專利名稱：Hiv-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)Hiv-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
一、蛋白酶抑制劑類藥物及其作用機(jī)制獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又稱艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原體為HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus,HIV),HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區(qū)的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。蛋白酶(Prote ase)對(duì)于HIV-1病毒中g(shù)ag,gag-pol多聚蛋白和翻譯后加工、形成病毒核心的結(jié)構(gòu)蛋白以及其他基本的酶類，都是十分必要的。HIV-1病毒進(jìn)入血液后，病毒表面的包膜蛋白gpl20和OT4 + T淋巴細(xì)胞表面的⑶4受體結(jié)合，在gp41透膜蛋白的作用下，侵入細(xì)胞并脫殼。蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors，PIs)主要以氫鍵方式與HIV-1病毒蛋白酶的Asp25、GLy27、Asp29殘基相互作用，與蛋白酶活性中的氨基酸殘基形成立體相互作用，使病毒蛋白的長(zhǎng)鏈不能裂開(kāi)，從而抑制蛋白酶的活性，致使HIV在被感染的細(xì)胞中產(chǎn)生不成熟的、不具有感染性的病毒顆粒，從而達(dá)到使病毒不能正常裝配，抑制HIV目的。自1994年肽底物類似物蛋白酶抑制劑問(wèn)世以來(lái)，截至目前，經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的此類抑制劑已有10種，其中洛匹那韋(1pinavir/r, LPV)、阿扎那韋(atazanavir/r,ATv)、福沙普利那韋(fosamprenavir/r)和沙奎那韋(saquinavir/r, SQV)用于一線治療，替拉那韋(fipranavir/r)和大諾那韋(darunavir/r)用于挽救治療。這類藥物能迅速降低血漿中HIV-1病毒載量，療效突出，蛋白酶抑制劑已成為AIDS聯(lián)合用藥方案的重要組成部分，同時(shí)在補(bǔ)救治療(Salvage therapy)中亦發(fā)揮重要作用。二、HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥類型及機(jī)制HIV蛋白酶是一個(gè)具有底物結(jié)合腔，呈中心對(duì)稱的同型二聚體，在特定位點(diǎn)剪切大分子多肽前體，釋放裝配感染性病毒顆粒所必須的結(jié)構(gòu)蛋白和酶。當(dāng)缺少這些功能蛋白酶時(shí)，則只能生成沒(méi)有感染能力的不成熟病毒顆粒。蛋白酶抑制劑對(duì)HIV蛋白酶活性位點(diǎn)均具強(qiáng)親和力，可抑制酶的催化活性。蛋白酶抑制劑發(fā)生耐藥的機(jī)制是HIV蛋白酶底物結(jié)合域或其遠(yuǎn)端位點(diǎn)的氨基酸置換，直接或間接修改了 PIs與酶接觸位點(diǎn)的數(shù)量和性質(zhì)，進(jìn)而降低PIs與酶的親和力。迄今已發(fā)現(xiàn)與Pls耐藥相關(guān)的HIV-1突變有60多個(gè)，主要的耐藥位點(diǎn)有23、30、32、47、48、50、82和84 ;位于邊緣的46,54位點(diǎn)；位于酶內(nèi)部的76,88和90。24、33、53和73位突變經(jīng)常出現(xiàn)，這些位點(diǎn)對(duì)不同的Pls有不同的影響。L231、D30N、M46WL、G48V/M、184V、N88D/S和L90M突變會(huì)降低對(duì)奈非那韋(nelfinavlr, NFV)的敏感性;I50L、N88S和184V降低對(duì)ATV的敏感性；G48V/M、184V和L90M降低對(duì)SQV的敏感性；V321、147V/A、154L/M和184V降低對(duì)fosamprenavir/r的敏感性；V47A降低對(duì)LPV的敏感性；V82L/T與tipranavir/r耐藥有關(guān)。有些突變可以增加一種或多種PIs的敏感性:I50L可以增加所有PIs的敏感性；I50V和154L可增加tipranavir敏感性；N88S可增加fosamprensvir敏感性；L76V可增加Alrv、SQV和fipranavir的敏感性。PI類耐藥突變發(fā)生比較慢，多個(gè)位點(diǎn)突變才產(chǎn)生完全耐藥，交叉耐藥比較少見(jiàn)，耐藥突變具有藥物特異性。例如，D30N位點(diǎn)突變與NFV有關(guān)，150V突變與APV有關(guān)，G48V和L90M突變與SQV有關(guān)，I50L突變與ATV相關(guān)。然而，蛋白酶其他位點(diǎn)，如編碼區(qū)82、84、90位點(diǎn)突變將產(chǎn)生交叉耐藥。三、HIV-1的耐藥檢測(cè)方法目前HIV-1病毒耐藥性檢測(cè)有兩種方法，即表型檢測(cè)及基因型檢測(cè)。表型檢測(cè)通過(guò)用藥期間的病毒培養(yǎng)進(jìn)行，而基因型檢測(cè)則通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)與耐藥性相關(guān)的病
毒基因突變。基因型檢測(cè)的方法有直接測(cè)序法、異源雙鏈軌跡試驗(yàn)(HTA)、PCR連續(xù)酶測(cè)定試驗(yàn)、線性探針試驗(yàn)、限制性內(nèi)切酶酶切試驗(yàn)、引物特異的PCR測(cè)定、RNA酶A(RNase A)錯(cuò)配剪切試驗(yàn)等，其中部分技術(shù)已有商用系統(tǒng)。在進(jìn)行基因測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)病毒株比較后可坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)輸入所測(cè)得的序列，數(shù)據(jù)庫(kù)可自動(dòng)提供病毒基因變異及耐藥結(jié)果。目前已有基于測(cè)序技術(shù)的商品化的試劑盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto, Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems, Inc.Foster City, CA, USA)。兩者都已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)成為應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測(cè)的試劑盒。此外，基于線性探針技術(shù)(Line probe assay)的商品化的試劑盒 LiPA(Innogenetics,Ghent,Belgium)也已用于實(shí)驗(yàn)室研究?；蛐蜋z測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是可提供交叉耐藥資料，可在樣品收集后I 2周得到結(jié)果，技術(shù)步驟較少，一般情況下費(fèi)用較便宜。