專利名稱：一種制備復(fù)合乳酸菌制劑的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)和飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，更為具體地，涉及一種制備復(fù)合乳酸菌制劑的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
益生菌制劑(微生態(tài)制劑)是基于飼用抗生素安全性問題應(yīng)運(yùn)而生的一種安全、無毒副作用、能促進(jìn)畜禽生長、改善畜產(chǎn)品肉質(zhì)風(fēng)味、有利于生態(tài)環(huán)境和出口貿(mào)易的綠色飼料添加劑。乳酸菌屬是益生菌制劑中重要的菌種，其大部分是厭氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，生長在礦物質(zhì)和有機(jī)營養(yǎng)物豐富的環(huán)境中，耐酸，在ρΗ3.(Γ4.5時(shí)仍可生長，適應(yīng)于胃腸的酸性環(huán)境；
眾所周知，使用工業(yè)化生產(chǎn)的益生菌在進(jìn)入畜禽腸道后可能會(huì)發(fā)生較大差異結(jié)果，性能與效果不盡如意，究其原因，可能主要與2個(gè)因素有關(guān)，第一個(gè)是選用的菌株在進(jìn)入宿主過程中定植不成功；第二個(gè)是沒有足夠數(shù)量的菌株作用。生產(chǎn)廠家以及相關(guān)科研單位為了提升產(chǎn)品穩(wěn)定性，做了大量的工作。中國專利ZL201010168634.X公布了一種干燥保存活性乳酸菌的方法及乳酸菌制劑，但該方法制備的成品中乳酸菌濃度較低，同時(shí)，采用飼料原料作為載體，微生物極易在儲(chǔ)存中消耗飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，造成能量及有效成分的缺失；中國專利ZL201110085520.3公開了一種濃漿制做發(fā)酵蛋白濃縮飼料工藝，該方法雖然在一定程度上降低了現(xiàn)有烘干技術(shù)生產(chǎn)濃漿飼料的成本，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性，但飼料營養(yǎng)缺失問題還是沒有得到根本解決；中國專利ZL200810197944.7公開了一種液態(tài)轉(zhuǎn)固態(tài)發(fā)酵的益生菌活性濕拌飼料制備方法，但該方法的液態(tài)發(fā)酵基料的原料要求苛刻，同時(shí)，濕拌過程也就是飼料營養(yǎng)物質(zhì)缺失過程；中國專利ZL201110269745.4公布了一種乳酸菌微膠囊及其制備方法，雖然提高了益生菌的穩(wěn)定性和抗逆性，但制備工藝復(fù)雜，成本加大，并不適合畜牧業(yè)大眾化生產(chǎn)；中國專利ZL201210144048.0公開了一種乳酸菌及其凍干菌粉與應(yīng)用，雖然能夠提高生長豬的日增重，降低料肉比，但設(shè)備成本偏高。目前我國生產(chǎn)益生菌制劑的發(fā)酵基料成分中大多有玉米蛋白粉、麩皮、豆柏以及功能性名貴中藥等，雖然能使微生物快速發(fā)酵并聚集，但顯然也增加了其生產(chǎn)成本。與此同時(shí)，我國是農(nóng)業(yè)大國，每年農(nóng)產(chǎn)品加工后遺留下的農(nóng)副產(chǎn)品廢渣，由于富含不能再直接利用的纖維素、木質(zhì)素、果膠等物質(zhì)而被廢棄。被譽(yù)為“淀粉之王”的木薯，在生產(chǎn)淀粉后留下的木薯渣殘余，每年達(dá)30萬噸；大豆生產(chǎn)豆奶或者豆腐后剩下的豆腐廢渣，年產(chǎn)量居然超過2000萬噸；這些數(shù)字中還不包括甘蔗渣、菠蘿渣等其他農(nóng)副產(chǎn)品廢渣。這些廢渣如不加以處理而直接丟棄既造成極大浪費(fèi)又占土地，而且極易產(chǎn)生腐敗氣味污染周邊環(huán)境。利用微生物來發(fā)酵降解農(nóng)副產(chǎn)品廢渣是一研究熱點(diǎn)。中國專利ZL201210155158.7提供了一種混合菌發(fā)酵玉米秸桿生產(chǎn)益生菌顆粒飼料的方法，其充分利用了新收割干燥的玉米秸桿資源，并加入麩皮、玉米粉等物質(zhì),混入混合菌株進(jìn)行發(fā)酵,但該方法設(shè)備成本高,另外由于產(chǎn)品是較大的顆粒狀，很難與其他飼料混勻，造成其適口性不足；中國專利ZL200610123892.X公布了一種采用農(nóng)副產(chǎn)品開放式曲種固體發(fā)酵方法，其產(chǎn)品富 含植物性蛋白飼料原料，但該方法獲得的活菌數(shù)偏低，另外雜菌污染率很高，導(dǎo)致產(chǎn)品不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)益生菌飼料添加劑產(chǎn)品中存在的穩(wěn)定性差、生產(chǎn)成本高的不足，提供一種制備復(fù)合乳酸菌制劑的方法。