用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性mdck細(xì)胞系及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK細(xì)胞系及其篩選方法，所述細(xì)胞系為MDCK-2B2，保藏編號(hào)為CCTCCC201323。本發(fā)明提供了具非致瘤性的細(xì)胞系MDCK-2B2及其亞克隆細(xì)胞系，其生長成為貼壁細(xì)胞和/或具有上皮樣形態(tài)和/或能支持各種病毒的復(fù)制，能擴(kuò)增出較高滴度病毒；此外本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了篩選非致瘤性細(xì)胞系的方法，可以通過細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞的形態(tài)變化來輔助致瘤性的判斷，即生長相對(duì)緩慢的單孔細(xì)胞，其致瘤性會(huì)顯著降低，巨型細(xì)胞的出現(xiàn)會(huì)使得致瘤性顯著增加，在大規(guī)模篩選非致瘤性細(xì)胞系時(shí)，這樣的輔助判斷方法能縮短時(shí)間和節(jié)省成本。
【專利說明】用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK細(xì)胞系及其篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及MDCK衍生細(xì)胞系，更具體來說，涉及一種用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤 性MDCK細(xì)胞系及其篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 每年的流感流行無論對(duì)發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，都會(huì)帶來比較大的影響。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，在流感盛行的季節(jié)，全世界每年約5-15%的人會(huì)發(fā)生上呼吸道感染，約250， 000-500,000 的人會(huì)發(fā)生死亡[WHO. Influenza Fact Sheet www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs211/en/]。接種流感疫苗是預(yù)防和控制流感的主要措施之一，能顯著降低 發(fā)病率和死亡率，所以有效、快速地提供疫苗就顯得尤為重要。目前，大多數(shù)流感疫苗仍然 采用雞胚來生產(chǎn)WHO公布的毒株，由于在流感盛行的季節(jié)，可能存在雞胚供應(yīng)的短缺，從而 無法快速應(yīng)對(duì)大規(guī)模爆發(fā)的流感?？紤]到雞胚供應(yīng)的不確定性和可能存在潛在的禽流感 病毒，故在1995年，WHO建議采用更好的病毒擴(kuò)增方式來代替雞胚生產(chǎn)疫苗，他們首推哺乳 細(xì)胞培養(yǎng)體系[WHO. Cell culture as a substrate for the production of influenza vaccines: memorandum from a WHO metting. Bull. World He lath Organ. 73(4)， 431-435 (1995)]。用細(xì)胞生產(chǎn)疫苗來應(yīng)對(duì)突然爆發(fā)的流感，可以在短時(shí)間內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)，免 疫疫苗供應(yīng)鏈的短缺，也可以解決一部人對(duì)雞蛋過敏的問題。
[0003] 近年來，一些連續(xù)性的細(xì)胞系逐漸被用來生產(chǎn)流感疫苗，其中MDCK、Vero 及 PER. C6 [Alexander Doroshenko and Scott A Halperin. Trivalent MDCK Cell culture-derived influenza vaccine Optaflu-- (Novartis Vaccine). Expert Rev. Kacci/76^ 8 ￠), 679-688(2009)]細(xì)胞擴(kuò)增流感病毒的滴度較高，故成為生產(chǎn)流感病毒的 主要細(xì)胞株。蘇威制藥、巴克斯特、DynPort、Crucell、諾華、葛蘭素史克及Medlmmune等公 司先后進(jìn)行了用這其中一種細(xì)胞來生產(chǎn)流感疫苗的研究。其中，以MDCK細(xì)胞的研發(fā)成果 最為豐碩，先是在2001年蘇威制藥采用MDCK來生產(chǎn)的流感病毒裂解滅活苗獲得審批，后 來由于生產(chǎn)商的原因無法規(guī)?；鲜?