但也存在明顯缺點(diǎn)，即不直接提供藥物的耐受程度，無(wú)法定量，部分變異位點(diǎn)與臨床耐受的相關(guān)性無(wú)法完全確認(rèn)，分析基因型耐藥檢測(cè)時(shí)，需要掌握大量相關(guān)知識(shí)，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確的分析。表型檢測(cè)通過(guò)病毒培養(yǎng)，再通過(guò)與無(wú)耐藥性個(gè)體減少HIV復(fù)制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC90)所需的藥物水平比較來(lái)分級(jí)耐藥程度。表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法是首先從病人體內(nèi)分離病毒，與待檢藥物共同培養(yǎng)，然后測(cè)定不同藥物濃度下外周血單核細(xì)胞(PBMC)所產(chǎn)生的p24抗原量，據(jù)此得到IC5(I。該法步驟復(fù)雜，對(duì)操作技術(shù)要求高，整個(gè)過(guò)程至少需6周時(shí)間，病毒分離培養(yǎng)過(guò)程還有可能發(fā)生變異。重組表型方法將病人體內(nèi)HIV-1的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物繼而插入pol基因缺失型HIV-1載體以形成重組病毒，因此重組病毒保持了病人體內(nèi)病毒對(duì)藥物的敏感性，然后在不同藥物，同一藥物不同濃度下對(duì)重組病毒進(jìn)行培養(yǎng)，即可測(cè)定出對(duì)藥物的敏感性。表型耐藥檢測(cè)的結(jié)果與基因型檢測(cè)結(jié)果通常相同，但有時(shí)亦有差異。當(dāng)耐藥HIV株水平較低時(shí)，表型檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)基因型檢測(cè)所沒(méi)有提示的耐藥性變異。表型耐藥是耐藥檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，直接提供藥物的耐受情況，可定量，但缺點(diǎn)也很明顯，即技術(shù)要求高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)用高昂，因此目前國(guó)際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測(cè)。 基因型和表型檢測(cè)的進(jìn)一步應(yīng)用限制，包括缺乏對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的質(zhì)量保證；檢測(cè)費(fèi)用較高；對(duì)微小病毒標(biāo)本不敏感；如果存在耐藥病毒，而病毒量又低于20%，現(xiàn)有檢測(cè)方法很可能檢測(cè)不到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性好、靈敏度高、快速、成本低的檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針:包括以下11類特異性探針中的至少一類:檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針，為SEQ ID NO:1 6中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針，為SEQ ID N0:7 14中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 15 31中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針，為SEQ ID NO:32 40中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:41 46中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:47 52中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶 基因I54V突變的特異性探針，為SEQ ID N0:53 61中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針，為SEQ ID N0:62 81中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 87中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針，為SEQ ID NO:88 93中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列；檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針，為SEQ ID NO:94 99中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列。作為本發(fā)明的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針的改進(jìn):檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針中，SEQ ID NO:1 3中的任意一種針對(duì)第30位氨基酸殘基為D (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID N0:4 6中的任意一種針對(duì)第30位氨基酸殘基為N (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針中，SEQ ID N0:7 9中的任意一種針對(duì)第32位氨基酸殘基為V (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 10 14中的任意一種針對(duì)第32位氨基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 15 17中的任意一種針對(duì)第46位氨基酸殘基為M (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種針對(duì)第46位氨基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ IDNO:21 31中的任意一種是針對(duì)第46位氨基酸殘基為L(zhǎng) (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針中，SEQ ID N0:32 34中的任意一種是針對(duì)第47位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:35 37中的任意一種是針對(duì)第47位氨基酸殘基為A (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQID NO:38 