該方法得到的乳酸菌制劑中的菌株競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，提高其宿主定植率，而且，該方法能有效利用農(nóng)副產(chǎn)品廢渣資源，使其成為飼料添加劑成分中的重要組成部分，在一定程度上解決了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等突出問題。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種復(fù)合乳酸菌制劑的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，包括以下步驟:
51.將各乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)；
52.將SI中各乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液混合得復(fù)合乳酸菌，將復(fù)合乳酸菌加入裝有液態(tài)培養(yǎng)基料的發(fā)酵裝置中，發(fā)酵得到發(fā)酵菌液；當(dāng)發(fā)酵菌液的PH值為3.2^3.7，活菌總數(shù)達(dá)5.4 6.2 X IO9 cfu/ml時(shí)停止發(fā)酵；
53.農(nóng)副產(chǎn)品廢渣預(yù)處理:選取農(nóng)副產(chǎn)品廢渣，采用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.Γ0.5% HNO3水溶液9(Tl00°C高溫預(yù)處理l(T20min，撈起廢渣，降溫至常溫備用；
54.將S3中預(yù)處理后的廢渣加入到S2中進(jìn)行液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵，同時(shí)加入酶制劑輔助酶解，當(dāng)發(fā)酵菌液的PH值為3.Γ3. 4，活菌總數(shù)達(dá)7.8 8.5 X IO9 cfu/ml時(shí)停止發(fā)酵，得復(fù)合乳酸菌制劑。具體地，SI所述乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)的具體步驟為:
Sll.各乳酸菌斜面復(fù)壯；從各保藏的斜面菌種挑取相應(yīng)菌落擴(kuò)培復(fù)壯，分別接種于MRS培養(yǎng)基上，于35 40°C培養(yǎng)2Γ72 h，使其處于對(duì)數(shù)中后期，得復(fù)壯菌株；其中，所述的培養(yǎng)基為MRS斜面固體培養(yǎng)基。S12.各乳酸菌搖床培養(yǎng):將步驟Sll中復(fù)壯的乳酸菌株分別用無菌水沖洗下來制成菌懸菌液，接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的三角瓶中，三角瓶編好號(hào)，控制溫度40°C，密封培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌搖床培養(yǎng)液。S13.各乳酸菌種子罐培養(yǎng):將步驟S12中搖床培養(yǎng)的菌種分別用生理鹽水沖洗下來制成懸菌液，全部接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的種子罐中，編好號(hào)，控制溫度35 °C，密封培養(yǎng)48 h,制備乳酸菌種子培養(yǎng)液。其中，步驟S12和S13中所述的改良MRS培養(yǎng)液成分含量相同:酪蛋白胨10.0 g，牛肉浸取物10.0 g，酵母提取液5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺2.0 g，吐溫3.2 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸錳0.05 g，七水硫酸鎂0.2 g，碳酸鈣21 g，瓊脂24g，蒸餾水1000 ml，在彡100 °C下滅菌，隨后降溫到35°C左右，pH 6.8。優(yōu)選地，S2所述復(fù)合乳酸菌為干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌或植物乳桿菌中的任意兩種、多種或全部；復(fù)合乳酸菌的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)液總體積的5 10%。優(yōu)選地，S2中所述發(fā)酵的條件為35 40°C，發(fā)酵48 72h ；S4中所述發(fā)酵的條件為35 40°C，發(fā)酵 72 96 h。
