專利名稱：檢測hiv-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測Hiv-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
一、核苷和核苷類似物類藥物作用機制:人類免疫缺陷病毒(HIV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，又分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區(qū)的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染，現(xiàn)有藥物主要是抑制HIV-1型病毒的復制。自從1995年開始應用新的抗病毒治療方案，即聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的HAART以來，HIV感染的臨床進程被大大改變。這些藥物通過阻斷病毒復制使得免疫系統(tǒng)重建其CD4+T細胞庫并恢復對病原體的免疫力，明顯降低了 HIV/AIDS相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率。截至目前，美國FDA已經(jīng)批準了 4大類共26種抗病毒藥物用于艾滋病的臨床治療，其中包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,nRTI)、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)、蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)和融合抑制劑(fusion inhibitors)。我國已有5種國產(chǎn)抗病毒藥物進入臨床。在HIV-1的復制循環(huán)中，逆轉(zhuǎn)錄酶在完成RNA指導的DNA合成、RNA水解反應和DNA指導的DNA合成過程中起著十分重要的作用。因此，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶是抗HIV/AIDS藥物設計的一個重要生物靶點。目前市場上出現(xiàn)的以HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶為靶點的藥物按作用機制和化學結(jié)構(gòu)可分為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是最先問世、開發(fā)品種較多的一類藥物，臨床證實對HIV復制具有很強的抑制作用，核 苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nRTIs)，是HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶作用底物脫氧核苷酸的類似物，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性的三磷酸核苷衍生物，與天然的三磷酸脫氧核苷競爭性與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)結(jié)合,抑制RT的作用，阻礙前病毒的合成。已上市的nRTIs藥物有:齊多夫定、去輕肌苷、扎西他濱(DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韋等。nRTIs的結(jié)構(gòu)與核苷類似，為雙脫氧核苷衍生物，可與細胞內(nèi)核苷競爭性地結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶，從而終止逆轉(zhuǎn)錄反應。通過阻斷病毒RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄，即阻斷病毒的雙股DNA的形成，使病毒失去復制的模板。此類藥物首先進入被感染的細胞，然后磷酸化形成具有活性的雙脫氧核苷三磷酸化合物，競爭性抑制艾滋病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，可導致未成熟的DNA鏈合成終結(jié)，從而病毒復制受到抑制。早期用于治療AIDS及其相關(guān)綜合征，對治療HIV陽性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及機會性感染率，但不能治愈AIDS。研究表明，核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)用，副作用大，易出現(xiàn)交叉耐藥。二、HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥類型及機制:隨著我國免費艾滋病抗病毒治療的開展，HIV-1病毒耐藥性的監(jiān)測越來越受到重視。HIV-1病毒耐藥性的產(chǎn)生取決于兩方面:病毒復制過程中的高頻突變和抗病毒藥物產(chǎn)生的選擇壓力。HIV-1是RNA病毒，其基因組由單鏈RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA-DNA復合物，進而反向轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA,再由前病毒轉(zhuǎn)錄為病毒基因組RNA,整個過程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性，對轉(zhuǎn)錄錯誤無校正功能，所以轉(zhuǎn)錄的忠實性差，轉(zhuǎn)錄中的堿基錯配常導致基因突變，因此HIV-1病毒復制過程中表現(xiàn)出很高的突變頻率，每個堿基對在每輪復制中發(fā)生突變的頻率約為3.4X 10_5。另一方面，HIV-1病毒復制迅速，感染初期每天可新形成IO9 101°病毒顆粒。HIV-1病毒的高速復制及復制過程中的高頻突變，導致原發(fā)感染的幾個月內(nèi)就可形成非常大量的基因突變病毒。一旦突變發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶的編碼基因序列，就有可能引起逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶分子發(fā)生改變，導致HIV-1病毒對作用于這兩種酶的抑制劑不再敏感，產(chǎn)生耐藥性。開始抗病毒治療后，野生型病毒被顯著抑制，臨床上可見到病毒載量明顯下降，如果藥物對病毒抑制不完全，與耐藥有關(guān)的突變型仍可以持續(xù)復制。在藥物產(chǎn)生的選擇壓力下，耐藥突變型最終取代野生病毒株成為優(yōu)勢群體，臨床上可表現(xiàn)為病毒載量的反彈。核苷和核苷類似物通過抑制RT終止病毒DNA的合成。HIV對這些藥物的耐藥涉及
