養(yǎng)殖微藻的方法和生產(chǎn)油脂的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及養(yǎng)殖微藻的方法和生產(chǎn)油脂的方法，其中的養(yǎng)殖方法包括:分多次為微藻提供氮肥；至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其處于缺氮刺激狀態(tài)下加入的；養(yǎng)殖時間10天以上。本發(fā)明的養(yǎng)殖方法既可以保證微藻的正常生長，又可以使其積累較多的油脂。
【專利說明】養(yǎng)殖微藻的方法和生產(chǎn)油脂的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及養(yǎng)殖微藻的方法和生產(chǎn)油脂的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]微藻是一類在水中生長的種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是由陽光驅(qū)動的細胞工廠，通過微藻細胞高效的光合作用，吸收CO2,將光能轉(zhuǎn)化為脂肪或淀粉等碳水化合物的化學(xué)能，并放出02。利用微藻生產(chǎn)生物能源與化學(xué)品可以同時達到“替代化石能源、減少CO2排放、凈化廢氣與污水”三個目的?！拔⒃迳锛夹g(shù)”的優(yōu)勢在于以下幾個方面--①微藻是光合效率最高的原始植物，與農(nóng)作物相比，單位面積的產(chǎn)率高出數(shù)十倍。微藻也是自然界中生長最為迅速的一種植物，通常在24h內(nèi)，微藻所含生物質(zhì)可以翻倍，在其“指數(shù)生長期”內(nèi)其生物量翻倍時間可以縮短到3.5h。②微藻可以生長在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠進行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進行培養(yǎng)，因此微藻可以不同農(nóng)作物爭地、爭水。③產(chǎn)油率高，微藻干細胞的含油量可高達70%，微藻沒有高等植物的根莖葉等細胞分化，在缺氮等條件下，某些單細胞微藻可大量積累油脂，是最有前景的產(chǎn)油生物。④微藻的培養(yǎng)可以利用工業(yè)廢氣中的CO2，緩解溫室氣體的排放，也可以吸收工業(yè)廢氣中的NOx，減少環(huán)境的污染。⑤生產(chǎn)微藻生物柴油的同時，還可以生產(chǎn)相當數(shù)量的微藻生物質(zhì)，還可進一步獲得蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸等高價值產(chǎn)品。
[0003]微藻可分為原核藻類和真核藻類，原核藻類以藍藻為主，含葉綠素a、不形成細胞器、能進行光合作用，細胞中蛋白質(zhì)含量高，可達干重的70%，脂肪含量低，為5%左右；真核藻類種類比較多，是主要的生物燃料藻種的來源。常見的微藻主要歸于以下八個門類:娃藻門(Bacillar1phyta)、綠藻門(Chlorophyta)、金藻門(Chrysophyta)、藍藻門(Cyanophyta)> 甲藻門(Pyrroptata)、紅藻門(Rhodophyta)、隱藻門(Cryptophyta)和黃藻門(Xanthophyta)。其中，娃藻門、綠藻門和金藻門是最具潛力的生物柴油藻種來源。
[0004]微藻高效規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)，即通過研究開發(fā)微藻規(guī)?；B(yǎng)殖的新設(shè)備與新工藝來高效、低成本地獲得微藻生物量，是微藻生物技術(shù)的核心之一。影響微藻生長的因素很多，主要有光、營養(yǎng)鹽、CO2, pH、溫度和O2等，這些因素在微藻規(guī)模化養(yǎng)殖過程中所產(chǎn)生的影響尤為突出。研究表明，微藻的生長及油脂含量與光照、氮、磷和溫度等培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同微藻生長和積累油脂的培養(yǎng)條件不盡相同，應(yīng)該根據(jù)不同的藻種確定最佳培養(yǎng)條件，提高生長速率和油脂含量。微藻的養(yǎng)殖需要有充足的陽光、CO2、水和無機鹽，溫度通常要控制在20~30°C，培養(yǎng)液必須能夠提供組成微藻細胞的無機元素，如N、P、K、S1、Fe等。
[0005]目前對于大部分微藻尤其是綠藻而言，提高其細胞油脂含量的主要培養(yǎng)方法是條件脅迫，尤其是缺氮脅迫，即將藻細胞接種于缺氮環(huán)境的培養(yǎng)體系中以改變體內(nèi)代謝的途徑，更多地合成脂肪而非蛋白質(zhì)或糖類，從而達到提高油脂含量的目的。然而限制氮源會影響細胞的正常分裂和生長，使細胞活力下降，導(dǎo)致生物量急劇下降，最后總的油脂產(chǎn)量并未提升?，F(xiàn)有的方法是，先在氮源充足的條件下快速積累微藻生物量，然后再將微藻從富氮的培養(yǎng)基中分離出來再放入缺氮培養(yǎng)基中，進行條件脅迫，以提高油脂含量。這種方法不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，因為將微藻從富氮的培養(yǎng)基中分離出來再放入缺氮培養(yǎng)基中過程繁瑣且能耗極聞。