優(yōu)選地，S2中所述液態(tài)培養(yǎng)基料含有15 30重量份數(shù)的發(fā)酵基料、8(Γ95重量份數(shù)的水和(Γ0.5重量份數(shù)的生長促進(jìn)因子。優(yōu)選地，所述發(fā)酵基料的制備方法為:按重量份數(shù)計(jì)，將4(Γ60份玉米、2(Γ40份黃豆和1(Γ15份麩皮分別粉碎成廣3 mm，篩片后分別烘炒20 min, 30 min和15min，三者混勻
得發(fā)酵基料。優(yōu)選地，所述生長促進(jìn)因子為木瓜、胡蘿卜、糊精、麥芽糖、酸化酪蛋白水解物、胰蛋白胨、濃縮乳清蛋白、酵母浸膏、低聚麥芽糖、低聚半乳糖或低聚果糖中的一種，多種或者全部。優(yōu)選地，S3中所述農(nóng)副產(chǎn)品廢渣為木薯渣、豆腐渣、菠蘿渣或甘蔗渣；廢渣與HNO3水溶液的固液比為1: 12 18。優(yōu)選地，S4中所述酶制劑為纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶的一種或多種；酶制劑加入量占總發(fā)酵總量的0.οΓο.1%。一種如上所述復(fù)合乳酸菌制劑的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將復(fù)合乳酸菌制劑直接與生豬日食飼料按1:2 10的比例混合即時(shí)飼用；或者將復(fù)合乳酸菌制劑與生豬日食飼料混合，使含水量降低到25 35%，并混入0.05%果寡糖，真空包裝儲(chǔ)存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的有益效果是。(I)本發(fā)明所制備的復(fù)合乳酸菌制劑性能穩(wěn)定，能順利通過動(dòng)物消化道，并成功定植于宿主腸道內(nèi)。乳酸菌制劑的穩(wěn)定性體現(xiàn)在乳酸菌制劑中的乳酸菌在動(dòng)物腸道內(nèi)定植率的高低。乳酸菌制劑中的乳酸菌能否成功定植于宿主腸道內(nèi)除了和乳酸菌本身的抗逆性能有關(guān)外，還和其生長的營養(yǎng)環(huán)境息息相關(guān)。相對(duì)豐富、適宜的營養(yǎng)環(huán)境可以顯著提高菌株的活性，使其能夠克服宿 主消化道中的惡劣環(huán)境(胃酸、膽鹽)，成功定植于宿主腸道內(nèi)。(2)本發(fā)明所制備的復(fù)合乳酸菌制劑能直接與日食飼料混合喂養(yǎng)，適口性好，易于消化吸收，能在較長時(shí)間內(nèi)保持飼料的活鮮度。另外，復(fù)合乳酸菌制劑與飼料混合后，不僅降低了水分含量，延長了其保質(zhì)期，而且省去了干燥工藝，節(jié)省了成本，并讓乳酸菌免受高溫失活危險(xiǎn)。另外，混合過程中加入果寡糖，有效避免了飼料營養(yǎng)成分缺失的問題。(3)該方法能有效降低益生菌制劑的生產(chǎn)成本，完全利用農(nóng)副產(chǎn)品廢渣資源，使其成為飼料添加劑成分中的重要組成部分，在一定程度上解決了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等突出問題。(4)本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，占用設(shè)備體積小，生產(chǎn)成本低，有助于在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)現(xiàn)。


圖1.本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述。本發(fā)明所用的各種原料、生產(chǎn)設(shè)備均可選自市售的任意一種，并沒有特殊的限定。本發(fā)明所用乳酸菌可選用干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌和植物乳桿菌中的任意兩種、多種或全部。干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) CGMCC1.62,購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；嗜酸乳桿菌(LactobaCillusacidophilus)CGMCCl.1854，購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) CGMCC1.1864,購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；屎腸球菌(Enterococcus faecom) CGMCC1.2334,購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；植物乳桿菌(Lactobacillus p I an t ar um ) CGMCC1.298,購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。實(shí)施例1
