專利名稱：一種優(yōu)良食味品質(zhì)轉(zhuǎn)基因水稻及培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種植物生物技術(shù)領(lǐng)域的降低水稻種子中表觀直鏈淀粉含量的方法，具體涉及一種用RNA干擾技術(shù)降低水稻種子中直鏈淀粉含量從而改良稻米品質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過各種方法將動植物或微生物中分離得到的目的基因轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之穩(wěn)定表達(dá)。該技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，在農(nóng)作物抗蟲、抗逆、抗病及品質(zhì)改良方面發(fā)揮巨大作用。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，是水稻胚乳中最主要的貯存物質(zhì)，兩類淀粉的組成比例是決定稻米適口性的最重要因素之一。通常來說，食味值好的稻米的直鏈淀粉含量(AC)為10-20%。一般而言，AC越高的品種其RVA (快速粘度分析)譜崩解值越小，消減值和回復(fù)值越大(賈良等，作物學(xué)報，2008，34 (5):790-794)。而崩解值在一定程度上與柔軟性、粘散性、滋味、馨香味、光澤、冷飯質(zhì)地等食味指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān)性(李欣等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005, 38 (4): 657-663)。在當(dāng)今市場上，軟米因其口感粘香且硬度適中，價格遠(yuǎn)高于東北大米等常規(guī)稻米。這類稻米中的直鏈淀粉含量往往較低，介于8-12%之間。水稻胚乳中參與淀粉合成的酶至少有四大類，分別是ADP葡萄糖磷酸合成酶(AGPP)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)及淀粉去分支酶(DBE)。淀粉合成酶主要由顆粒性淀粉合成酶(GBSS)及可溶性淀粉合成酶(SSS)組成， 其功能分別是合成直鏈淀粉及支鏈淀粉?？扇苄缘矸酆铣擅赴雌涔δ苡直环譃榘朔N同工型，即SSS1、SSSIIa, SSSIIb,SSSIIc,SSSIIIa,SSSIIIb,SSSIIIc,SSSIVa和SSSIVb等，其中的幾個基因已有較深入的功能研究。例如，水稻SSSI基因在胚乳早期到末期都發(fā)揮作用。Fujita等通過對水稻SSSI基因突變體的研究發(fā)現(xiàn)，該基因突變后稻米糊化溫度增加，而淀粉顆粒形狀大小及結(jié)晶度無變化(Fujita 等，Plant Physiology, 2006,140 (3):1070 - 1084)。SSSIIa 突變體的淀粉易糊化、也易溶于尿素，推測SSSIIa在淀粉合成中的作用是延長支鏈淀粉上的A和BI鏈(Nakamura 等 2002，104(1):1-8 ；Qian 等，2011，53(9):756 - 765)。在 SSIIIa 基因缺失后，直鏈淀粉含量稍有提高，支鏈淀粉中的長支鏈增加，淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生變化，直徑變小且形狀變圓，結(jié)晶度降低(Fujita, Plant Physiology, 2007，144 (4):2009_2023)。而 SSSIIb 作為水稻可溶性淀粉合成酶亞家族的一員，其功能尚未見報道。在本發(fā)明中，利用轉(zhuǎn)基因手段，采用RNA干擾技術(shù)，抑制了水稻中SSSIIb基因的表達(dá)。通過多代自交和選育，獲得了純合的轉(zhuǎn)基因新品系。對轉(zhuǎn)基因水稻新品系成熟稻米進(jìn)行品質(zhì)檢測，顯示該稻米直鏈淀粉含量有明顯的降低；利用淀粉粘度速測儀(RVA儀)對米粉檢測，發(fā)現(xiàn)其粘度下降，預(yù)示該類稻米會具有較優(yōu)良的食味品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該方法獲得的稻米具有較優(yōu)良的食味品質(zhì)。
本發(fā)明構(gòu)建了水稻SSSIIb基因的RNA干擾載體，將其導(dǎo)入水稻品種日本晴中，并通過PCR擴(kuò)增等技術(shù)手段進(jìn)行檢測，結(jié)果表明RNA干擾載體已經(jīng)導(dǎo)入至水稻材料中并得到表達(dá)。本發(fā)明一種培育優(yōu)良食味品質(zhì)稻米的方法，是通過干擾水稻中可溶性淀粉合成酶SSSIIb基因表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。具體是構(gòu)建SSSIIb基因RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將干擾載體導(dǎo)入水稻，獲得干擾SSSIIb基因的轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明所述的方法，包括如下步驟:(I)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物對，擴(kuò)增得到序列如SEQ ID N0.1所示和擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)構(gòu)建RNA干擾載體:利用植物組成型表達(dá)啟動子，構(gòu)建含SEQ ID N0.1序列正反向片段的植物表達(dá)載體；(3)將步驟(2)的RNA干擾載體導(dǎo)入水稻品種中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。