專利名稱：黑眶蟾蜍胱抑素及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種黑眶蟾蜍胱抑素基因及其應用，屬于生物醫(yī)學技術領域。
背景技術：
黑眶蟾蜍，無尾目，蟾蜍科，蟾蜍屬,是傳統(tǒng)中藥材“干蟾”的主要來源之一,一般于夏、秋二季捕捉；味辛、涼，有毒，歸肝、脾、肺經，具有消腫解毒、止痛、利尿的功效，常用于慢性氣管炎、癰癤疔瘡、咽喉腫痛、水腫和小便不利等癥治療；民間也有用于癌癥(尤其是乳腺癌)等的驗方，但目前關于其功效的分子機制研究較少。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，組織蛋白酶B起著重要的作用，組織蛋白酶B能夠直接降解或激活纖溶酶原激活劑及基質金屬蛋白酶等而間接降解許多細胞外基質成分，從而參與腫瘤的侵襲轉移過程。此外它還可以促進腫瘤血管的增生，增強腫瘤細胞的運動能力，而且組織蛋白酶B轉錄、表達水平的高低與腫瘤的預后呈正相關。目前認為對組織蛋白酶B等半胱氨酸蛋白酶的抑制與抗腫瘤作用有關。將本發(fā)明的黑眶蟾蜍胱抑素氨基酸全序列及其編碼基因分別對蛋白質數(shù)據(jù)庫和基因數(shù)據(jù)庫進行了比對搜索，均未發(fā)現(xiàn)有任何相同序列信息。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種黑眶蟾蜍胱抑素，該黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其是一種單鏈多肽，分子量10882.84道爾頓，等電點7.57。本發(fā)明另一目的是提供一種編碼所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆方法如下:
黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉錄及設計引物并利用PCR方法篩選黑眶蟾蜍胱抑素基因，其中正向擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5’ - ATGGATCAAAAAGGAAATGTTCC-3’，反向擴增引物序列為5’ -CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3’;所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定，基因測序結果表明編碼黑眶蟾蜍胱抑素的基因由309個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:
atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60atacaggcgc tgtgtgacat ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 240ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300tatttttag309
編碼黑眶蟾蜍成熟胱抑素為第1- 306位核苷酸，其氨基酸序列為如SEQ ID NO:2所示。
黑眶蟾蜍胱抑素的原核表達、純化方法如下:構建原核表達載體，轉化入BL21感受態(tài)細胞，培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，經IPTG誘導表達后，離心收集菌體，超聲破碎離心取上清，進行親和層析獲得融合黑眶蟾蜍胱抑素；經超濾后用腸激酶進行消化后，純化即得重組黑眶蟾蜍胱抑素，該胱抑素具有強烈的抑制組織蛋白酶B活性。本發(fā)明另一目的是將黑眶蟾蜍胱抑素應用在制備組織蛋白酶B抑制劑中。本發(fā)明中所用黑眶蟾蜍來源于云南省西雙版納州，從農貿市場購得。本發(fā)明的有益效果在于:
由黑眶蟾蜍胱抑素編碼基因推導其氨基酸結構，并進行原核表達，純化后的黑眶蟾蜍胱抑素具有強烈的抑制組織蛋白酶B的活性，該黑眶蟾蜍胱抑素具有體外生產方便、抑制組織蛋白酶B活性強大的特點。本發(fā)明提供的黑眶蟾蜍胱抑素在2uM濃度可抑制75%的組織蛋白酶B活性，SuM濃度黑眶蟾蜍胱抑素可抑制90%的組織蛋白酶B活性。


圖1是本發(fā)明黑眶蟾蜍胱抑素對組織蛋白酶B抑制活性結果示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的內容并不局限于此，本實施例中方法如無特 殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。實施例1:黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆 一、黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取