2種不同機制，即破壞這些類似物與DNA結(jié)合以及將其從過早終止的DNA鏈末端移除。RT的多種變異或組合變異可通過選擇性破壞RT而具有將類似物結(jié)合到DNA的能力，導致耐藥產(chǎn)生。主要包括M184V變異、Q151M變異復合體以及K65R變異。M184V、非胸苷類似物突變?nèi)鏚65R和L74V、多核苷耐藥突變Q151M復合體是通過減少nRTI整合至DNA的機制產(chǎn)生耐藥；脫氧胸腺嘧啶核苷類似物突變(TAMs)、與多核苷耐藥相關(guān)的T69插入以及許多輔助突變是通過促使nRTIs從DNA水解而產(chǎn)生耐藥。M184V變異即在RT第184位的甲硫氨酸被纈氨酸取代，該變異也是導致病毒對拉米夫定耐藥的主要變異。Q151M復合體在HIV-1中相對較少(在所有對核苷類似物耐藥的HIV-1中所占比例小于5%)，但可導致對大部分而非全部(如拉米夫定和替諾福韋)類似物的耐藥。RT的一組變異可導致核苷類似物從DNA鏈末端被移除，促使對所有核苷和核苷酸類似物的耐藥，其中包括替諾福韋。此類變異是逐漸出現(xiàn)的，且出現(xiàn)的順序也是多變的。TAMs突變可分為兩條通路: 一條與T215Y突變有關(guān)(包括M41L、L210W、T215Y和EA4D)，稱為 TAMs-1 ;另一類與 T215F 突變有關(guān)(包括 D67N、K70R、T215F 和 K219Q)，稱為 TAMs-1I。研究認為，在TAMs-1通路中，最初出現(xiàn)的突變是T215Y，隨后是M41L和L210W，之后再在此基礎(chǔ)上逐級積累1-3個其他突變密碼子。至于TAMs-1I通路，很多研究認為K70R突變通常是逆轉(zhuǎn)錄酶在AZT治療過程中最先出現(xiàn)的基因突變。三、Hiv-1病毒的耐藥檢測方法:在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法(highlyactive antiretroviral therapy,HAART)治療中，病毒變異使得治療的敏感性下降，常常導致治療失敗。一些研究顯示，耐藥與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療無效密切相關(guān)，對HIV-1耐藥株進行監(jiān)測以指導臨床用藥及預防耐藥株的迅速上升和擴散日顯其重要性。目前已有數(shù)項研究表明，對病人進行耐藥性檢測具有重要臨床應用價值，因而國際艾滋病學會(International AIDS Society-USA)、歐洲AIDS臨床學會(European AIDSClinical Society, EAcs)等幾個專家組,在其AIDS治療指南當中推薦使用HIV耐藥檢測。耐藥成為AIDS治療面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，同時耐藥性檢測逐漸成為幫助臨床醫(yī)生選擇聯(lián)合用藥方案的重要工具。目前HIV-1病毒耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關(guān)的病
毒基因突變。
基因型檢測的方法有直接測序法、異源雙鏈軌跡試驗(ΗΤΑ)、PCR連續(xù)酶測定試驗、線性探針試驗、限制性內(nèi)切酶酶切試驗、引物特異的PCR測定、RNA酶A (RNaseA)錯配剪切試驗等，其中部分技術(shù)已有商用系統(tǒng)。在進行基因測序后，將測序結(jié)果與標準病毒株比較后可坦福大學耐藥數(shù)據(jù)庫(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐藥數(shù)據(jù)庫。通過輸入所測得的序列，數(shù)據(jù)庫可自動提供病毒基因變異及耐藥結(jié)果。目前已有基于測序技術(shù)的商品化的試劑盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto,Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems,Inc.Foster City, CA,USA)。兩者都已獲得美國FDA批準成為應用于臨床常規(guī)檢測的試劑盒。此外，基于線性探針技術(shù)(Line probe assay)的商品化的試劑盒 LiPA (Innogenetics, Ghent, Belgium)也已用于實驗室研究?；蛐蜋z測的優(yōu)點是可提供交叉耐藥資料，可在樣品收集后I 2周得到結(jié)果，技術(shù)步驟較少，一般情況下費用較便宜。但也存在明顯缺點，即不直接提供藥物的耐受程度，無法定量，部分變異位點與臨床耐受的相關(guān)性無法完全確認，分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關(guān)知識，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對結(jié)果進行正確的分析。表型檢測通過病毒培養(yǎng)，再通過與無耐藥性個體減少HIV復制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC9tl)所需的藥物水平比較來分級耐藥程度。表型分析的標準方法是首先從病人體內(nèi)分離病毒，與待檢藥物共同培養(yǎng)，然后測定不同藥物濃度下外周血單核細胞(PBMC)所產(chǎn)生的p24抗原量，據(jù)此得到IC5(I。該法步驟復雜，對操作技術(shù)要求高，整個過程至少需6周時間，病毒分離培養(yǎng)過程還有可能發(fā)生變異。重組表型方法將病人體內(nèi)HIV-1的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物繼而插入pol基因缺失型HIV-1載體以形成重組病毒，因此重組病毒保持了病人體內(nèi)病毒對藥物的敏感性，然后在不同藥物，同一藥物不同濃度下對重組病毒進行培養(yǎng)，即可測定出對藥物的敏感性。表型耐藥檢測的結(jié)果與基因型檢測結(jié)果通常相同，但有時亦有差異。當耐藥HIV株水平較低時，表型檢測可發(fā)現(xiàn)基因型檢測所沒有提示的耐藥性變異。表型耐藥是耐藥檢測的金標準，直接提供藥物的耐受情況，可定量，但缺點也很明顯，即技術(shù)要求高、費時、費用高昂，因此目前國際上廣泛應用于臨床的是基因型耐藥檢測?；蛐秃捅硇蜋z測的進一步應用限制，包括缺乏對現(xiàn)有檢測方法的質(zhì)量保證；檢測費用較高；對微小病毒標本不敏感；如果存在耐藥病毒，而病毒量又低于20%，現(xiàn)有檢測方法很可能檢測不到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好、靈敏度高、快速、成本低的檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，包括以下16類特異性探針中的至少一類:檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針，為SEQ ID NO:1 9中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 10 17中的任意一種或任意一種的互補 序列；
檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 18 23中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 24 29中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針，為SEQ ID N0:30 39中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 40 45中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:46 51中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 52 57中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變 的特異性探針，為SEQ ID NO: 58 63中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針，為SEQ ID NO:64 69中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針，為SEQ ID NO:70 75中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 76 81中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 90中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針，為SEQ ID NO:91 96中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 97 105中的任意一種或任意一種的互補序列；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 106 116中的任意一種或任意一種的互補序列。作為本發(fā)明的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針的改進:檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針中，SEQ ID NO:1 3中的任意一種為針對第41位氨基酸殘基為M (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID N0:4 9中的任意一種為針對第41位氨基酸殘基為L (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 10 12中的任意一種為針對第62位氨基酸殘基為A (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 13 17中的任意一種為針對第62位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種為針對第65位氨基酸殘基為K (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID N0:21 23中的任意一種為針對第65位氨基酸殘基為R (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；
檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 24 26中的任意一種為針對第67位氨基酸殘基為D (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 27 29中的任意一種為針對第67位氨基酸殘基為N (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針中，SEQ ID NO:30 32中的任意一種為針對第69位氨基酸殘基為T (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:33 39中的任意一種為針對在第69位氨基酸殘基T后插入SSS、SSA或SSG (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 40 42中的任意一種為針對第70位氨基酸殘基為K (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:43 45中的任意一種為針對第70位氨基酸殘基為R (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:46 48中的任意一種為針對第74位氨基酸殘基為L (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:49 51中的任意一種為針對第74位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 52 54中的任意一種為針對第75位氨基酸殘基為V (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 55 57中的任意一種為針對第75位氨基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的 特異性探針中，SEQ ID NO: 58 60中的任意一種為針對第77位氨基酸殘基為F (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID N0:61 63中的任意一種為針對第77位氨基酸殘基為L (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針中，SEQ ID NO:64 66中的任意一種為針對第115位氨基酸殘基為Y (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一種為針對第115位氨基酸殘基為F (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針中，SEQ ID NO:70 72中的任意一種為針對第116位氨基酸殘基為F (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:73 75中的任意一種為針對第116位氨基酸殘基為Y (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 76 78中的任意一種為序列76到序列78是針對第151位氨基酸殘基為Q (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ IDNO: 79 81中的任意一種為針對第151位氨基酸殘基為M (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 82 84中的任意一種為針對第184位氨基酸殘基為M(野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID N0:85 87中的任意一種為針對第184位氨基酸殘基為V(耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQIDNO: 88 90中的任意一種為針對第184位氨基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針中，SEQ ID NO:91 93中的任意一種為針對第210位氨基酸殘基為L (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:94 96中的任意一種為針對第210位氨基酸殘基為W (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針中，SEQ ID