40中的任意一種是針對(duì)第47位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:41 43中的任意一種是針對(duì)第48位氨基酸殘基為G (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:44 46中的任意一種是針對(duì)第48位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:47 49中的任意一種是針對(duì)第50位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 50 52中的任意一種是針對(duì)第50位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 53 55中的任意一種是針對(duì)第54位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 56 61中的任意一種是針對(duì)第54位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V 82F、V82T和V82S突變的特異性探針中，SEQ IDNO:62 66中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為V (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為A (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:70 75中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為F (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:76 78中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為T (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 79 81中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為S (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:82 84中的任意一種是針對(duì)第84位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:85 87中的任意一種是針對(duì)第84位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針中，SEQ ID NO:88 90中的任意一種是針對(duì)第88位氨基酸殘基為N (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID N0:91 93中的任意一種是針對(duì)第88位氨基酸殘基為D (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因；所述檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針中，SEQ ID NO:94 96中的任意一種是針對(duì)第90位氨基酸殘基為L(zhǎng) (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:97 99中的任意一種是針對(duì)第90位氨基酸殘基為M (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。本發(fā)明還提供了一種利用檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針制備而成的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒:除了包括檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針外；還包括表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交陽(yáng)性探針以及HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針。作為本發(fā)明的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒的改進(jìn):HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針、表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交陽(yáng)性探針的長(zhǎng)度均為15-35個(gè)核苷酸；所述探針的5’端均連接上10-40個(gè)寡聚dT。備注說(shuō)明:上述檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的特異性探針也均滿足以下特征:長(zhǎng)度均為15-35個(gè)核苷酸；所述探針的5’端均連接上10-40個(gè)寡聚dT。作為本發(fā)明的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn):HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針為SEQ ID NO: 100所述的核苷酸序列；表面化學(xué)質(zhì)控探針PBQC-003 為:HEX_poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg_NH2 ；雜交陽(yáng)性質(zhì)控探針PBQC-002 為:NH2_poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。作為本發(fā)明的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn):探針固定于載體上；載體為硅片、用各種功能基團(tuán)衍生的膜，或用各種功能基團(tuán)修飾的玻片。作為本發(fā)明的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn):載體為表面帶有醛基基團(tuán)修飾的玻片。備注說(shuō)明:試 劑盒還包括進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分子雜交反應(yīng)的反應(yīng)液，和50%的二甲亞砜(DMSO)作為點(diǎn)樣和雜交反應(yīng)的空白對(duì)照。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法，包括以下步驟:I)、利用所述試劑盒擴(kuò)增待測(cè)的人類免疫缺陷病毒基因組中的蛋白酶基因區(qū)段；2)、將步驟I)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述試劑盒中的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變特異性探針進(jìn)行雜交，確定待測(cè)人類免疫缺陷病毒所含的耐藥突變類型。