一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，復(fù)合乳酸菌為干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌，混合比例為1:1。 一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法步驟包括:
S1.菌株擴(kuò)大培養(yǎng)。Sll.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌斜面復(fù)壯:從保藏的斜面菌種挑取相應(yīng)菌落擴(kuò)培復(fù)壯，分別接種于MRS培養(yǎng)基上，于35°C培養(yǎng)72 h，使其處于對(duì)數(shù)中后期，得復(fù)壯菌株；
其中，Sll中所述的培養(yǎng)基為MRS斜面固體培養(yǎng)基。S12.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌搖床培養(yǎng):將步驟Sll中復(fù)壯的乳酸菌株分別用無菌水沖洗下來制成菌懸菌液，接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的三角瓶中，三角瓶編好號(hào)，控制溫度40°C，密封培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌搖床培養(yǎng)液。S13.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌種子罐培養(yǎng):將步驟S12中搖床培養(yǎng)的菌種分別用生理鹽水沖洗下來制成懸菌液，全部接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的種子罐中，編好號(hào)，控制溫度35 °C，密封培養(yǎng)48 h，制備乳酸菌種子培養(yǎng)液。其中，步驟S12和S13中所述的改良MRS培養(yǎng)液成分含量相同:酪蛋白胨10.0 g，牛肉浸取物10.0 g，酵母提取液5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺2.0 g，吐溫3.2 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸錳0.05 g，七水硫酸鎂0.2 g，碳酸鈣21 g，瓊脂24g，蒸餾水1000 ml，在彡100 °C下滅菌，隨后降溫到35°C左右，pH 6.8。S2.菌株液態(tài)培養(yǎng):將干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)液按照1:1配方混合在一起，加入到裝有液態(tài)培養(yǎng)基料的大桶內(nèi)，控制溫度在40°C，發(fā)酵48h，得到發(fā)酵菌液；發(fā)酵菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)中后期時(shí)，停止發(fā)酵。其中，接種配比量占發(fā)酵培養(yǎng)液總體積的10%。其中，液態(tài)培養(yǎng)基料中各物質(zhì)混合配比為:發(fā)酵基料30重量份，水70重量份，生長促進(jìn)因子0.5重量份。其中，發(fā)酵基料為玉米，黃豆，麩皮，將其粉碎成f 3mm篩片，進(jìn)行烘炒處理。其中各含量的重量份配比為:玉米40，黃豆40，麩皮20 ;各自烘炒時(shí)間分別為20 min, 30 min和15 min。其中，水為常溫下的自來水；生長促進(jìn)因子包括糊精、酸化酪蛋白水解物、胰蛋白胨、低聚麥芽糖、低聚半乳糖。另外，在發(fā)酵前后，清除發(fā)酵液體表面的漂浮物，清除發(fā)酵罐內(nèi)壁上粘附的液態(tài)發(fā)酵基料。其中，發(fā)酵罐選用橡膠桶，發(fā)酵過程中罐口要密封好。其中，確定發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)為:發(fā)酵菌液中pH值約為3.7，并測(cè)得活菌總數(shù)達(dá)6.2XIO9 cfu/ml。S3.農(nóng)副產(chǎn)品廢渣預(yù)處理:選取農(nóng)副產(chǎn)品廢渣，采用稀HNO3高溫處理法進(jìn)行預(yù)處理，處理時(shí)間為lOmin，撈起廢渣，降溫到常溫備用。其中，稀HNO3為重量百分含量為0.1%的HNO3水溶液。其中，廢渣與稀HNO3水溶液的固液比為1:15。其中，水解溫度為90 V。其中，農(nóng)副產(chǎn)品廢渣為木薯渣。S4.復(fù)合菌株液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵
將步驟S3中廢渣加入到步驟S2中進(jìn)行液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵，同時(shí)加入酶制劑輔助酶解。控制溫度在45 °C，發(fā)酵9·6 h，期間定期進(jìn)行密封隔氧攪拌。發(fā)酵菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)中后期時(shí)，停止發(fā)酵。其中，液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵中液態(tài)發(fā)酵液與廢渣的比例為1:5。其中，酶制劑是纖維素酶。酶制劑加入量占總發(fā)酵總量的0.1%。其中，密封隔氧攪拌頻率為每天I次。其中，確定發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)為:罐底發(fā)酵菌液pH值3.1，農(nóng)副產(chǎn)品廢渣軟化并帶有宜人酸味。測(cè)得活菌總數(shù)達(dá)7.8X IO9 cfu/ml。S5.: 一種基于農(nóng)副產(chǎn)品廢渣的液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵制備復(fù)合乳酸菌制劑的應(yīng)用 一種基于農(nóng)副產(chǎn)品廢渣的液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵制備復(fù)合乳酸菌制劑可以直接與生豬日食
飼料混合即時(shí)飼用，比例為1:2。或者與生豬日食飼料混合，使含水量降低到35%，并混入0.05%果寡糖，真空包裝儲(chǔ)存。實(shí)施例2
一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，復(fù)合乳酸菌種為干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌和植物乳桿菌5種菌種，成分比例為1:1:1:1:1。一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法步驟包括:
S1.菌株擴(kuò)大培養(yǎng)
Sll.乳酸桿菌斜面復(fù)壯:從保藏的斜面菌種挑取相應(yīng)菌落擴(kuò)培復(fù)壯，分別接種于MRS培養(yǎng)基上，于40°C培養(yǎng)48 h，使其處于對(duì)數(shù)中后期，得復(fù)壯菌株；
其中，所述的培養(yǎng)基為MRS斜面固體培養(yǎng)基。S12.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌搖床培養(yǎng):將步驟Sll中復(fù)壯的乳酸菌株分別用無菌水沖洗下來制成菌懸菌液，接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的三角瓶中，三角瓶編好號(hào)，控制溫度35°C，密封培養(yǎng)48 h，制備乳酸菌搖床培養(yǎng)液。S13.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌種子罐培養(yǎng):將步驟S12中搖床培養(yǎng)的菌種分別用生理鹽水沖洗下來制成懸菌液，全部接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的種子罐中，編好號(hào)，控制溫度40 V，密封培養(yǎng)48 h，制備乳酸菌種子培養(yǎng)液。其中，步驟S12和S13的改良MRS培養(yǎng)液成分含量相同:酪蛋白胨10.0 g，牛肉浸取物10.0 g，酵母提取液5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺2.0 g，吐溫3.2g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸錳0.05 g，七水硫酸鎂0.2 g，碳酸鈣21 g，瓊脂24 g，蒸餾水1000 ml，在≥100°C下滅菌，隨后降溫到35 °C左右，pH 6.8。
S2.菌株液態(tài)培養(yǎng)
將各乳桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)液按照1:1:1:1:1混合在一起，加入到裝有液態(tài)培養(yǎng)基料的大桶內(nèi)，控制溫度在35°c，發(fā)酵72h，得到發(fā)酵菌液；發(fā)酵菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)中后期時(shí)，停止發(fā)酵。其中，接種配比量占發(fā)酵培養(yǎng)液總體積的5%。其中，液態(tài)培養(yǎng)基料中各物質(zhì)混合配比為:發(fā)酵基料15重量份，水85重量份，生長促進(jìn)因子0.3重量份。其中，發(fā)酵基料為玉米，黃豆，麩皮，將其粉碎成2 3mm篩片，進(jìn)行烘炒處理。其中各含量配比為:玉米35，黃豆40，麩皮25 ;烘炒時(shí)間分別為20 min, 30 min和15 min。其中，水為常溫下的自來水；生長促進(jìn)因子包括生長促進(jìn)因子包括糊精、酸化酪蛋白水解物、胰蛋白胨、低聚麥芽糖、低聚半乳糖。另外，在發(fā)酵前后，清除發(fā)酵液體表面的漂浮物，清除發(fā)酵罐內(nèi)壁上粘附的液態(tài)發(fā)酵基料。其中，發(fā)酵罐選用橡膠桶，發(fā)酵過程中罐口要密封好。其中，確定發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)為:發(fā)酵菌液中pH值3.2以下，并測(cè)得活菌總數(shù)達(dá)
