專利名稱：一種海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的固定化方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
瑞士乳桿菌屬于乳酸桿菌屬，革蘭氏陽性菌，主要用于干酪的制造。近年來研究發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌有較強(qiáng)的乳蛋白水解活性，其菌株制作的發(fā)酵乳具有較強(qiáng)的降血壓功能，主要是因?yàn)槿鹗咳闂U菌蛋白酶能水解蛋白產(chǎn)生多肽，即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽。ACE抑制肽作為一類具有抑制ACE活性的肽類物質(zhì)，通過抑制ACE的活性，阻礙有升高血壓作用的血管緊張素II的生成，同時(shí)抑制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解，從而使高血壓下降，達(dá)到降血壓的功能。目前用于治療高血壓的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑(如卡托普利、阿拉普利等)，都是一些化學(xué)合成物，因吸收排泄速度快，會引起咳嗽，腎臟損傷及血管神經(jīng)性水腫等副作用；而來源于乳蛋白的ACE抑制肽，其降壓效果雖不及合成藥物強(qiáng)烈，但無此副作用，
安全可靠。目前，關(guān)于利用瑞士乳桿菌蛋白酶直接水解乳蛋白制備ACE抑制肽有一些報(bào)導(dǎo)，但是利用游離的瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳蛋白存在一定的弊端:(1)酶不能重復(fù)利用；(2)難以將產(chǎn)物和酶分離，從而需要進(jìn)一步純化；(3)游離酶不易保存，易失活而增加成本等。這一系列弊端使ACE抑制肽的大規(guī)模生產(chǎn)存在成本高而不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明提供一種利用海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法。海操酸鈉是由α -L-古洛糖醒酸鈉(a -L-guluronate,簡稱G)和β -D-甘露糖醒酸鈉(β -D-mannuronate,簡稱 Μ) 1、4連接的長鏈線性多糖,海藻酸鹽分子鏈G塊容易與Ca2+作用，2條分子鏈G塊間形成一個(gè)洞，結(jié)合Ca2+外形成蛋盒模型，形成熱不可逆凝膠，具有較好的生物相容性和生物可降解性，從而將瑞士乳桿菌蛋白酶固定化在凝膠網(wǎng)絡(luò)中。利用海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)的雙重固定作用，可實(shí)現(xiàn)瑞士乳桿菌蛋白酶的重復(fù)利用，并為其它酶制劑的固定化提供研究基礎(chǔ)；將固定化瑞士乳桿菌蛋白酶作為制備ACE抑制肽的載體，可實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的連續(xù)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的:本發(fā)明的目的是提供一種海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法，得到的固定化瑞士乳桿菌蛋白酶可重復(fù)利用。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法是，瑞士乳桿菌經(jīng)過液體培養(yǎng)后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液離心分離得到菌體，將菌體懸浮于Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行超聲波破碎，破碎液離心后取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶酶液。在蛋白含量為4mg/mL 12mg/mL的瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入海藻酸鈉，海藻酸鈉的終質(zhì)量濃度為1.5% 2.0%,混勻后用注射器滴入氯化鈣溶液中，固化洗滌后加入戊二醛溶液交聯(lián)，再洗滌浙干，即得到固定化蛋白酶。上述方法中固定化步驟如下:在瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入海藻酸鈉，37°C水浴攪拌混勻；用注射器吸取混合液，滴入0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球；4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.2% 0.8%的戊二醛溶液交聯(lián)6h ;洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。本發(fā)明提供的海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法包括下列步驟:(I)瑞士乳桿菌菌體的制備:將-80°C冷藏的瑞士乳桿菌凍干粉接種于MRS液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801g，磷酸氫二鉀2g，無水乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，水合硫酸鎂0.5g，水合硫酸錳0.05g，蒸餾水1L，121°C高溫滅菌20min)，連續(xù)活化3代，在37°C下擴(kuò)大培養(yǎng)至生長對數(shù)期取出。4°C，4500r/min，離心20min，收集菌體。用pH7.1Tris-HCl緩沖液(50mmol/L)洗滌菌體，混勻后在4°C，4500r/min,離心20min,收集菌體,菌體重復(fù)洗漆3次,冷藏備用。(2)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備:用pH7.8Tris-HCl緩沖液懸浮瑞士乳桿菌菌體,攪勻后進(jìn)行超聲波破碎，破碎條件為破碎功率300W，破碎時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s，共破碎200次。離心(4°C，4500r/min, 20min)后取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液，_80°C冷凍保藏備用。(3)瑞士乳桿菌蛋白酶的固定:在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸鈉，37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入