[0006]有文獻報道，通過控制氮源濃度以同時提高微藻生物量及油脂含量的方法，這些方法只是控制氮源濃度，并非使微藻處于缺氮狀態(tài)，其不是條件脅迫，而是將培養(yǎng)過程控制在最佳條件下，以同時提高微藻生長速率和油脂含量，這些方法只適用于特定的藻種。
[0007]綜上所述，開發(fā)既能保證微藻正常生長又能提高其油脂含量，同時適于大規(guī)模生產(chǎn)的微藻養(yǎng)殖方法迫在眉睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一是提供一種養(yǎng)殖微藻的方法，該方法既能保證微藻的正常生長，又能提高其油脂含量。本發(fā)明的目的之二是提供一種養(yǎng)殖微藻的方法，該方法既能保證微藻的正常生長，又能大幅度提高其油脂含量。
[0009]—種養(yǎng)殖微藻的方法，分多次為微藻提供氮肥；至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其處于缺氮刺激狀態(tài)下加入的；養(yǎng)殖時間10天以上。
[0010]優(yōu)選的情況下，只有在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其處于缺氮刺激狀態(tài)下，才加入氮肥。
[0011]優(yōu)選的情況下，至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情況下加入的；更優(yōu)選的情況下，只有在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情況下，才加入氮肥。
[0012]優(yōu)選的情況下，每次加入的氮肥為微藻12小時的消耗量~72小時的消耗量；更優(yōu)選的情況下，每次加入的氮肥量為微藻12小時的消耗量~48小時的消耗量；進一步優(yōu)選的情況下，每次加入的氮肥量為微藻12小時的消耗量~24小時的消耗量。
[0013]優(yōu)選的情況下，當藻液培養(yǎng)10天以上并達到采收濃度且藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完時，再進行采收。
[0014]所述“缺氮刺激狀態(tài)”具有這樣的氮肥濃度，即在其它培養(yǎng)條件適宜的情況下，微藻短期處于該濃度下不至于使其正常生長受到抑制，但長期處于該氮肥濃度下，其生長和繁殖會受到抑制。微藻在這樣的氮肥濃度下且能正常生長的狀態(tài)就是“缺氮刺激狀態(tài)”。
[0015]所述的氮肥為可被微藻代謝的無機含氮化合物、有機含氮化合物或者二者的混合物，如可選自尿素、銨鹽、硝酸鹽和氨基酸中的一種或幾種。所述的銨鹽可選自碳酸氫銨、硫酸銨、氯化銨和磷酸銨中的一種或幾種。所述的硝酸鹽可以是硝酸鈉和/或硝酸鉀。
[0016]所述的氮肥優(yōu)選為尿素和/或碳酸氫銨。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的方法，在培養(yǎng)微藻的過程中還需要維持微藻正常生長所需要的其它必要條件，如提供合適的光照、溫度，以及其它微藻生長所必需的營養(yǎng)成份，調(diào)控藻液中的CO2、溶解氧、水、無機鹽、必要營養(yǎng)物質(zhì)、pH值等在合適的范圍內(nèi)，使其適宜微藻的快速生長與繁殖。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0018]一般地，培養(yǎng)溫度為15~40°C，優(yōu)選為25~35°C ;光強為2000~200000勒克斯，優(yōu)選為5000~100000勒克斯；在微藻培養(yǎng)過程中通入CO2,并使藻液pH值在6~10的范圍內(nèi)。
[0019]本發(fā)明中，微藻的培養(yǎng)可以采用分級擴大的方式，比如藻種經(jīng)過1L、5L、50L、500L...逐級放大培養(yǎng)。接種的起始濃度一般可以控制在藻液光密度值(OD值)為0.2~I的范圍內(nèi)。養(yǎng)殖時間通常在10天以上，優(yōu)選15天以上，對于產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)，養(yǎng)殖時間20天以上可以獲得更佳的效果。
[0020]本發(fā)明可用于提高微藻的油脂含量，同時又能保證其正常生長，其特別適用于產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)，尤其是屬于娃藻門、綠藻門或金藻門的微藻，如小球藻、柵藻等。