5.4X IO9 cfu/ml。S3.農(nóng)副產(chǎn)品廢渣預(yù)處理 選取農(nóng)副產(chǎn)品廢渣，采用稀HNO3高溫處理法進(jìn)行預(yù)處理，處理時(shí)間為20min，撈起廢渣，降溫到常溫備用。其中，稀HNO3含量為0.5% HNO3水溶液。其中，廢渣與稀HNO3的固液比為1:15。其中，水解溫度為100°C。其中，農(nóng)副產(chǎn)品廢渣為甘蔗渣。S4.復(fù)合菌株液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵
將步驟S3中廢渣加入到步驟S2中進(jìn)行液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵，同時(shí)加入酶制劑輔助酶解?？刂茰囟仍?5 °C，發(fā)酵72h，期間定期進(jìn)行密封隔氧攪拌。發(fā)酵菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)中后期時(shí)，停止發(fā)酵。其中，液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵中液態(tài)發(fā)酵液與廢渣的比例為1:5。其中，酶制劑是纖維素酶。酶制劑加入量占總發(fā)酵總量的0.05%。其中，密封隔氧攪拌頻率為每天3次。其中，確定發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)為:罐底發(fā)酵菌液pH值3.4，農(nóng)副產(chǎn)品廢渣軟化并帶有宜人酸味。測(cè)得活菌總數(shù)達(dá)8.5 X IO9 cfu/ml οS5.一種復(fù)合乳酸菌制劑的應(yīng)用
該實(shí)施例制備得到的復(fù)合乳酸菌制劑可以直接與生豬日食飼料混合即時(shí)飼用，比例為1:2。或者與生豬日食飼料混合，使含水量降低到25%，并混入0.05%果寡糖，真空包裝儲(chǔ)存。對(duì)比例3
一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，復(fù)合乳酸菌為干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌，混合比例為 1:1。S1.菌株擴(kuò)大培養(yǎng)。
Sll.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌斜面復(fù)壯:從保藏的斜面菌種挑取相應(yīng)菌落擴(kuò)培復(fù)壯，分別接種于MRS培養(yǎng)基上，于35°C培養(yǎng)72 h，使其處于對(duì)數(shù)中后期，得復(fù)壯菌株；
其中，Sll中所述的培養(yǎng)基為MRS斜面固體培養(yǎng)基。S12.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌搖床培養(yǎng):將步驟Sll中復(fù)壯的乳酸菌株分別用無菌水沖洗下來制成菌懸菌液，接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的三角瓶中，三角瓶編好號(hào)，控制溫度40°C，密封培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌搖床培養(yǎng)液。S13.干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌種子罐培養(yǎng):將步驟S12中搖床培養(yǎng)的菌種分別用生理鹽水沖洗下來制成懸菌液，全部接種到裝有改良MRS培養(yǎng)液的種子罐中，編好號(hào)，控制溫度35 °C，密封培養(yǎng)48 h，制備乳酸菌種子培養(yǎng)液。其中，步驟S12和S13中所述的改良MRS培養(yǎng)液成分含量相同:酪蛋白胨10.0 g，牛肉浸取物10.0 g，酵母提取液5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二胺2.0 g，吐溫3.2 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸錳0.05 g，七水硫酸鎂0.2 g，碳酸鈣21 g，瓊脂24g，蒸餾水1000 ml，在彡100 °C下滅菌，隨后降溫到35°C左右，pH 6.8。S2.