0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。本發(fā)明的有 益效果:本發(fā)明提供了一種海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法。海藻酸鈉是一種天然的多糖，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性。將瑞士乳桿菌蛋白酶用海藻酸鈉和戊二醛協(xié)同固定后，可實(shí)現(xiàn)蛋白酶的重復(fù)利用，將其水解乳蛋白可以實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的規(guī)模制備。本發(fā)明提供了海藻酸鈉和戊二醛協(xié)同固定蛋白酶的方法，較于傳統(tǒng)海藻酸鈉包埋法，本發(fā)明利用了戊二醛的交聯(lián)作用，固定的蛋白酶更加牢固。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，常規(guī)的瑞士乳桿菌均可用于本發(fā)明，下面實(shí)施例所用的具體菌株，是為了舉例說明本發(fā)明，不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。實(shí)施例1( I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備將瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus ATCC15009)接種于 MRS 培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801g，磷酸氫二鉀2g，無水乙酸鈉5g,檸檬酸三銨2g，水合硫酸鎂0.5g，水合硫酸錳0.05g,蒸餾水1L，121 °C高溫滅菌20min)，連續(xù)活化三代，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-24h (瑞士乳桿菌生長對數(shù)期)。將活化后的瑞士乳桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，24h后取出，40C，4500r/min,離心20min,收集瑞士乳桿菌菌體。用pH7.1 (50mmol/L) Tris-HCl緩沖液洗漆菌體,重復(fù)洗漆3次,瑞士乳桿菌菌體保藏備用。取瑞士乳桿菌菌體，用pH7.8Tris-HCl緩沖液重新懸浮，菌體與緩沖液比例為Ig: 30mL,攪勻后在300W，破碎時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s的超聲波破碎條件下破碎200次。將破碎液于4°C, 4500r/min,離心20min,取上清液即為蛋白酶液,在冷凍條件下保藏備用。(2)海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白含量為8mg/mL)中加入0.6g海藻酸鈉，37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例2瑞士乳桿菌蛋白酶的制備條件同實(shí)施例1中(I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備。

在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白濃度為4mg/mL)中加入0.6g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例3瑞士乳桿菌蛋白酶的制備條件同實(shí)施例1中(I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備。在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白濃度為12mg/mL)中加入0.6g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例4瑞士乳桿菌蛋白酶的制備條件同實(shí)施例1中(I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備。在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白濃度為8mg/mL)中加入0.45g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例5瑞士乳桿菌蛋白酶的制備條件同實(shí)施例1中(I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備。在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白濃度為8mg/mL)中加入0.75g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例6瑞士乳桿菌蛋白酶的制備條件同實(shí)施例1中(I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備。在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白濃度為8mg/mL)中加入0.6g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.2%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例7瑞士乳桿菌蛋白酶的制備條件同實(shí)施例1中(I)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備。在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白濃度為8mg/mL)中加入0.6g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入