本發(fā)明的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒，包括擴(kuò)增HIV-1病毒蛋白酶基因區(qū)段的套式不對(duì)稱RT-PCR擴(kuò)增方法，以及與上述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，檢測(cè)HIV-1蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針；所述探針的堿基序列如SEQIDNO:1-100 所示。本發(fā)明所述的待測(cè)人類免疫缺陷病毒耐藥突變?yōu)镻Is耐藥突變(即蛋白酶抑制劑耐藥突變)。耐藥突變位于人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因區(qū)段內(nèi)。本發(fā)明所述的檢測(cè)HIV-1蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針、HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針的序列可以是如序列SEQ ID NO: 1-100所示，也可以是如序列SEQ ID NO: 1-100所示序列的互補(bǔ)序列。在本發(fā)明中:當(dāng)采用的HIV-1對(duì)蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQ ID N0:l-100時(shí)，內(nèi)套擴(kuò)增引物的反向引物被熒光標(biāo)記；當(dāng)采用的HIV-1對(duì)蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQ ID NO: 1-100所示序列的互補(bǔ)序列時(shí)，內(nèi)套擴(kuò)增引物的正向引物被熒光標(biāo)記。在本發(fā)明中:PCR擴(kuò)增為套式不對(duì)稱RT-PCR，其中用外套引物進(jìn)行的PCR為RT-PCR，取其部分?jǐn)U增產(chǎn)物作為內(nèi)套引物擴(kuò)增的模板，用內(nèi)套引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增為不對(duì)稱PCR。擴(kuò)增HIV-1病毒蛋白酶基因區(qū)段的內(nèi)套引物對(duì)，其下游引物的5’端標(biāo)記有熒光分子，且其5’端序列包含一段與HIV-1基因組及人類基因組序列無(wú)關(guān)的序列，使上下游引物的Tm值相差至少8-15° C。用內(nèi)套引物進(jìn)行的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增分為兩個(gè)階段，每個(gè)階段的每個(gè)溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個(gè)步驟組成，包括10-30個(gè)溫度循環(huán)；其中第一階段的退火溫度為45-55° C ;第二階段的退火溫度為55-65° C。用內(nèi)套引物進(jìn)行的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，內(nèi)套引物的上下游引物濃度比例為1:2至1:100之間。雜交包括以下步驟:1)將內(nèi)套引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液，及雜交陽(yáng)性對(duì)照探針的靶標(biāo)混合，高溫變性并速冷以使雙鏈PCR產(chǎn)物解鏈為單鏈；2)上述變性后的雜交混合物與固定于載體上的探針在合適的溫度下雜交一定時(shí)間；3)在洗液中清洗，去除未與載體上的探針雜交的PCR產(chǎn)物、鹽離子等雜交液成分。在本發(fā)明中:HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變是指HIV-1病毒蛋白酶基因內(nèi)某個(gè)(或多個(gè))核苷酸的突變，進(jìn)一步改變了其氨基酸類型，導(dǎo)致含有該突變的HIV-1病毒對(duì)蛋白酶抑制劑類產(chǎn)生耐藥的突變。HIV-1基因組中與耐藥相關(guān)的蛋白酶基因區(qū)段是指包含待檢的蛋白酶抑制劑耐藥突變的區(qū)段，具體的是指編碼第1到第99個(gè)氨基酸的基因片段。待檢的蛋白酶抑制劑耐藥突變是指針對(duì)HIV-1病毒蛋白酶11個(gè)氨基酸位點(diǎn)的16種突變類型，具體是指以下突變類型:DD30N (即蛋白酶基因的第30位氨基酸殘基由D突變?yōu)镹);2)V32I (即蛋白酶基因的第32位氨基酸殘基由V突變?yōu)镮);3)M46I (即蛋白酶基因的第46位氨基酸殘基由M突變?yōu)镮)、M46L (即蛋白酶基因的第46位氨基酸殘基由M突變?yōu)長(zhǎng))；4) I47V (即蛋白酶基因的第47位氨基酸殘基由I突變?yōu)閂)、I47A (即蛋白酶基因的第47位氨基酸殘基由I突變?yōu)锳)；5)G48V (即蛋白酶基因的第48位氨基酸殘基由G突變?yōu)閂);6) I50V (即蛋白酶基因的第50位氨基酸殘基由I突變?yōu)閂)；7) I54V (即蛋白酶基因的第54位氨基酸殘基由I突變?yōu)閂)；8)V82A (即蛋白酶基因的第82位氨基酸殘基由V突變?yōu)锳)、V82F (即蛋白酶基因的第82位氨基酸殘基由V突變?yōu)镕)、V82T (即蛋白酶基因的第82位氨基酸殘基由V突變?yōu)門)、V82S (即蛋白酶基因的第82位氨基酸殘基由V突變?yōu)镾)；9) I84V (即蛋白酶基因的第84位氨基酸殘基由I突變?yōu)閂);10)N88D (即蛋白酶基因的第88位氨基酸殘基由N突變?yōu)镈);1DL90M (即蛋白酶基因的第90位氨基酸殘基由L突變?yōu)镸)。所述擴(kuò)增HIV-1病毒基因組中與對(duì)蛋白酶抑制劑耐藥相關(guān)的蛋白酶基因區(qū)段的引物分為外套正向引物和外套反向引物，以及內(nèi)套正向引物和內(nèi)套反向引物，大小均為15-50個(gè)核苷酸,優(yōu)選為15-45個(gè)核苷酸；所述的內(nèi)套反向引物5’ -末端連接上加尾序列后，再被熒光標(biāo)記。所述的外套引物可擴(kuò)增HIV-1病毒基因組中長(zhǎng)度為1300bps的片段，包含HIV-1病毒蛋白酶基因上游的132bps片段、所述的蛋白酶基因編碼第I到第99個(gè)氨基酸的基因片段和逆轉(zhuǎn)錄酶基因編碼第I到第290個(gè)氨基酸的基因片段。所述的內(nèi)套引物可擴(kuò)增HIV-1病毒基因組中長(zhǎng)度為508bp的片段，包含蛋白酶基因的全部編碼區(qū)序列。所述試劑盒還包括檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的特異性探針、內(nèi)標(biāo)探針、表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交陽(yáng)性探針以及所述雜交陽(yáng)性探針的靶標(biāo)。所述探針的大小均為12-24個(gè)核苷酸，優(yōu)選為15-20個(gè)核苷酸；所述探針的5’-末端連接上10-40個(gè)寡聚dT，優(yōu)選連接上20-30個(gè)寡聚dT。所述檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的特異性探針為單鏈DNA，包括序列表中序列I到序列100所示序列，以及序列表中序列I到序列100所示序列的互補(bǔ)序列，優(yōu)選為序列表中序列I到序列100所示序列。