh 多肽功能的由（i)衍生的多肽；或 所述多核苷酸是：（i)具有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸；或（ii)具有與SEQ ID NO :1所示序列互補(bǔ)的多核苷酸。
4. 一種改善水稻性狀的方法，所述方法包括：促進(jìn)或抑制水稻中OsRRMh多肽或其編碼 多核苷酸的表達(dá)或活性。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：抑制水稻中OsRRMh多肽或 其編碼多核苷酸的表達(dá)或活性。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用SEQ ID NO :57所示的dsRNA抑制水稻 中OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的表達(dá)或活性。
7. -種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其中，所述方法包括步驟： (a) 促進(jìn)或抑制水稻細(xì)胞中OsRRMh多肽的編碼多核苷酸的表達(dá)；和 (b) 培養(yǎng)（a)所述的水稻細(xì)胞，將其再生成水稻。 8. OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑的用途，其特征在于，所述OsRRMh多肽或其 編碼多核苷酸的拮抗劑可用于延遲水稻開花時(shí)間、提高水稻的結(jié)實(shí)率、增大水稻的穗型。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗 劑是 SEQ ID NO :57 所示的 dsRNA。
10. -種OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的拮抗劑，其特征在于，所述拮抗劑抑制或下 調(diào)OsRRMh多肽或其編碼多核苷酸的活性或表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104045697SQ201310084884
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月15日
【發(fā)明者】蔡秀玲, 劉德瑞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院