0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.6%的戊二醛溶液交聯(lián)6h。洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。實(shí)施例8(I)固定化瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳清蛋白稱取一定量的WPC-80乳清濃縮蛋白按6% (W/V)將其溶解，65°C加熱lOmin，降至所37°C,調(diào)至pH7.5,然后加入固定化瑞士乳桿菌蛋白酶進(jìn)行水解，[E]/[S] (w/w)為15,在恒溫水浴振蕩器中酶解8h，水解過程中不斷加入濃度為0.lmol/L的NaOH維持pH值，記下消耗的NaOH量，用于水解度的計(jì)算，酶解8h后將反應(yīng)體系在100°C加熱20min滅酶，離心后(4500r/min，20min)取上清液進(jìn)行ACE抑制率的檢測。終產(chǎn)品水解度為6.104%, ACE抑制率為59.64%。(2)乳清蛋白水解度的測定乳清蛋白水解度測定采用pH-Stat法，按下式計(jì)算出乳清蛋白的水解度:DH% =B (Mb) (I/ a ) (1/Mp) (1/htot) X 100式中:B為NaOH的體積(mL) ；Mb為NaOH的濃度(mol/L);對乳清濃縮蛋白而言，I/ α為2.27 ；ΜΡ為蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g) ;htot為每克原料蛋白質(zhì)中妝鍵的暈?zāi)枖?shù)，對于乳清濃縮蛋白而言，該值取8.8。(3) ACE抑制活性測定先對測定樣品(水解液)進(jìn)行處理，用50%乳酸調(diào)節(jié)pH至3.4 3.6，離心(5000r/min, 15min,4°C)收集上清液,再用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.3,離心(5000r/min,15min，4°C)收集上清液備用。用含有0.3mol/L NaCl 的 0.lmol/L 硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將 Hip-His-Leu 配成
5.0mmol /I,的溶液。在 10mT,試管中加入 200 μ L 的 5.0mmo 1/LHip-HiS-Leu 溶液和 80 μ L 的樣品(按上述方法處理后的水解產(chǎn)物)，于37°C下保溫3分鐘后，再加入20 μ LACE溶液(溶解于蒸餾水中，活力為0.lU/mL)，混勻后在37°C下保溫30分鐘，再加入250 μ L的1.0moI/L的鹽酸溶液以終止反應(yīng)，再加入1.7mL醋酸乙酯，經(jīng)15秒種振蕩混勻后，靜置5分鐘，用移液管吸取1.0mL的醋酸乙酯層，120°C烘箱烘干，加入1.0mL蒸餾水，混勻后在228nm處測定吸光度。ACE 抑制率=[(B-A) /B] X 100%
其中A為添加ACE抑制肽時(shí)，ACE和Hip-His-Leu反應(yīng)的吸光度；B為不添加ACE抑制肽時(shí)，ACE和Hip-His-Leu反應(yīng)的吸光度。
權(quán)利要求
1.一種瑞士乳桿菌蛋白酶的固定方法，其特征是，瑞士乳桿菌經(jīng)過液體培養(yǎng)后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液離心分離得到菌體，將菌體懸浮于TriS-HCl緩沖液中進(jìn)行超聲波破碎，破碎液離心后取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液；在蛋白含量為4 mg/mL 12 mg/mL的瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入海藻酸鈉，海藻酸鈉的終質(zhì)量濃度為1.5 % 2.0 %，混勻后用注射器滴入氯化鈣溶液中，固化洗滌后加入戊二醛溶液交聯(lián)，再洗滌浙干，即得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法，其特征是固定化步驟如下:在瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入海藻酸鈉，37°C水浴攪拌混勻；用注射器吸取混合液，滴入0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，立即成球；4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗漆小球后加入0.2% 0.8%的戍二醒溶液交聯(lián)6h ;洗漆浙干,得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法，其特征在于包括下列步驟: (1)瑞士乳桿菌菌體的制備:將_80°C冷藏的瑞士乳桿菌凍干粉接種于MRS液體培養(yǎng)基，連續(xù)活化3代，在37°C下擴(kuò)大培養(yǎng)至生長對數(shù)期取出；4°C，4500r/min，離心20min，收集菌體；用50mmol/L、pH 7.1Tris-HCl緩沖液洗滌菌體，混勻后在4°C，4500r/min，離心20min,收集菌體，菌體重復(fù)洗滌3次，冷藏備用； (2)瑞士乳桿菌蛋白酶的制備:用pH7.8 Tris-HCl緩沖液懸浮瑞士乳桿菌菌體,攪勻后進(jìn)行超聲波破碎，超聲破破碎功率為300W，破碎時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s，共破碎200次；.4°C，4500r/min，離心20 min后取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液，_80°C冷凍保藏備用； (3)瑞士乳桿菌蛋白酶的固定:在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸鈉，.37°C水浴攪拌混，4°C條件下靜置備用；用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入.0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球；4°C條件下靜置4h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4%的戊二醛溶液交聯(lián)6h，洗滌浙干， 得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海藻酸鈉-戊二醛協(xié)同固定瑞士乳桿菌蛋白酶的方法。瑞士乳桿菌在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長對數(shù)期，取發(fā)酵液離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖液重新懸浮菌體，攪勻后進(jìn)行超聲波破碎，離心取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液。將海藻酸鈉與瑞士乳桿菌蛋白酶液混勻，用注射器吸取混合溶液滴入氯化鈣溶液中，成球固化洗滌后加入戊二醛溶液交聯(lián)，再洗滌瀝干，即得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。
文檔編號C12N11/10GK103146674SQ201310084959
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者郭宇星 申請人:南京師范大學(xué)