N0:97 99中的任意一種為針對第215位氨基酸殘基為T (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ IDNO: 100 102中的任意一種為針對第215位氨基酸殘基為F (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ IDNO: 103 105中的任意一種為針對第215位氨基酸殘基為Y (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 106 108中的任意一種為針對第219位氨基酸殘基為K (野生型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ IDNO: 109 111中的任意一種為針對第219位氨基酸殘基為Q (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ IDNO: 112 116中的任意一種為針對第219位氨基酸殘基為E (耐藥突變型)的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因。利用上述檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針制備而得的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒:除了包括檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Fl 16Y突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和M184I突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和K219E突變的特異性探針外，還包括HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針、表面化學質(zhì)控探針和雜交陽性質(zhì)控探針。作為本發(fā)明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的改進=HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針、表面化學質(zhì)控探針和雜交陽性質(zhì)控探針的長度均為15 35個核苷酸；所述探針的5’端均連接 上10 40個寡聚dT。作為本發(fā)明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的進一步改進:HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針的序列為SEQ ID NO: 117所示或其互補序列；表面化學質(zhì)控探針PBQC-003 為 HEX-poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg_NH2 ；雜交陽性質(zhì)控探針PBQC-002 為 NH2_poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。作為本發(fā)明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的進一步改進:探針固定于載體上，所述載體為硅片、用各種功能基團衍生的膜、或用各種功能基團修飾的玻片。作為本發(fā)明的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒的進一步改進:載體為表面帶有醛基基團修飾的玻片。本發(fā)明還同時公開了一種檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法，包括以下步驟:I)利用所述試劑盒擴增待測的人類免疫缺陷病毒基因組中的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段；2)將步驟I)得到的擴增產(chǎn)物與所述試劑盒中的HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變特異性探針進行雜交，確定待測人類免疫缺陷病毒所含的對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變類型。
作為本發(fā)明的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法的改進:PCR擴增為套式不對稱RT-PCR，其中用外套引物進行的PCR為RT-PCR，取其部分擴增產(chǎn)物作為內(nèi)套引物擴增的模板，用內(nèi)套引物進行的PCR擴增為不對稱PCR。作為本發(fā)明的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法的進一步改進:所述擴增HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段的內(nèi)套引物對，其下游引物的5’端標記有熒光分子，且其5’端序列包含一段與HIV-1基因組及人類基因組序列無關(guān)的序列，使上下游引物的Tm值相差至少8-15° C。本發(fā)明公開的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒，包括擴增HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因的方法，以及與上述擴增的PCR產(chǎn)物進行雜交，檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針。在本發(fā)明中:待測人類免疫缺陷病毒耐藥突變?yōu)閚RTIs耐藥突變(即核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變)。耐藥突變位于人類免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段內(nèi)。檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針的序列可以是如序列SEQ ID NO: 1-117所示，也可以是如序列SEQ IDNO: 1-117所示序列的互補序列。當采用的HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變檢測探針和內(nèi)標探針序列為SEQ IDN0:1-117時，內(nèi)套擴增引物的反向引物被熒光標記；當采用的HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變檢測探針和內(nèi)標探針序列為SEQ ID NO: 1-117所示序列的互補序列時，內(nèi)套擴增引物的正向引物被熒光標記。試劑盒還包括雜交陽性探針的靶標；試劑盒還包括進行PCR擴增和分子雜交反應的反應液，和50%的二甲 亞砜(DMSO)作為點樣和雜交反應的空白對照。所述雜交反應液中含有所述的雜交陽性對照探針的靶標。在本發(fā)明的檢測方法中:所述用內(nèi)套引物進行的不對稱PCR擴增包含兩個階段，每個階段的每個溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個步驟組成，包括10-30個溫度循環(huán)，優(yōu)選為20個溫度循環(huán)。其中第一階段的退火溫度為45-50° C，優(yōu)選為48° C ;第二階段的退火溫度為55-65° C，優(yōu)選為58。Co所述的內(nèi)套引物中的上游引物與下游引物的濃度比例可以是1:2至1: 100之間的任意比例，優(yōu)選為1:5。雜交包括以下步驟:I)將內(nèi)套引物PCR擴增產(chǎn)物與雜交液，及雜交陽性對照探針的靶標混合，高溫變性并速冷以使雙鏈PCR產(chǎn)物解鏈為單鏈；2)上述變性后的雜交混合物與固定于載體上的探針在合適的溫度下雜交一定時間；3)在洗液中清洗，去除未與載體上的探針雜交的PCR產(chǎn)物、鹽離子等雜交液成分。所述的雜交液包含雜交所需的鹽溶液、表面活性劑，以及用于控制雜交嚴謹度的甲酰胺。所述的鹽溶液可以是1-10XSSC，或1-10XSSPE，優(yōu)選為3XSSC或3XSSPE。所述的用于控制雜交嚴謹度的甲酰胺濃度范圍可以是5%-30%，優(yōu)選為20%。