上述序列SEQ ID N0.1是水稻可溶性淀粉合成酶IIb基因(SSSIIb)編碼區(qū)中的一段序列，與SSSIIb基因第2至5外顯子間583bp序列同源。本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)基因水稻，它是通過下述方法獲得:(I)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物對，擴(kuò)增得到序列如SEQ ID N0.1的片段；(2)構(gòu)建RNA干擾載體:利用植物組成型表達(dá)啟動子，構(gòu)建含SEQ ID N0.1序列正反向片段的植物表達(dá)載體；(3)將步驟(2)的RNA干擾載體導(dǎo)入水稻品種中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。

上述步驟(2)具體是:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T/A克隆連接入pMD18-T載體，用BamH I和Xba I雙酶切回收目的片段I ;將目的片段I通過Bgl II和Xba I雙酶切位點(diǎn)插入載體PlOll得到PlOll-1 ;再將目的片段I通過BamH I和Spe I雙酶切位點(diǎn)插入載體pl011-1，獲得RNA干擾載體。本發(fā)明中所述的RNA干擾載體通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)等轉(zhuǎn)基因方法，將RNA干擾載體導(dǎo)入水稻品種中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻；相對于未轉(zhuǎn)化水稻品種，該種轉(zhuǎn)基因水稻稻米具有適當(dāng)降低的表觀直鏈淀粉含量，食味品質(zhì)明顯改良。本發(fā)明提供了一種降低水稻直鏈淀粉的方法，對已干擾SSSIIb基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻稻米進(jìn)行各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)的檢測，顯示其品質(zhì)特性發(fā)生了一系列變化。該品系與親本日本晴相比，稻米淀粉粘度值及直鏈淀粉含量均下降，食味有所改善。


圖1是含SSSIIb基因RNA干擾結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌雙元載體T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)。其中，P35S和T35S分別表示35S基因的啟動子和終止子區(qū)；N0S表示農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子；Hyg表示潮霉素抗性基因；CTS，β葡萄糖苷酸酶基因；LB和RB示T-DNA區(qū)的左右邊界序列。Anti和Sense分別表示用于構(gòu)建RNA干擾載體的SSSIIb基因片斷的反向和正向結(jié)構(gòu)。圖2是利用PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因水稻。其中1-8為含有RNA干擾結(jié)構(gòu)的8個轉(zhuǎn)基因系，9為未轉(zhuǎn)化親本日本晴。圖3是含有RNA干擾結(jié)構(gòu)的純合轉(zhuǎn)基因水稻及其未轉(zhuǎn)化對照稻米的直鏈淀粉含量。SSSIIb1-1 — SSSIIb1-4 為 4 個轉(zhuǎn)基因系。圖4是含有RNA干擾結(jié)構(gòu)的純合轉(zhuǎn)基因水稻及其未轉(zhuǎn)化對照米粉的粘滯性譜特征圖。SSSIIb1-1 — SSSIIb1-4 為 4 個轉(zhuǎn)基因系。
具體實(shí)施例方式通過以下三個實(shí)例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行了說明與定義而并非限制。通過實(shí)例，科研人員可以對本發(fā)明有更清楚的了解，可以在此基礎(chǔ)上對本發(fā)明做出一定的變更和修改，以獲得不同的研究效果。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)過程中涉及到的試劑均為常規(guī)試劑，使用均參照產(chǎn)品使用說明書使用。實(shí)施例1DNA序列的獲得及RNA干擾載體的構(gòu)建根據(jù)水稻全基因組信息，獲得SSSIIb的編碼序列后，在Grammne網(wǎng)站上比較該基因與其他同工型的同源性。設(shè)計特異性引物SSSIIbi(上游引物5’-AGGCTGATCATGTTGAG-3’，SEQ ID N0.2 ;下游引物 5’-G TGTTGATTTTGTGTTT-3’，SEQ ID N0.3)用于 RNA 干擾片斷的擴(kuò)增。擴(kuò)增出的序列如SEQ ID N0.1。取日本晴的幼嫩水稻葉片用冷酚法提取水稻總RNA，用凝膠瓊脂糖電流及分光光度計檢測RNA的純度及濃度后,對Iul總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶購自Fermentas公司(商品序號:00082399)。