當(dāng)采用的HIV-1耐藥突變檢測(cè)探針為序列表中序列I到序列100所示序列時(shí)，內(nèi)套擴(kuò)增引物的反向引物5’-末端連接上加尾序列后，再被熒光標(biāo)記；當(dāng)采用的HIV-1耐藥突變檢測(cè)探針為序列表中序列I到序列100所示序列的互補(bǔ)序列時(shí)，內(nèi)套擴(kuò)增引物的正向引物5’ -末端連接上加尾序列后，再被熒光標(biāo)記。所述的檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針具有序列表中序列I到序列6的核苷酸序列，其中序列I到序列3是針對(duì)第30位氨基酸殘基為D (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列4到序列6是針對(duì)第41位氨基酸殘基為N (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針具有序列表中序列7到序列14的核苷酸序列，其中序列7到序列9是針對(duì)第32位氨基酸殘基為V (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列10到 序列14是針對(duì)第32位氨基酸殘基為I (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針具有序列表中序列15到序列31的核苷酸序列，其中序列15到序列17是針對(duì)第46位氨基酸殘基為M (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列18到序列20是針對(duì)第46位氨基酸殘基為1(耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，序列21到序列31是針對(duì)第46位氨基酸殘基為L(zhǎng) (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針具有序列表中序列32到序列40的核苷酸序列，其中序列32到序列34是針對(duì)第47位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列35到序列37是針對(duì)第47位氨基酸殘基為A(耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，序列38到序列40是針對(duì)第47位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針具有序列表中序列41到序列46的核苷酸序列，其中序列41到序列43是針對(duì)第48位氨基酸殘基為G (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列44到序列46是針對(duì)第48位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針具有序列表中序列47到序列52的核苷酸序列，其中序列47到序列49是針對(duì)第50位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列50到序列52是針對(duì)第50位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的特異性探針具有序列表中序列53到序列61的核苷酸序列，其中序列53到序列55是針對(duì)第54位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列56到序列61是針對(duì)第54位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針具有序列表中序列62到序列81的核苷酸序列，其中序列62到序列66是針對(duì)第82位氨基酸殘基為V(野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列67到序列69是針對(duì)第82位氨基酸殘基為A (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，序列70到序列75是針對(duì)第82位氨基酸殘基為F (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，序列76到序列78是針對(duì)第82位氨基酸殘基為T (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因，序列79到序列81是針對(duì)第82位氨基酸殘基為S (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針具有序列表中序列82到序列87的核苷酸序列，其中序列82到序列84是針對(duì)第84位氨基酸殘基為I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列85到序列87是針對(duì)第84位氨基酸殘基為V (耐藥突變型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針具有序列表中序列88到序列93的核苷酸序列，其中序列88到序列90 是針對(duì)第88位氨基酸殘基為N (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列91到序列93是針對(duì)第88位氨基酸殘基為D (耐藥突變型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針具有序列表中序列94到序列99的核苷酸序列，其中序列94到序列96是針對(duì)第90位氨基酸殘基為L(zhǎng) (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列97到序列99是針對(duì)第90位氨基酸殘基為M (耐藥突變型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的內(nèi)標(biāo)探針具有序列表中序列100的核昔酸序列，是針對(duì)蛋白酶基因擴(kuò)增片段內(nèi)的保守序列，無(wú)論是野生型Hiv-1病毒，還是包含上述任何耐藥突變的HIV-1病毒均可與該探針雜交。所述的表面化學(xué)質(zhì)控探針(PBQC-003)主要用于芯片制備過(guò)程中監(jiān)控芯片表面化學(xué)性質(zhì)，檢測(cè)探針固定效率，其序列可以是與待檢測(cè)序列無(wú)同源性的任何序列，長(zhǎng)度介于20-70個(gè)寡核苷酸，其5’端被突光分子標(biāo)記；所述的雜交陽(yáng)性質(zhì)控探針(PBQC-002)主要用于監(jiān)控芯片雜交過(guò)程，其序列可以是與待檢測(cè)序列無(wú)同源性的任何序列，長(zhǎng)度介于20-70個(gè)寡核苷酸；所述的雜交陽(yáng)性對(duì)照探針的靶標(biāo)(PBQC-001)是與所述的雜交陽(yáng)性質(zhì)控探針(PBQC-002)序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸，其5’端被突光分子標(biāo)記。上述探針固定于載體上。