所述的合適的雜交溫度范圍可以介于30° C_42° C，優(yōu)選為32° C。所述的雜交時間可以介于15分鐘至24小時之間，優(yōu)選為2小時。本發(fā)明的用外套引物進行的RT-PCR包含兩個階段:第一階段為逆轉(zhuǎn)錄階段，與常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄方法相同。第二階段為PCR擴增階段，在滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后，在外套引物存在的條件下進行PCR擴增。擴增溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個步驟組成，包括10-40個溫度循環(huán)，優(yōu)選為30個循環(huán)。所述的第二階段退火溫度為45-55° C，優(yōu)選為48° C。所述的不對稱PCR擴增是指通過調(diào)整內(nèi)套引物中上游引物與下游引物的濃度比例，使上游引物的量低于下游引物，以及在擴增的第二階段提高退火溫度(如上文所述)，使得上游引物在該退火溫度下無法與模板復性，而下游引物由于Tm值高于上游引物，在該退火溫度下仍可正常與模板復性并進一步延伸，最終實現(xiàn)PCR擴增產(chǎn)物中兩條鏈的產(chǎn)量不同的不對稱擴增效果，其中能夠與HIV-1耐藥突變特異性探針雜交的單鏈數(shù)量高于該鏈的互補鏈。

所述的上游引物的Tm值高于下游引物，其差值可以是8-15° C之間的任意值，優(yōu)選為10° C。在本發(fā)明中:檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒包括對HIV-1病毒基因組中與耐藥相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段進行套式不對稱PCR擴增及熒光標記的擴增方法，以及與上述擴增的PCR產(chǎn)物進行雜交，檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針。所述HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變是指HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)某個(或多個)核苷酸的突變，進一步改變了該位點所對應的氨基酸殘基類型，導致含有該突變的HIV-1病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑產(chǎn)生耐藥的突變。所述的HIV-1病毒基因組中與核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段是指包含待檢耐藥突變的區(qū)段，具體的是指編碼第I到第257個氨基酸的基因片段。所述的待檢的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變是指針對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶16個氨基酸位點的19種突變類型，具體是指以下突變類型:1)M41L (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第41位氨基酸殘基由M突變?yōu)長)；2)A62V (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第62位氨基酸殘基由A突變?yōu)閂)；3) K65R (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第65位氨基酸殘基由K突變?yōu)镽)；4) D67N (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第67位氨基酸殘基由D突變?yōu)镹)；5) 69INS (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第69位氨基酸殘基后有其他氨基酸殘基插入)；6) K70R (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第70位氨基酸殘基由K突變?yōu)镽)；7) L74V (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第74位氨基酸殘基由L突變?yōu)閂)；8) V75I (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第75位氨基酸殘基由V突變?yōu)镮)；9) F77L (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第77位氨基酸殘基由F突變?yōu)長)；10) Y115F (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第115位氨基酸殘基由Y突變F)；1DF116Y (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第116位氨基酸殘基由F突變?yōu)閅);12) Q151M (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第151位氨基酸殘基由Q突變?yōu)镸)；13)M184V (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第184位氨基酸殘基由M突變?yōu)閂)、M184I (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第184位氨基酸殘基由M突變?yōu)镮)；14) L210W (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第210位氨基酸殘基由L突變?yōu)镺 ；15) T215Y (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第215位氨基酸殘基由T突變?yōu)閅)、T215F (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第215位氨基酸殘基由T突變?yōu)镕)；16)K219Q (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第219位氨基酸殘基由K突變?yōu)镼)、K219E (即逆轉(zhuǎn)錄酶基因的第219位氨基酸殘基由K突變?yōu)镋)。所述擴增HIV-1病毒基因組中與耐藥相關(guān)的編碼逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段的引物分為外套正向引物和外套反向引物，以及內(nèi)套正向引物和內(nèi)套反向引物，大小均為15-50個核苷酸，優(yōu)選為15-45個核苷酸；所述的內(nèi)套反向引物5’-末端連接上加尾序列后,再被突光標記。所述的外套引物可擴增HIV- 1病毒基因組中長度為1300bps的片段，包含HIV-1蛋白酶基因上游的132bps片段、所述的蛋白酶基因編碼第I到第99個氨基酸的基因片段和逆轉(zhuǎn)錄酶基因編碼第I到第290個氨基酸的基因片段。所述的內(nèi)套引物可擴增858bp的片段，包含逆轉(zhuǎn)錄酶基因編碼第I到第257個氨基酸的基因片段。所述試劑盒還包括檢測Hiv-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針、內(nèi)標探針、表面化學質(zhì)控探針、雜交陽性探針以及所述雜交陽性探針的祀標。所述探針的大小均為12-24個核苷酸，優(yōu)選為15-20個核苷酸；所述探針的5’-末端連接上10-40個寡聚dT，優(yōu)選連接上20-30個寡聚dT。所述的檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針為單鏈DNA，包括序列表中序列I到序列117所示序列，以及序列表中序列I到序列117所示序列的互補序列，優(yōu)選為序列表中序列I到序列117所示序列。當采用的HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變檢測探針為序列表中序列I到序列117所示序列時，內(nèi)套擴增引物的反向引物5’ -末端連接上加尾序列后，再被熒光標記；當采用的HIV-1耐藥突變檢測探針為序列表中序列I到序列117所示序列的互補序列時，內(nèi)套擴增引物的正向引物5’ -末端連接上加尾序列后，再被熒光標記。本發(fā)明的內(nèi)標探針具有序列表中序列117的核苷酸序列，是針對逆轉(zhuǎn)錄酶基因擴增片段內(nèi)的保守序列，無論是野生型HIV-1病毒，還是包含上述任何核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的HIV-1病毒均可與該探針雜交。所述的表面化學質(zhì)控探針(PBQC-003)主要用于芯片制備過程中監(jiān)控芯片表面化學性質(zhì)，檢測探針固定效率，其序列可以是與待檢測序列無同源性的任何序列，長度介于20-70個寡核苷酸，其5’端被突光分子標記；所述的雜交陽性質(zhì)控探針(PBQC-002)主要用于監(jiān)控芯片雜交過程，其序列可以是與待檢測序列無同源性的任何序列，長度介于20-70個寡核苷酸；所述的雜交陽性對照探針的靶標(PBQC-001)是與所述的雜交陽性質(zhì)控探針(PBQC-002)序列完全互補的寡核苷酸，其5’端被突光分子標記。本發(fā)明所述的檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒具有集成化程度高、靈敏度高、特異性好，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，成本低的特點，可廣泛用于HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的發(fā)生、發(fā)展的流行病學監(jiān)測，為合理用藥，有效降低和延緩耐藥得發(fā)生提供有效工具。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的探針點陣排布圖；圖2為檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑單位點耐藥突變的雜交反應結(jié)果圖；圖3為檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑多位點耐藥突變的雜交反應結(jié)果圖；圖4為檢測全血、血漿以及核酸樣品中HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的雜交反應結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例1、利用本發(fā)明檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑單位點耐藥突變本實施例檢測了本發(fā)明所涉及的所有HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變類型，以及不包含任何突變的野生型HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因類型。1.寡核苷酸引物和探針的制備表I和表2顯示了本發(fā)明檢測HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變所用的引物和探針的序列，均委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。表1HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段擴增引物
權(quán)利要求
1.檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是:包括以下16類特異性探針中的至少一類: 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1、中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 1(Γ 7中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 18 23中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 24 29中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 30 39中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針，為SEQ ID NO:40 45中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 46 51中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 52 57中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 58 63中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針，為SEQ ID Ν0:64 