用Iul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，以特異性引物SSSIIbi進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T/A克隆連接入pMD18-T載體(購自TaKaRa公司，商品序號:D103A)，篩選陽性克隆送上海生工生物工程公司測序。篩選出測序完全正確的陽性克隆，用雙酶切(BamH I和Xba I )后在1%瓊脂糖凝膠電泳上分離，采用膠回收試劑盒回收目的片段(命名為I)。同時，采用雙酶切(Bgl II和Xba I)消化載體PlOll (由發(fā)明人自行構(gòu)建，詳見:Zhu等，High-amylose rice improves indices of animal health in normal and diabeticrats.Plant Biotec hnology Journal.2012, 10 (3): 353-362),電泳分離后回收載體片段。將酶切回收的目的基因片段和PlOll載體片段連接，轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中；采用酶切和/或PCR技術(shù)篩選鑒定連接正確的陽性克隆稱為PlOll-1 ;再用BamH I和Spe I雙酶切載體P1011-1，然后再與上述雙酶切后回收的目的片段I相連接，經(jīng)鑒定篩選獲得含有SSSIIb基因RNA干擾結(jié)構(gòu)的RNA干擾載體。該重組質(zhì)粒中即含有正和反向的兩個目的片段序列，正反向序列之間還含有一個水稻谷蛋白基因的第2內(nèi)含子(Intron)(圖1)。實(shí)施例2含RNA干擾載體轉(zhuǎn)基因水稻的培育與鑒定水稻組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化程序均按發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室已建立的方法進(jìn)行(劉巧泉等，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，植物生理學(xué)，1998，24 (3): 259 271)。以日本晴成熟胚為外植體，在N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將構(gòu)建的RNA干擾結(jié)構(gòu)導(dǎo)入水稻愈傷組織中；在共培養(yǎng)基N6D2C上共培養(yǎng)3天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入N6D2S1選擇培養(yǎng)基篩選14天左右，然后再在N6D2S2選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，根據(jù)愈傷實(shí)際生長情況調(diào)整篩選的次數(shù)和天數(shù)。獲得了較多的抗性愈傷組織，將這些抗性愈傷組織經(jīng)過預(yù)分化后，移入分化培養(yǎng)基中分化再形成小苗，最終得到了大量轉(zhuǎn)基因水稻。為檢測目的基因是否整合入轉(zhuǎn)基因水稻植株中，提取轉(zhuǎn)基因水稻單株總DNA。以RNA干擾載體上的Gtl內(nèi)含子和NOS終止子上的一對引物INT-F(5-CCTCGTAATCAATTGTTAGG-3, SEQ ID N0.4)和 NOS-R (5-GACCGGCAACAGGATTCAAT-3，SEQID N0.5)(引物位置見附圖1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，挑選陽性植株(圖2)，讓其自交，經(jīng)過2-3代選育獲得純合轉(zhuǎn)基因系。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因水稻稻米的品質(zhì)表現(xiàn)按照農(nóng)業(yè)部頒布的編號為NY147-88的文件方法測定稻米直鏈淀粉含量，在萬分之一天平上準(zhǔn)確稱取50mg米粉裝入50ml試管中，加入0.5ml無水乙醇使樣品分散后，再加入4.5mll.0mol/1的NaOH溶液混勻，于沸水浴中20min后冷卻至室溫，蒸餾水定容。吸取5ml消化液，加入已盛有半瓶蒸餾水的IOOmL容量瓶中，再加入1.0mll.0mol/1的乙酸溶液使樣品酸化；加入1.5ml0.02%的碘液，用蒸餾水定容，搖勻后靜置15min ;以4.5mllN的NaOH加入0.5ml的95%乙醇代替樣品，配制空白溶液。用空白溶液于分光光度計波長620nm處調(diào)節(jié)零點(diǎn)并測出有色樣品液的吸光度值，最后以標(biāo)準(zhǔn)樣品測得的光密度值及其相關(guān)的直鏈淀粉含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)此計算待測樣品的直鏈淀粉含量。每個樣品做3次重復(fù)。檢測結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因系水稻的直鏈淀粉含量較親本顯著降低。稻米淀粉粘滯性測定按ACC (美國谷物化學(xué)協(xié)會)操作規(guī)程(1995) [93]進(jìn)行(RVA儀購自·澳大利亞Newport Scientif ic儀器公司)。