A、將活體黑眶蟾蜍用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入IOml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液,美國Invitrogen公司產品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿10分鐘；
B、加入等體積酚/氯仿溶液，振蕩混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘，吸取上層水相液體；
C、在上清液中加入上清液1/2體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下7500g離心10分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為黑眶蟾蜍皮膚總RNA。二、黑眶蟾蜍皮膚cDNA文庫合成
米用 CL0NTECH 公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 質粒cDNA文庫構建試劑盒，參照試劑盒說明書方法操作如下:
A、cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)，具體步驟如下:
1、在0.5ml無菌的離心管加入I μ I黑眶蟾蜍皮膚總RNA、1 μ I SMART IV寡聚核苷酸、1μ I CDS 111/3’ PCR引物，加2μ1去離子水使總體積達到5μ1;
2、混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C保溫2分鐘；
3、將離心管在冰上孵育2分鐘；
4、在離心管中加入以下試劑2.0μ I 5Χ第一鏈緩沖、Ι.Ομ I 20mM 二硫蘇糖醇、
1.0 μ I IOmM dNTP 混合物、1.0 μ I PowerScript 反轉錄酶；5、混合離心管中試劑并短暫離心，在42°C保溫I小時；
6、將離心管置于冰上中止第一鏈的合成；
7、從離心管取2μ I所合成的cDNA第一鏈備用。B、采用長末端聚合酶鏈式反應(LD- PCR )方法擴增第二鏈，具體內容如下:
1、95°C預熱 PCR 儀；
2、將2μ1cDNA第一鏈(mRNA 反轉錄)、80μ1 去離子水、10μ1 IOXAdvantage 2 PCR緩沖、2 μ I 50 X dNTP 混合物、2 μ I 5’PCR 引物、2 μ I CDS 111/3，PCR 引物以及 2μ I 大腸桿菌聚合酶離心管進行反應；
3、在PCR儀中按以下程序擴增:
①95°C20秒鐘
②22個循環(huán):
95 0C5秒鐘
68 0C6分鐘；
4;循環(huán)結束后，將離心管中 合成的cDNA雙鏈進行后續(xù)過程。三、黑眶蟾蜍胱抑素編碼基因的擴增
1、95°C預熱 PCR 儀；
2、將2μ I cDNA雙鏈(上述產物)、75.5μ I去離子水、10 μ I PCR緩沖液、8 μ I dNTP混合物(各2.5uM)、2y I正向擴增引物、2 μ I反向擴增引物以及0.5 μ I大腸桿菌DNA聚合酶放入離心管中進行反應；正向擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5 ’ - ATGGATCAAAAAGGAAATGTTCC-3’ (SEQ ID NO:3)，反向擴增引物序列為
5’ -CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3’ (SEQ ID NO:4)；
3、在PCR儀中按以下程序擴增:
(1)預變性
95 0C5分秒鐘
(2)25個循環(huán):
95 0C30秒鐘
56 0C40秒鐘
72 0C30秒鐘
(3)后擴增
72 0C5分鐘
4、循環(huán)結束后，將PCR產物用TIANGEN公司的DNA產物純化試劑盒進行抽提回收，步驟如下:
(1)將PCR產物與等體積的膜結合液顛倒混勻，然后將混和液轉入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結合，12000rpm離心分I鐘，倒掉收集管中的廢液；
(2)加入700μ 的漂洗液(含乙醇)于離心純化柱中，12000 rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液；
(3)重復步驟2；
(4)12000 rpm 離心 3 分鐘；
(5)將離心純化柱置于新的離心管中；(6)加入30μ1超純水，在室溫下靜置5分鐘；
(7)12000 rpm離心I分鐘，管底溶液即為純化過的黑眶蟾蜍胱抑素編碼基因PCR產物。四、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備