，到了 2007年，諾華基于MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗 Optaflu得到歐洲藥品評(píng)價(jià)局的批準(zhǔn)，成功上市。Medlmmune公司研發(fā)的三價(jià)FluMist-- 在2003年得到了 FDA的批準(zhǔn)，但由于該藥物采用冷凍制劑，不利于運(yùn)輸，故無法上市。后來 他們對(duì)配方進(jìn)行了改變，變成冷藏運(yùn)輸，使得該三價(jià)疫苗于2007年1月份得到FDA的批 準(zhǔn)[Medlmmune, Inc. http://pressroom.medimmune.eom/press-releases/2007/01/08/f da-approves-medimmune-s-refrigerated-formulation-of-flumist-r/],隨后 Medlmmune 公司繼續(xù)致力該疫苗的研發(fā)，于2012年2月得到FDA批準(zhǔn)，生產(chǎn)首支四價(jià)的流感疫苗 [Medlmmune, Inc. http://pressroom, medimmune. com/press-releases/2012/02/29/ medimmune-announces-fda-approval-of-flumist%C2%AE-quadrivalent-influenza-vaccine-live-intranasal/] 〇
[0004] MDCK細(xì)胞被用于制造流感病毒疫苗，具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：首先是病毒生長的優(yōu) 勢(shì)，在MDCK細(xì)胞中能擴(kuò)增出滴度較高的流感病毒[Gaush & Smith，1968; Govorkova ei ，1999];其次，該工藝容易快速放大；第三是可以追溯和全面鑒定該細(xì)胞；第四該細(xì)胞 可以馴化成無血清培養(yǎng)。當(dāng)然，除此之外，可能還有一些更多的優(yōu)點(diǎn)導(dǎo)致廠商喜歡用這個(gè)細(xì) 胞來生產(chǎn)流感疫苗。
[0005] 對(duì)于Madin Darby狗腎（MDCK)細(xì)胞的來源，多種相對(duì)獨(dú)立的MDCK細(xì)胞曾被描述。 比較一致的是1958年從正常的雄性考克斯班尼犬（cocker spaniel)的腎臟建立了這些細(xì) 胞。ATCC列出了為S. Madin和N. B. Darby保藏的MDCK (CCL-34)細(xì)胞系，然而MDCK細(xì) 胞的其它許多譜系也可用。例如：1963 MDCK-USD 和 1961 MDCK-NIH [Gaush, PSEBM, 1996 122:931]。
[0006] 但在MDCK細(xì)胞的基質(zhì)方面也存在著一些爭論，例如：MDCK原先的細(xì)胞系都是非 致瘤性的；一些衍生自MDCK細(xì)胞的細(xì)胞系具有高致瘤性(有可能1-100個(gè)細(xì)胞就可能形成 腫瘤）；高致瘤性的細(xì)胞基質(zhì)還從未被用來生產(chǎn)病毒疫苗及高致瘤性的細(xì)胞基質(zhì)帶來了顯 著的監(jiān)管挑戰(zhàn)[FDA. Use of MDCK Cells for Manufacture of Inactivated Influenza Vaccines: Introduction]〇
[0007] 各大疫苗生產(chǎn)產(chǎn)家對(duì)MDCK的致瘤性也較為關(guān)注，蘇威制藥采用的MDCK細(xì)胞株注 射免疫缺陷的裸鼠后4到5周，會(huì)在注射部位會(huì)形成結(jié)節(jié)，注射的結(jié)節(jié)中具有犬腎細(xì)胞的特 質(zhì)且不誘發(fā)第二次腫瘤的形成，故他們認(rèn)為該細(xì)胞不具致瘤性，且對(duì)于生產(chǎn)滅活的、高度純 化的亞單位疫苗是安全的[R. Brands，J. Visser，ei InfluvacTC: A Safe Madin Darby Canine Kidney (MDCK) Cell Culture-Based Influenza Vaccine]。諾華生產(chǎn)的亞 單位滅活疫苗也考慮到了細(xì)胞致瘤性的問題，他們認(rèn)為非整倍體的連續(xù)細(xì)胞系有可能具有 致瘤性，故他們?cè)谫|(zhì)檢的過程中強(qiáng)調(diào)了殘留的完整細(xì)胞的檢查，工藝過程中徹底去除完整 的MDCK細(xì)胞，且使最后每劑疫苗的DNA殘留控制在10ng以下，從而杜絕了疫苗的致瘤性 [Alexander Doroshenko and Scott A Halperin. Trivalent MDCK cell culture-derived influenza vaccine Optaflu-- (Novartis Vaccine). Expert Rev. Vaccines 8(6)， 679 - 688 (2009)]。