稱取含水量為14%的樣品3.0Og,加入蒸餾水25.0OmL。測定過程中罐內(nèi)的溫度變化如下:50°C保持lmin，以12°C /min的速度上升到 950C (3.75min)，95°C保持 2.5min,以 12°C /min 的速度下降到 50°C (3.75min)，50°C保持1.4min。攪拌器在起始IOs內(nèi)轉(zhuǎn)動速度為960r/min，以后保持在160r/min。粘滯性值用“cp”作單位表示。數(shù)據(jù)分析用TCW(Thermal Cycle for Windows)配套軟件進(jìn)行。分析結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)化對照相比，轉(zhuǎn)基因稻米的崩解值升高，而回升值下降(圖4)。預(yù)示稻米食味品質(zhì)已經(jīng)得到改良。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)良食味品質(zhì)轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法，其特征在于:構(gòu)建5 /Λ基因RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將干擾載體導(dǎo)入水稻，獲得干擾基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟如下: Cl)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物對，擴(kuò)增得到序列如SEQ ID N0.1的片段； (2)構(gòu)建RNA干擾載體:利用植物組成型表達(dá)啟動子，構(gòu)建含SEQID N0.1序列正反向片段的植物表達(dá)載體； (3)將步驟(2)的RNA干擾載體導(dǎo)入水稻品種中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
3.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)是:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Τ/Α克隆連接入PMD18-T載體，用BanM I和Xba I雙酶切回收目的片段I ;將目的片段I通過偷I II和Xba I雙酶切位點(diǎn)插入載體PlOll得到PlOll-1 ;再將目的片段I通過BernM I和Spe I雙酶切位點(diǎn)插入載體Ρ1011-Ι，獲得RNA干擾載體。
4.一種轉(zhuǎn)基因水稻，其特征在于通過下述方法獲得:構(gòu)建基因RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將干擾載體導(dǎo)入水稻，獲得干擾基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因水稻，其特征在于通過如下步驟得到: Cl)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物對，擴(kuò)增得到序列如SEQ ID N0.1的片段； (2)構(gòu)建RNA干擾載體:利用植物組成型表達(dá)啟動子，構(gòu)建含SEQID N0.1序列正反向片段的植物表達(dá)載體； (3)將步驟(2)的RNA干擾載體導(dǎo)入水稻品種中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)是:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Τ/Α克隆連接入PMD18-T載體，用BanM I 和Xba I雙酶切回收目的片段I ;將目的片段I通過偷I II和Xba I雙酶切位點(diǎn)插入載體PlOll得到PlOll-1 ;再將目的片段I通過BernM I和Spe I雙酶切位點(diǎn)插入載體Ρ1011-Ι，獲得RNA干擾載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物技術(shù)領(lǐng)域的降低稻米表觀直鏈淀粉含量和改善淀粉粘性、從而改良稻米食味品質(zhì)的方法，此方法通過干擾水稻中可溶性淀粉合成酶SSSIIb基因表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。構(gòu)建了SSSIIb基因RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，獲得了干擾SSSIIb基因的轉(zhuǎn)基因水稻。通過PCR實(shí)驗(yàn)表明，目的基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。選育得到純合系轉(zhuǎn)基因水稻，該類轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中直鏈淀粉含量較未轉(zhuǎn)化親本日本晴有明顯的降低。通過快速粘度測試儀分析表明，轉(zhuǎn)基因稻米淀粉粘度降低，且糊化溫度降低，稻米的食味特征明顯改善。
文檔編號C12N15/82GK103146746SQ20131008716
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者劉巧泉, 李娟 , 張昌泉, 蔣美艷, 于恒秀, 顧銘洪 申請人:揚(yáng)州大學(xué)