所述載體可為硅片、用各種功能基團(tuán)衍生的膜，或用各種功能基團(tuán)修飾的玻片，優(yōu)選為醛基基團(tuán)修飾的玻片。所述的試劑盒還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)和雜交反應(yīng)所需的反應(yīng)液，和50%的二甲亞砜(DMSO)作為點(diǎn)樣和雜交反應(yīng)的空白對(duì)照。所述的雜交反應(yīng)液中含有所述的雜交陽(yáng)性對(duì)照探針的靶標(biāo)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用上述試劑盒進(jìn)行HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)的方法，包括以下步驟:I)利用所述試劑盒提供的PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測(cè)的HIV-1基因組中的蛋白酶基因區(qū)段；2)將步驟I)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述試劑盒中固定在載體上的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變特異性探針進(jìn)行雜交，確定待測(cè)HIV-1所含的耐藥突變類型。所述PCR為套式不對(duì)稱RT-PCR，其中用外套引物進(jìn)行的PCR為RT-PCR，取其部分?jǐn)U增產(chǎn)物作為內(nèi)套引物擴(kuò)增的模板，用內(nèi)套引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增為不對(duì)稱PCR。所述用外套引物進(jìn)行的RT-PCR包含兩個(gè)階段:第一階段為逆轉(zhuǎn)錄階段，與常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄方法相同。第二階 段為PCR擴(kuò)增階段，在滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后，在外套引物存在的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個(gè)步驟組成，包括10-40個(gè)溫度循環(huán)，優(yōu)選為30個(gè)循環(huán)。所述的第二階段退火溫度為40-50° C，優(yōu)選為42° C。所述用內(nèi)套引物進(jìn)行的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增包含兩個(gè)階段，每個(gè)階段的每個(gè)溫度循環(huán)由變性、退火和延伸三個(gè)步驟組成，包括10-30個(gè)溫度循環(huán)，優(yōu)選為20個(gè)溫度循環(huán)。其中第一階段的退火溫度為45-50° C，優(yōu)選為48° C ;第二階段的退火溫度為55-65° C，優(yōu)選為58。Co所述的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增是指通過(guò)調(diào)整內(nèi)套引物中上游引物與下游引物的濃度比例，使上游引物的量低于下游引物，以及在擴(kuò)增的第二階段提高退火溫度(如上文所述)，使得上游引物在該退火溫度下無(wú)法與模板復(fù)性，而下游引物由于Tm值高于上游引物，在該退火溫度下仍可正常與模板復(fù)性并進(jìn)一步延伸，最終實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中兩條鏈的產(chǎn)量不同的不對(duì)稱擴(kuò)增效果，其中能夠與HIV-1耐藥突變特異性探針雜交的單鏈數(shù)量高于該鏈的互補(bǔ)鏈。所述的內(nèi)套引物中的上游引物與下游引物的濃度比例可以是1:2至1: 100之間的任意比例，優(yōu)選為1:5。所述的上游引物的Tm值高于下游引物，其差值可以是8-15° C之間的任意值，優(yōu)選為10° C。所述的雜交包括以下步驟:I)將內(nèi)套引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液，及雜交陽(yáng)性對(duì)照探針的靶標(biāo)混合，高溫變性并速冷以使雙鏈PCR產(chǎn)物解鏈為單鏈；2)上述變性后的雜交混合物與固定于載體上的探針在合適的溫度下雜交一定時(shí)間；3)在洗液中清洗，去除未與載體上的探針雜交的PCR產(chǎn)物、鹽離子等雜交液成分。所述的雜交液包含雜交所需的鹽溶液、表面活性劑，以及用于控制雜交嚴(yán)謹(jǐn)度的甲酰胺。所述的鹽溶液可以是1-10XSSC，或1-10XSSPE，優(yōu)選為3XSSC或3XSSPE。所述的用于控制雜交嚴(yán)謹(jǐn)度的甲酰胺濃度范圍可以是5%-30%，優(yōu)選為20%。所述的合適的雜交溫度范圍可以介于30° C_42° C，優(yōu)選為32° C。所述的雜交時(shí)間可以介于15分鐘至24小時(shí)之間，優(yōu)選為2小時(shí)。
本發(fā)明所述的檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒具有集成化程度高、靈敏度高、特異性好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，成本低的特點(diǎn)，可廣泛用于HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變發(fā)生、發(fā)展的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，為合理用藥，有效降低和延緩耐藥的發(fā)生提供有效工具。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為檢測(cè)HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的探針點(diǎn)陣排布圖；圖2為檢測(cè)HIV-1蛋白酶抑制劑單位點(diǎn)耐藥突變的雜交反應(yīng)結(jié)果圖；圖3為檢測(cè)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因多位點(diǎn)耐藥突變的雜交反應(yīng)結(jié)果圖；圖4為檢測(cè)全血、血漿以及核酸樣品中HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的雜交反應(yīng)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:利用本 發(fā)明檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑單位點(diǎn)耐藥突變本實(shí)施例檢測(cè)了本發(fā)明所涉及的所有HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變類型，以及不包含任何突變的野生型HIV-1病毒蛋白酶基因類型。1.寡核苷酸引物和探針的制備表I和表2顯示了本發(fā)明檢測(cè)HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變所用的引物和探針的序列，均委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。表I HIV-1病毒蛋白酶基因區(qū)段擴(kuò)增引物