Medlmmune公司則因?yàn)樯a(chǎn)的是減毒活疫苗，所以他們對(duì)MDCK細(xì)胞的 致瘤性更為關(guān)注，他們采用有限稀釋法篩選出MDCK 9B9-1E4細(xì)胞株，他們對(duì)其非致瘤性進(jìn) 行了驗(yàn)證，用1〇7的MDCK 9B9-1E4細(xì)胞及107細(xì)胞對(duì)應(yīng)的細(xì)胞裂解物和100μ g / animal 的量注射免疫缺陷的裸鼠，觀察期為六個(gè)月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在觀察期末，裸鼠的瘤體都發(fā)生了消 亡[Jonathan Liu, Sachin Mani et al. Cloning and assessment of tumorigenicity and oncogenicity of a Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell line for influenza vaccine production. Vaccine 28 (2010) 1285 - 1293.]。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK細(xì) 胞系。
[0009] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是，提供用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK 細(xì)胞系的篩選方法。
[0010] 本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是，提供非致瘤性MDCK細(xì)胞系在擴(kuò)增流感病 毒中的應(yīng)用。
[0011] 為了解決上述第一個(gè)問題，本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK 細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為MDCK-2B2,保藏編號(hào)為CCTCC C201323。
[0012] 為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK 細(xì)胞系的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 改進(jìn)的有限稀釋法，對(duì)ATCC CCL-34 MDCK進(jìn)行傳代保存后，采用有限稀釋法進(jìn)行單 克隆的篩選，為了保證每個(gè)96孔板中，細(xì)胞數(shù)< 1,鋪板時(shí)的細(xì)胞數(shù)設(shè)定為< 50,且在鋪板 完畢后立即進(jìn)行單孔的檢查，確定細(xì)胞數(shù)為1的單孔，作上相應(yīng)標(biāo)記，對(duì)標(biāo)記好的單孔細(xì)胞 適當(dāng)補(bǔ)液； (2) 篩選非致瘤性細(xì)胞株，觀察步驟（1)獲得的單孔細(xì)胞，通過細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞 的形態(tài)變化來輔助致瘤性的判斷，挑選生長相對(duì)緩慢的細(xì)胞，且形態(tài)正常、無巨大細(xì)胞的單 克隆細(xì)胞株對(duì)SPF級(jí)的裸鼠進(jìn)行注射，篩選出瘤體消亡的細(xì)胞株，對(duì)于非致瘤性細(xì)胞株進(jìn) 行病理切片的進(jìn)一步確認(rèn)； (3) 建立細(xì)胞庫。
[0013] 為了解決上述第三個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK 細(xì)胞系在擴(kuò)增流感病毒中的應(yīng)用。
[0014] 作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述流感病毒是甲型流感病毒。
[0015] 本發(fā)明細(xì)胞系分類命名為：MDCK-2B2,保藏編號(hào)為：CCTCC C201323,保藏單位為： 中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué)中國 典型培養(yǎng)物保藏中心郵編430072)，保藏日期為：2013年3月5日。
[0016] 本發(fā)明細(xì)胞系衍生自ATCC CCL-34 MDCK，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法衍生自 ATCC CCL-34 MDCK細(xì)胞。例如，CCL-34 MDCK細(xì)胞可以首先在含血清的培養(yǎng)基中（Minimum essential medium + 10%胎牛血清（FBS)+ 2mM谷氨酰胺)傳代有限次數(shù)，然后克隆各細(xì)胞 并鑒定各克隆。選出具有優(yōu)良生物學(xué)和生理特征(包括但不限于倍增時(shí)間、致瘤性情況和病 毒產(chǎn)量）的克隆來產(chǎn)生原始細(xì)胞庫（MCB)。