1、挑取單個DH5a菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩2小時。當0D600值達到0.35時，收獲細菌培養(yǎng)物；
2、將細菌轉移到一個50ml預冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻；
3、于4°C下4100rpm離心lOmin，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置I min以使殘留的培養(yǎng)基流
盡；4、每50ml 初始培養(yǎng)液用 30ml 預冷的 0.lmol/L CaCl2-MgCl2 溶液(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重懸細胞沉淀；
5、于4°C下4100rpm離心lOmin，吸出上清液，并將管倒置I min以使殘留的液體流
盡;
6、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預冷的0.lmol/L CaCl2溶液重懸細胞沉淀，分裝后備用。五、連接及連接產物的轉化
1、在微量離心管中加入Iμ I Takara pMD19_T simple載體、4 μ I黑眶蟾蜍胱抑素編碼基因PCR產物及5 μ I的連接酶緩沖混合物；
2、16°C反應3小時；
3、全量(10μ I)加入至100 μ I DH5a感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘；
4、42C加熱90秒鐘后，再在冰中放直I分鐘；
5、加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基890μ 1，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘；
6、取200μ I涂布于含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16小時以形成單菌落。六、黑眶蟾蜍胱抑素基因克隆篩選及鑒定
挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時，進行PCR擴增，擴增引物及擴增條件同前述黑眶蟾蜍胱抑素編碼基因的擴增條件；將經PCR確證的陽性克隆進行質粒提取后，以美國Applied Biosystems3730A全自動核苷酸序列測定儀進行核苷酸序列的測定；測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 (5，CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’)，基因測序結果自5’端至3’端序列為:
atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60atacaggcgc tgtgtgacat ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 240ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300tatttttag309
黑眶蟾蜍胱抑素基因核苷酸序列長度為309個堿基，序列類型:核酸，鏈數(shù):單鏈，拓撲學:直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:黑眶蟾蜍皮膚。編碼黑眶蟾蜍胱抑素為第1- 306位核苷酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
實施例2:黑眶蟾蜍胱抑素的原核表達、純化 一、黑眶蟾蜍胱抑素原核表達載體的構建
根據(jù)編碼黑眶蟾蜍胱抑素的基因設計引物，正向嵌套引物序列兩條，加入Kpn I限制性內切酶切位點和腸激酶酶切位點，F(xiàn)l序列為5’-GGTACCGACGACGACGACAAGATGGA-3’ (SEQ IDNO:5) ；F2 序列為 5，-CGACAAGATGGATCAAAAAGG-3，(SEQ ID NO:6);反向引物 R 序列為 5’-AAGCTTCTAAAAATAACAGATGGG-3’(SEQ ID NO:7)，加入 Hind III 酶切位點，經 PCR、膠回收后，進行雙酶切；PCR、膠回收操作步驟同前實施例1中的步驟三。在PCR管中配制下列酶切體系:
PCR產物/環(huán)狀載體50 ul
ddH2030ul
IOXM BufferIOul
Kpn I5ul(15 U )
Hind III5ul (15 U )
總體積IOOul
37°C酶切10小時，在反應管中加入6X溴酚蘭載樣緩沖液20μ1，混勻后于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)條帶大小回收目的片段，操作步驟同前實施例1中的步驟三。在PCR管中配制下列連接體系:
載體 DNA200ng
插入片段DNA30ng
連接酶IOX緩沖液2 ul
T4 DNA連接酶2U
加無核酸酶水至20ul15°C連接18小時，連接產物轉入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞并篩選陽性克隆，操作步驟同前實施例1中的步驟三。二、黑眶蟾蜍胱抑素的誘導表達
1、37°C搖床培養(yǎng)至0D600到0.4-1 (建議0D600為0.6)；
2、加入IOOmMIPTG儲液至終濃度0.4mM，繼續(xù)培養(yǎng)2_3小時；
3、將搖瓶置于冰上5分鐘，5000g4°C離心5分鐘收集菌體；
4、重懸細胞于0.25倍體積預冷的20mM磷酸鈉，20mM咪唑(pH7.4)中，離心；
5、除去上清，菌體保存于-700C冰箱或繼續(xù)純化。

三、黑眶蟾蜍胱抑素的純化
1、超聲破碎提取蛋白
以20mM磷酸鈉，20mM咪唑(pH7.4)重懸細胞后，于冰浴中進行超聲波破碎，功率100-200W,每次超聲3s,間歇7s,總時間15min,離心取上清即可用于親和層析；
2、親和層析柱的準備
組裝層析柱后，用蒸餾水沖洗以去除末端的氣泡，關閉層析柱流出口，保持層析柱下端有部分水存在，重懸Ni Sepharose 6 Fast Flow填料后,連續(xù)單次將其裝入層析柱,打開層析柱出口，將恒流泵設置為所需流速后，完成至少3個柱體積的洗脫、備用；
3、親和層析以150cm/h的線性流速用5到10個柱體積的結合緩沖液(20mM磷酸鈉，20mM咪唑，pH7.4)平衡層析柱，加入前述樣品，用結合緩沖液洗柱子，直至280nm處吸收回復至基線處，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)進行線性梯度洗脫，收集60%-100%洗脫組分，即為黑眶蟾蜍胱抑素融合蛋白；
4、超濾
使用截留分子量3kD的超濾離心管進行超濾，于常溫下4000轉離心30min，加入等體積ddH20后重復離心步驟兩次，收集離心管上方的液體進行后續(xù)操作；
5、腸激酶切割及純化
取上述蛋白5mg，加入重組腸激酶20U，10X反應緩沖液lOOul，總體積Iml ;25V反應12小時后，進行親和層析，收集層析柱不能結合的組分，再次進行超濾，即得純度超過99%的黑眶蟾蜍胱抑素。實施例3:黑眶蟾蜍胱抑素的應用 檢測黑眶蟾蜍胱抑素的組織蛋白酶B抑制活性。以生色底物 Z-Arg-Arg-pNA(Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-arginine-p-nitroan1- lide)為反應底物，將牛組織蛋白酶B (0.2ng/反應)與反應緩沖液(0.1 M乙酸鈉，pH 5.5，含ImM DTT, 2mM EDTA和4mM半胱氨酸)、不同濃度的黑眶蟾蜍胱抑素(終濃度2 - 8 μ M)，混合后置于室溫5min，加入Z-Arg-Arg-pNA至終濃度為400uM，37°C孵育30min后檢測410nm處吸光度(記為Abo I),設置加入重組黑眶蟾蜍胱抑素的作為對照(記為AboC)，計算抑制率，計算方法為(Abo C-Abo I)/Abo C X 100%。結果如圖1顯示，黑眶蟾蜍胱抑素具有強大的組織蛋白酶B抑制活性，在2uM濃度時可抑制75%的組織蛋白酶B活性，8uM濃 度黑眶蟾蜍胱抑素可抑制90%的組織蛋白酶B活性，而且這種抑制作用十分迅速，在15秒內2uM黑眶蟾蜍胱抑素即可抑制60%的組織蛋白酶B活性，實驗證明其可以作為組織蛋白酶抑制劑使用。
權利要求
1.一種黑眶蟾蜍胱抑素，其特征在于:所述黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.一種編碼權利要求1所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
3.權利要求1所述的黑眶蟾蜍胱抑素在制備組織蛋白酶B抑制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑眶蟾蜍胱抑素及其基因，該黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，編碼黑眶蟾蜍胱抑素的基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，通過原核表達手段獲得的黑眶蟾蜍胱抑素具有很強的組織蛋白酶B抑制活性，并且還具有體外生產方便、抑制組織蛋白酶B活性強大的特點，可做為組織蛋白酶B抑制劑進行應用。
文檔編號C12N15/15GK103172730SQ20131008570
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權日2013年3月18日
發(fā)明者宋玉竹, 劉娃, 張阿梅, 韓芹芹, 紀森林 申請人:昆明理工大學