引物編號(hào)I引物序列(5’ -3’)
PMV-001 gagagcttcaggtctgggg PMV-002 CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT PMV-003 gaagcaggagccgatagaca
PMV-OI7 TAMRA-TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGGYTTYARTKTTACTGGTACAG表2 HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)探針
權(quán)利要求
1.檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針，其特征是: 包括以下11類特異性探針中的至少一類: 檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針，為SEQ ID NO:1飛中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針，為SEQ ID NO:7 14中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因M46I和M46L突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 15 31中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因I47V和I47A突變的特異性探針，為SEQ ID NO:32^40中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:41 46中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:47 52中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的特異性探針，為SEQ ID NO: 53 61中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針，為SEQ ID NO:62^81中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針，為SEQ ID NO:82 87中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針，為SEQ ID NO:88 93中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列； 檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針，為SEQ ID NO:94 99中的任意一種或任意一種的互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針，其特征是: 所述檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針中，SEQ ID NO: f 3中的任意一種針對(duì)第30位氨基酸殘基為D的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 4 6中的任意一種針對(duì)第30位氨基酸殘基為N的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 7、中的任意一種針對(duì)第32位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 4中的任意一種針對(duì)第32位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因Μ46Ι和M46L突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 15 17中的任意一種針對(duì)第46位氨基酸殘基為M的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 18 20中的任意一種針對(duì)第46位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ31中的任意一種是針對(duì)第46位氨基酸殘基為L(zhǎng)的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因I47V和Ι47Α突變的特異性探針中，SEQ ID NO:32^34中的任意一種是針對(duì)第47位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 35 37中的任意一種是針對(duì)第47位氨基酸殘基為A的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 38 40中的任意一種是針對(duì)第47位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:41 43中的任意一種是針對(duì)第48位氨基酸殘基為G的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 44 46中的任意一種是針對(duì)第48位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:47 49中的任意一種是針對(duì)第50位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:50^52中的任意一種是針對(duì)第50位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的特異性探針中，SEQ ID NO: 53 55中的任意一種是針對(duì)第54位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:56^61中的任意一種是針對(duì)第54位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針中，SEQ ID NO:62^66中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 67 69中的任意一種是針對(duì)第82 位氨基酸殘基為A的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:70^75中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為F的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 76 78中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為T的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 701中的任意一種是針對(duì)第82位氨基酸殘基為S的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針中，SEQ ID NO:82 84中的任意一種是針對(duì)第84位氨基酸殘基為I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:85^87中的任意一種是針對(duì)第84位氨基酸殘基為V的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針中，SEQ ID NO:88 90中的任意一種是針對(duì)第88位氨基酸殘基為N的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID Ν0:9Γ93中的任意一種是針對(duì)第88位氨基酸殘基為D的HIV-1蛋白酶基因； 所述檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針中，SEQ ID Ν0:94 96中的任意一種是針對(duì)第90位氨基酸殘基為L(zhǎng)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 97 99中的任意一種是針對(duì)第90位氨基酸殘基為M的HIV-1蛋白酶基因。
3.利用如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的特異性探針制備而成的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征是: 除了包括檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因Μ46Ι和M46L突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I47V和Ι47Α突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的特異性探針、檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的特異性探針外； 還包括表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交陽(yáng)性探針、HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征是: HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針、表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交陽(yáng)性探針的長(zhǎng)度均為15-35個(gè)核苷酸；所述探針的5’端均連接上10-40個(gè)寡聚dT。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述HIV-1蛋白酶基因內(nèi)標(biāo)探針為SEQ ID NO: 100所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列； 所述表面化學(xué)質(zhì)控探針 PBQC-003 為:HEX- poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2 ； 所述雜交陽(yáng)性質(zhì)控探針 PBQC-002 為:NH2-poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征是: 用于固定探針的載體為硅片、用各種功能基團(tuán)衍生的膜，或用各種功能基團(tuán)修飾的玻片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述載體為表面帶有醛基基團(tuán)修飾的玻片。
8.檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法，其特征是:包括以下步驟: 1)、利用所述試劑盒擴(kuò)增待測(cè)的人類免疫缺陷病毒基因組中的蛋白酶基因區(qū)段； 2)、將步驟I)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述試劑盒中的HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變特異性探針進(jìn)行雜交，確定待測(cè)人類免疫缺陷病毒所含的耐藥突變類型。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法，其特征是: PCR擴(kuò)增為套式不對(duì)稱RT-PCR，其中用外套引物進(jìn)行的PCR為RT-PCR，取擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)套引物擴(kuò)增的模板，用內(nèi)套引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增為不對(duì)稱PCR。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法，其特征是: 擴(kuò)增HIV-1病毒蛋白酶基因區(qū)段的內(nèi)套引物對(duì)，其下游引物的5’端標(biāo)記有熒光分子，且其5’端序列包含一段與HIV-1基因組及人類基因組序列無(wú)關(guān)的序列，使上下游引物的Tm值相差至少8-15° C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。具體而言，本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)人類免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐藥突變的探針，包括檢測(cè)蛋白酶基因D30N突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因V32I突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因M46I和M46L突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因I47V和I47A突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因G48V突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因I50V突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因I54V突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因I84V突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因N88D突變的探針、檢測(cè)蛋白酶基因L90M突變的探針。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103215348SQ20131008911
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者張瓊, 李蘭娟, 項(xiàng)春生, 吳南屏 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)