[0017] 通過有限稀釋法篩選出MDCK細(xì)胞的各克隆，并將各克隆逐漸放大，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到 一定規(guī)模時(shí)，進(jìn)行非致瘤性的測(cè)定。非致瘤性利用成年裸小鼠模型進(jìn)行測(cè)定，消化好的細(xì)胞 必須精確計(jì)數(shù)、冰上放置且在消化后半小時(shí)內(nèi)注射裸鼠，注射量為l〇 7cells/200y L/mice。
[0018] 定期觀察注射MDCK細(xì)胞單克隆的裸鼠，在注射的部位會(huì)產(chǎn)生結(jié)節(jié)，用游標(biāo)卡尺定 期測(cè)量結(jié)節(jié)的大小(參照正常瘤體體積計(jì)算公式：一般瘤體體積=長X寬X厚（mm 3)，由于 是長期監(jiān)測(cè)，沒有將瘤體剝離，故采用長X寬的值表示)。有的細(xì)胞(例：MDCK-2B2)形成的 結(jié)節(jié)在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生消亡；有的細(xì)胞形成的結(jié)節(jié)消亡的時(shí)間則較長；絕大多數(shù)的細(xì)胞 在觀察期（6個(gè)月）結(jié)束時(shí)，結(jié)節(jié)沒有消亡，反而持續(xù)增大，即誘導(dǎo)了瘤體的分化與轉(zhuǎn)移。
[0019] 將在觀察期內(nèi)瘤體消亡的細(xì)胞傳代幾次、以相同的量再次注射成年裸鼠，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)結(jié)節(jié)消亡的時(shí)間較年輕代次的細(xì)胞相比，明顯延長，相當(dāng)部分的細(xì)胞甚至出現(xiàn)在觀察期 內(nèi)瘤體無法消亡的情況。MDCK-2B2細(xì)胞經(jīng)過四次的致瘤性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞在觀察期內(nèi)結(jié) 節(jié)消亡，但隨著代次的提高，結(jié)節(jié)消亡的時(shí)間明顯延長。
[0020] 本發(fā)明對(duì)MDCK-2B2細(xì)胞系的生長密度進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其生長的最高密度跟 MDCK相當(dāng)。
[0021] 對(duì)MDCK-2B2細(xì)胞系感染流感H1N1后HA滴度的產(chǎn)生情況進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與 MDCK相當(dāng)。
[0022] 對(duì)MDCK-2B2細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步克隆，篩選出的多個(gè)克隆(例：MDCK-2B2-2G5及 MDCK-2B2-2G6等)，以下簡稱MDCK-2B2亞克隆，利用成年裸小鼠模型進(jìn)行非致瘤性測(cè)定，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)注射裸鼠形成的結(jié)節(jié)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生消亡。
[0023] 對(duì)MDCK-2B2亞克隆進(jìn)行了生長密度的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其生長的最高密度與 MDCK-2B2 相當(dāng)。
[0024] 對(duì)MDCK-2B2亞克隆感染流感H1N1后HA滴度的產(chǎn)生情況進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與 MDCK-2B2 相當(dāng)。
[0025] 故認(rèn)為MDCK-2B2及MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞系均滿足非致瘤性、生長情況良好及適 宜病毒的復(fù)制。
[0026] MDCK-2B2及MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞能在含血清的培養(yǎng)基中生長為貼壁細(xì)胞。
[0027] MDCK-2B2及MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞的每一代和每次傳代記錄應(yīng)足夠詳細(xì)，從而使 得各細(xì)胞系都有完整譜系可用。
[0028] 此外，本發(fā)明也提供篩選非致瘤性細(xì)胞株的詳細(xì)方法，所述細(xì)胞具有多種具體特 征，包括但不限于：非致瘤性細(xì)胞(例如，在裸小鼠中形成小結(jié)后自動(dòng)消亡）和/或生長成為 貼壁細(xì)胞和/或具有上皮樣形態(tài)和/或能支持各種病毒(包括但不限于流感病毒）復(fù)制。