69中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 70 75中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 76 81中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 90中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針，為SEQ ID NO:91 96中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Τ215Υ和T215F突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 97 105中的任意一種或任意一種的互補序列； 檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 106 116中的任意一種或任意一種的互補序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，其特征是: 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 1 3中的任意一種為針對第41位氨基酸殘基為M的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 4、中的任意一種為針對第41位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因；所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一種為針對第62位氨基酸殘基為A的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 13^17中的任意一種為針對第62位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種為針對第65位氨基酸殘基為K的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ23中的任意一種為針對第65位氨基酸殘基為R的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 24 26中的任意一種為針對第67位氨基酸殘基為D的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 27 29中的任意一種為針對第67位氨基酸殘基為N的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針中，SEQ ID ΝΟ:3(Γ32中的任意一種為針對第69位氨基酸殘基為T的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 33 39中的任意一種為針對在第69位氨基酸殘基T后插入SSS、SSA或SSG的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針中，SEQ ID ΝΟ:4(Γ42中的任意一種為針對第70位氨基酸殘基為K的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:43^45中的任意一種為針對第70位氨基酸殘基為R的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針中，SEQ ID N0:46 48中的任意一種為針對第74位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:49^51中的任意一種為針對第74位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 52 54中的任意一種為針對第75位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 55 57中的任意一種為針對第75位氨基酸殘基為I的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄 酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 58 60中的任意一種為針對第77位氨基酸殘基為F的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID ΝΟ:6Γ63中的任意一種為針對第77位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針中，SEQ ID Ν0:64 66中的任意一種為針對第115位氨基酸殘基為Y的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一種為針對第115位氨基酸殘基為F的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針中，SEQ ID NO:70 72中的任意一種為針對第116位氨基酸殘基為F的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:73 75中的任意一種為針對第116位氨基酸殘基為Y的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 76 78中的任意一種為序列76到序列78是針對第151位氨基酸殘基為Q的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 701中的任意一種為針對第151位氨基酸殘基為M的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針中，SEQ ID NO:82 84中的任意一種為針對第184位氨基酸殘基為M的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:85 87中的任意一種為針對第184位氨基酸殘基為V的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO:88 90中的任意一種為針對第184位氨基酸殘基為I的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針中，SEQ ID NO:91 93中的任意一種為針對第210位氨基酸殘基為L的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID Ν0:94 96中的任意一種為針對第210位氨基酸殘基為W的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因T215Y和T215F突變的特異性探針中，SEQ ID NO:97 99中的任意一種為針對第215位氨基酸殘基為T的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID N0:10(Tl02中的任意一種為針對第215位氨基酸殘基為F的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 103 105中的任意一種為針對第215位氨基酸殘基為Y的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因； 所述檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 106 108中的任意一種為針對第219位氨基酸殘基為K的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 109 111中的任意一種為針對第219位氨基酸殘基為Q的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因，SEQ ID NO: 112 116中的任意一種為針對第219位氨基酸殘基為E的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因。