[0021]本發(fā)明還提供了的另一種養(yǎng)殖微藻的方法，分多次為微藻提供氮肥，每次加入的氮肥量為0.03~0.9mmol/L,只有在藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完的情況下，才加入氮肥，養(yǎng)殖時間10天以上；所述微藻為小球藻或柵藻。
[0022]優(yōu)選的情況下，控制每次氮肥的加入量，使其在72h內(nèi)被微藻消耗完；更優(yōu)選的情況下，控制每次氮肥的加入量，使其在24h內(nèi)被微藻消耗完。
[0023]所述的氮肥為可被微藻代謝的無機含氮化合物、有機含氮化合物或者二者的混合物，如可選自尿素、銨鹽、硝酸鹽和氨基酸中的一種或幾種。所述的銨鹽可選自碳酸氫銨、硫酸銨、氯化銨和磷酸銨中的一種或幾種。所述的硝酸鹽可以是硝酸鈉和/或硝酸鉀。
[0024]所述的氮肥優(yōu)選為尿素和/或碳酸氫銨。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的方法，在培養(yǎng)微藻的過程中還需要維持微藻正常生長所需要的其它必要條件，如提供合適的光照、溫度，以及其它微藻生長所必需的營養(yǎng)成份，調(diào)控藻液中的CO2、溶解氧、水、無機鹽、必要營養(yǎng)物質(zhì)、pH值等在合適的范圍內(nèi)，使其適宜微藻的快速生長與繁殖。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0026]一般地，培養(yǎng)溫度15~40°C，優(yōu)選25~35°C ;光強2000~200000勒克斯，優(yōu)選5000~100000勒克斯；在微藻培養(yǎng)過程中通入CO2,使藻液pH值在6~10的范圍內(nèi)。
[0027]本發(fā)明中，微藻的培養(yǎng)可以采用分級擴大的方式，比如藻種經(jīng)過1L、5L、50L、500L...逐級放大培養(yǎng)。接種的起始濃度一般可以控制在藻液光密度值(0D值)為0.2~I的范圍內(nèi)。養(yǎng)殖時間通常在10天以上，優(yōu)選15天以上，對于產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)，養(yǎng)殖時間20天以上可以獲得更佳的效果。
[0028]本發(fā)明所述的兩種養(yǎng)殖方法中，既可以在氮肥耗光時立即補加氮肥；也可以在氮肥耗光后的一段時間內(nèi)再加入氮肥，只要不違背本發(fā)明的目的，其同樣屬于本發(fā)明保護的范圍。一般情況下，需要在氮肥耗光后的72h內(nèi)補加氮肥；較佳在氮肥耗光后的48h內(nèi)補加氮；更佳在氮肥耗光后的24h內(nèi)補加氮肥。
[0029]本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)油脂的方法，包括微藻養(yǎng)殖、微藻采收、微藻油脂的分離和提取，其中，微藻養(yǎng)殖采用上述的兩種方法。
[0030]現(xiàn)有技術(shù)主要是通過氮脅迫或控制培養(yǎng)條件的方法來同時實現(xiàn)快速積累微藻生物量和提高微藻油脂含量。二者均有較大的局限性，氮脅迫的過程繁瑣且能耗極高，而控制培養(yǎng)條件只適用于特定的藻種。本發(fā)明人通過大量試驗發(fā)現(xiàn)，采用“缺氮刺激”的方法，通過微量氮肥的分批加入可以既保證微藻的正常生長，又使其通過本發(fā)明所述的不斷地缺氮刺激積累較多的油脂，并且該方法操作簡便易行，更適合大規(guī)模、低成本、高效率地養(yǎng)殖微藻。此外，本發(fā)明還可以避免過量氮肥的使用，養(yǎng)殖廢水基本不含N元素、對環(huán)境的污染很小。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]附圖1為小球藻生長曲線。
[0032]附圖2為柵藻生長曲線。

【具體實施方式】
[0033]下面以實施例詳細說明本發(fā)明，但并不因此構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0034]溶液氮含暈的測定
[0035]采用ICS3000型離子色譜儀(美國D1nex公司)測定水溶液中的NH4+與NO3一含量，儀器配有EG40淋洗液自動發(fā)生器、電導(dǎo)檢測器和變色龍色譜工作站；1nPac ASll-HC型分離柱(250mmX4mm 1.d.) ；1nPac AGll 型保護柱(50mmX4mm 1.d.) ;ASRS_ULTRA 陰離子自身抑制器。淋洗液:Κ0Η溶液；流速為ImL.HiirT1 ;淋洗液濃度:30mmol.l-1 ;進樣量為60 μ L ;柱溫為30°C ;抑制電流10mA ;外標法峰面積定量。
[0036]藻液光密度值(0D-值)測定
[0037]光密度值用分光光度計測定，以蒸餾水作對照，測定藻液在波長680nm處的吸光值，作為微藻養(yǎng)殖濃度的指標。
[0038]微藻含油暈測定
[0039]采用索氏提取器測定，首先將適量藻液離心、干燥，仔細研磨成細粉一確保微藻有效破壁，稱量，用濾紙包裹放入提取器中，加入甲醇和三氯甲烷，在90°C下抽提6小時，將兩種混合溶劑烘干，恒重稱取遺留下的物質(zhì)，測得含油量的公式:含油％=抽提物重(G)/干粉重(G) 100%。