菌株液態(tài)培養(yǎng):將干酪乳酸菌株和嗜酸乳桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)液按照1:1配方混合在一起，加入到裝有液態(tài)培養(yǎng)基料的大桶內(nèi)，控制溫度在40°C，發(fā)酵48h，得到發(fā)酵菌液；發(fā)酵菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)中后期時(shí)，停止發(fā)酵。其中，接種配比量占發(fā)酵培養(yǎng)液總體積的10%。其中，液態(tài)培養(yǎng)基料中各物質(zhì)混合配比為:發(fā)酵基料30重量份，水70重量份。其中，發(fā)酵基料為玉米，黃豆，麩皮，將其粉碎成f 3mm篩片，進(jìn)行烘炒處理。其中各含量的重量份配比為:玉米4 0，黃豆40，麩皮20 ;各自烘炒時(shí)間分別為20 min, 30 min和
15min。其中，水為常溫下的自來水；另外，在發(fā)酵前后，清除發(fā)酵液體表面的漂浮物，清除發(fā)酵罐內(nèi)壁上粘附的液態(tài)發(fā)酵基料。其中，發(fā)酵罐選用橡膠桶，發(fā)酵過程中罐口要密封好。其中，確定發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)為:發(fā)酵菌液中pH值3.7以下，并測(cè)得活菌總數(shù)達(dá)
6.3XIO9 cfu/ml。S3.選取農(nóng)副產(chǎn)品廢渣(農(nóng)副產(chǎn)品廢渣不經(jīng)過任何處理)。其中，農(nóng)副產(chǎn)品廢渣為木薯渣。S4.復(fù)合菌株液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵
將步驟S3中廢渣加入到步驟S2中進(jìn)行液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵。控制溫度在45 V，發(fā)酵96h，期間定期進(jìn)行密封隔氧攪拌。發(fā)酵菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)中后期時(shí)，停止發(fā)酵。其中，液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵中液態(tài)發(fā)酵液與廢渣的比例為1:5。其中，密封隔氧攪拌頻率為每天I次。其中，確定發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)為:罐底發(fā)酵菌液pH值3.7，農(nóng)副產(chǎn)品廢渣軟化并帶有宜人酸味。測(cè)得活菌總數(shù)達(dá)7.8X IO9 cfu/ml。實(shí)施例4
試驗(yàn)選取32kg體重的二元壹號(hào)黑豬200頭，隨機(jī)分成4組(對(duì)照組1、對(duì)照組2、試驗(yàn)組I和試驗(yàn)組2)，各組均為50頭，公母比例一致，平均體重差異不顯著(P > 0.05)，二元壹號(hào)黑豬由廣東壹號(hào)食品股份有限公司提供，試驗(yàn)地點(diǎn)在廣東湛江遂溪官湖基地育肥區(qū)三線進(jìn)行。對(duì)照組I飼用的是生豬日食飼料；對(duì)照組2飼用的是本發(fā)明對(duì)比例3制備的復(fù)合乳酸菌制劑與生豬日食飼料的混合物；試驗(yàn)組I飼用的是本發(fā)明實(shí)施例1制備的復(fù)合乳酸菌制劑與生豬日食飼料的混合物；試驗(yàn)組2飼用的是本發(fā)明人實(shí)施例2制備的復(fù)合乳酸菌制劑經(jīng)真空包裝后與生豬日食飼料的混合物。表I為生豬日食飼料的配方表。表1生豬日食飼料的配方
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.將各乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)； 52.將SI中各乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液混合得復(fù)合乳酸菌，將復(fù)合乳酸菌加入裝有液態(tài)培養(yǎng)基料的發(fā)酵裝置中，發(fā)酵得到發(fā)酵菌液；當(dāng)發(fā)酵菌液的PH值為3.2^3.7，活菌總數(shù)達(dá)5.4 6.2 X IO9 cfu/ml時(shí)停止發(fā)酵； 53.農(nóng)副產(chǎn)品廢渣預(yù)處理:選取農(nóng)副產(chǎn)品廢渣，采用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.Γ0.5% HNO3水溶液9(Tl00°C高溫預(yù)處理l(T20min，撈起廢渣，降溫至常溫備用； 54.