3.利用如權(quán)利要求1或2所述的檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針制備而得的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特征是: 除了包括檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Q151M突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M184V和Μ184Ι突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L210W突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基 因Τ215Υ和T215F突變的特異性探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K219Q和Κ219Ε突變的特異性探針外， 還包括HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針、表面化學質(zhì)控探針和雜交陽性質(zhì)控探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特征是: HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針、表面化學質(zhì)控探針和雜交陽性質(zhì)控探針的長度均為15 35個核苷酸；所述探針的5’端均連接上1(Γ40個寡聚dT。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特征是: 所述HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因內(nèi)標探針的序列為SEQ ID NO: 117或其互補序列； 所述表面化學質(zhì)控探針 PBQC-003 為 HEX- poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2 ； 所述雜交陽性質(zhì)控探針 PBQC-002 為 NH2-Poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特征是:用于固定探針的載體為硅片、用各種功能基團衍生的膜、或用各種功能基團修飾的玻片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的試劑盒，其特征是:所述載體為表面帶有醛基基團修飾的玻片。
8.檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法，其特征是:包括以下步驟: 1)利用所述試劑盒擴增待測的人類免疫缺陷病毒基因組中的逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段； 2)將步驟I)得到的擴增產(chǎn)物與所述試劑盒中的HIV-1病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變特異性探針進行雜交，確定待測人類免疫缺陷病毒所含的對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變類型。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法，其特征是=PCR擴增為套式不對稱RT-PCR，其中用外套引物進行的PCR為RT-PCR，取其部分擴增產(chǎn)物作為內(nèi)套引物擴增的模板，用內(nèi)套引物進行的PCR擴增為不對稱PCR。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測人類免疫缺陷病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的方法，其特征是: 所述擴增HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因區(qū)段的內(nèi)套引物對，其下游引物的5’端標記有熒光分子，且其5’端序列包含一段與HIV-1基因組及人類基因組序列無關(guān)的序列，使上下游引物的Tm值相差至少8-15° C。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測HIV-1病毒核苷類抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。具體而言，本發(fā)明公開了檢測人類免疫缺陷病毒核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變的特異性探針，包括檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因M41L突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因A62V突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K65R突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因D67N突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因69INS插入突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因K70R突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因L74V突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因V75I突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F77L突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因Y115F突變的探針、檢測逆轉(zhuǎn)錄酶基因F116Y突變的探針等等。
文檔編號C12R1/93GK103215378SQ20131008882
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者張瓊, 李蘭娟, 項春生, 吳南屏 申請人:浙江大學