[0040]微藻的培養(yǎng)基:
[0041]培養(yǎng)基成份見表1~表2，使用時稀釋成1000倍的母液，121 °C高溫消毒20min后冷卻備用。
[0042]表1培養(yǎng)基BGll

【權(quán)利要求】
1.一種養(yǎng)殖微藻的方法,分多次為微藻提供氮肥；至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其處于缺氮刺激狀態(tài)下加入的；養(yǎng)殖時間10天以上。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，只有在藻液中的氮肥被微藻消耗至使其處于缺氮刺激狀態(tài)下，才加入氮肥。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少有一次氮肥是在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情況下加入的。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，只有在藻液中的氮肥在被微藻基本或全部消耗完的情況下，才加入氮肥。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每次加入的氮肥為微藻12小時的消耗量~72小時的消耗量。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，每次加入的氮肥量為微藻12小時的消耗量~48小時的消耗量。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，每次加入的氮肥量為微藻12小時的消耗量~24小時的消耗量。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當藻液達到采收濃度且藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完時，再進行采收。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氮肥選自尿素、銨鹽、硝酸鹽和氨基酸中的一種或幾種。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)溫度為15~40°C;光強為2000~200000勒克斯；在微藻培養(yǎng)過程中通入CO2,并使藻液pH值在6~10的范圍內(nèi)。
11.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，養(yǎng)殖時間20天以上。
12.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻屬于硅藻門、綠藻門或金藻門。
13.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在氮肥耗光時立即補加氮肥或在氮肥耗光后的72h內(nèi)補加氮肥。
14.一種養(yǎng)殖微藻的方法，分多次為微藻提供氮肥，每次加入的氮肥量為0.03~0.9mmol/L,只有在藻液中的氮肥被微藻基本或全部消耗完的情況下，才加入氮肥，養(yǎng)殖時間10天以上；所述微藻為小球藻或柵藻。
15.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，控制每次氮肥的加入量，使其在72h內(nèi)被微藻消耗完。
16.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的氮肥選自尿素、銨鹽、硝酸鹽和氨基酸中的一種或幾種。
17.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)溫度為15~40°C;光強為2000~200000勒克斯；在微藻培養(yǎng)過程中通入CO2,并使藻液pH值在6~10的范圍內(nèi)。
18.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，養(yǎng)殖時間20天以上。
19.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在氮肥耗光時立即補加氮肥或在氮肥耗光后的72h內(nèi)補加氮肥。
20.一種生產(chǎn)油脂的方法，包括微藻養(yǎng)殖、微藻采收、微藻油脂的分離和提取，其特征在于，微藻養(yǎng)殖米用權(quán)利要求1或14的方法。
【文檔編號】C12R1/89GK104046567SQ201310087429
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月17日
【發(fā)明者】榮峻峰, 周旭華, 朱俊英, 黃緒耕 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司石油化工科學(xué)研究院