將S3中預(yù)處理后的廢渣加入到S2中進(jìn)行液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵，同時(shí)加入酶制劑輔助酶解，當(dāng)發(fā)酵菌液的PH值為3.Γ3.4，活菌總數(shù)達(dá)7.8 8.5 X IO9 cfu/ml時(shí)停止發(fā)酵，得復(fù)合乳酸菌制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，SI所述乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)的具體步驟為: 511.各乳酸菌斜面復(fù)壯； 512.各乳酸菌搖床培養(yǎng)； 513.各乳酸菌種子罐培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，S2所述復(fù)合乳酸菌為干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌或植物乳桿菌中的任意兩種、多種或全部；復(fù)合乳酸菌的接種量占發(fā)酵培養(yǎng)液總體積的5 10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，S2中所述發(fā)酵的條件為35 40°C，發(fā)酵48 72h ；S4中所述發(fā)酵的條件為35 40°C，發(fā)酵72 96 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，S2中所述液態(tài)培養(yǎng)基料含有15 30重量份數(shù)的發(fā)酵基料、8(Γ95重量份數(shù)的水和(Γ0.5重量份數(shù)的生長促進(jìn)因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵基料的制備方法為:按重量份數(shù)計(jì)，將40飛0份玉米、2(Γ40份黃豆和1(Γ15份麩皮分別粉碎成3臟，篩片后分別烘炒20 min、30 min和15min,三者混勻得發(fā)酵基料。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，所述生長促進(jìn)因子為木瓜、胡蘿卜、糊精、麥芽糖、酸化酪蛋白水解物、胰蛋白胨、濃縮乳清蛋白、酵母浸膏、低聚麥芽糖、低聚半乳糖或低聚果糖中的一種，多種或者全部。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，S3中所述農(nóng)副產(chǎn)品廢渣為木薯渣、豆腐渣、菠蘿渣或甘蔗渣；廢渣與HNO3水溶液的固液比為1:12 18。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述復(fù)合乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，S4中所述酶制劑為纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶的一種或多種；酶制劑加入量占總發(fā)酵總量的0.οΓο.1%。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述復(fù)合乳酸菌制劑的應(yīng)用，其特征在于，復(fù)合乳酸菌制劑直接與生豬日食飼料按1:2 10的比例混合即時(shí)飼用；或者復(fù)合乳酸菌制劑與生豬日食飼料混合，使含水量降低到25 35%，并混入0.05%果寡糖，真空包裝儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種制備復(fù)合乳酸菌制劑的方法及應(yīng)用。所述方法包括菌株擴(kuò)大培養(yǎng)、復(fù)合菌株液態(tài)培養(yǎng)、農(nóng)副產(chǎn)品廢渣預(yù)處理、復(fù)合菌株液固態(tài)耦聯(lián)發(fā)酵。該發(fā)明克服了當(dāng)前益生菌飼料添加劑產(chǎn)品存在的性能穩(wěn)定性差、生產(chǎn)成本高的問題，其不僅使復(fù)合乳酸菌制劑產(chǎn)品中的菌株競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，宿主定植率得到提高，而且，該方法能大幅度減小成本，并有效利用農(nóng)副產(chǎn)品廢渣資源，使其成為飼料添加劑成分中的重要組成部分，在一定程度上解決了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等突出問題，可成功應(yīng)用于飼料方面。
文檔編號(hào)C12R1/25GK103146616SQ20131008582
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者黎小兵, 胡杰, 楊星, 江彬強(qiáng), 黃升科 申請(qǐng)人:廣東壹號(hào)食品股份有限公司