[0029] 本發(fā)明篩選非致瘤性細(xì)胞株的方法區(qū)別于傳統(tǒng)的有限稀釋法篩選單克隆，細(xì)胞衍 生自ATCC CCL-34 MDCK，對(duì)于ATCC CCL-34 MDCK進(jìn)行傳代保存后，采用有限稀釋法篩進(jìn)行 單克隆的篩選。為了保證每個(gè)96孔板中，細(xì)胞數(shù)< 1,鋪板時(shí)的細(xì)胞數(shù)設(shè)定為< 50,且在鋪 板完畢后立即進(jìn)行單孔的檢查，確定細(xì)胞數(shù)為1的單孔，作上相應(yīng)標(biāo)記。
[0030] 選擇在鋪板完畢后立即進(jìn)行標(biāo)記，可以避免單個(gè)細(xì)胞沉降后不宜觀察的現(xiàn)象。
[0031] 對(duì)標(biāo)記好的單孔細(xì)胞適當(dāng)補(bǔ)液，一周后觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生長情況存在顯著差異， 有的單孔細(xì)胞發(fā)生凋亡，存活的單孔細(xì)胞在生長速度上也有較大區(qū)別。
[0032] 在對(duì)擴(kuò)增出的單孔細(xì)胞注射后發(fā)現(xiàn)，生長相對(duì)緩慢的單孔細(xì)胞，其致瘤性會(huì)顯著 降低。
[0033] 對(duì)第一次注射后在觀察期內(nèi)結(jié)節(jié)消亡的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)隨著代次的升高，細(xì) 胞的規(guī)則形態(tài)會(huì)有部分發(fā)生改變，會(huì)出現(xiàn)巨型細(xì)胞，伴隨著這些不規(guī)則體的出現(xiàn)，細(xì)胞的致 瘤性會(huì)顯著增加。
[0034] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明提供了具非致瘤性的細(xì)胞系MDCK-2B2及其亞克隆細(xì) 胞系，其生長成為貼壁細(xì)胞和/或具有上皮樣形態(tài)和/或能支持各種病毒(包括但不限于流 感病毒）復(fù)制，能擴(kuò)增出較高滴度病毒；此外本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了篩選非致瘤性細(xì)胞系的方法，可 以通過細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞的形態(tài)變化來輔助致瘤性的判斷，即生長相對(duì)緩慢的單孔細(xì) 胞，其致瘤性會(huì)顯著降低，巨型細(xì)胞的出現(xiàn)會(huì)使得致瘤性顯著增加，在大規(guī)模篩選非致瘤性 細(xì)胞系時(shí)，這樣的輔助判斷方法能縮短時(shí)間和節(jié)省成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1概述了用于衍生MDCK-2B2的技術(shù)路線。實(shí)施例1詳述了該方法。
[0036] 圖2是顯示MDCK-2B2細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)的照片。該照片拍攝自接種后3天。
[0037] 圖3是MDCK-2B2及ATCC購買的MDCK (以下簡稱MDCK)在10%FBS MEM培養(yǎng)基中 的生長曲線。MDCK-2B2細(xì)胞具有約2天的潛伏期，然后是指數(shù)生長期，接種后第四天進(jìn)入 穩(wěn)定期，第四天達(dá)到約22X 105個(gè)細(xì)胞的最高密度，經(jīng)歷過平臺(tái)期后，于第七天進(jìn)入衰退期； MDCK細(xì)胞具有約1天的潛伏期，然后是指數(shù)生長期，接種后第三天進(jìn)入穩(wěn)定期，第六天達(dá)到 約24. 7Χ105個(gè)細(xì)胞的最高密度，經(jīng)歷過平臺(tái)期后，于第七天進(jìn)入衰退期。
[0038] 圖4是MDCK及MDCK-2B2細(xì)胞在10%FBS MEM培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生 的圖片。葡萄糖在第三天檢測(cè)時(shí)消耗完全，而乳酸在第二天開始產(chǎn)生。
[0039] 圖5是MDCK及MDCK-2B2細(xì)胞在10%FBS MEM培養(yǎng)基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及 氨氣產(chǎn)生的圖片。
[0040] 圖6是顯示MDCK-2B2細(xì)胞接種不同滴度（m. 〇. i分別為0. 01和0. 001)的H1N1病 毒后，HA滴度的檢測(cè)情況。實(shí)施例2詳述了該方法。
[0041] 圖7是不同代次的MDCK-2B2細(xì)胞注射裸鼠后形成的結(jié)節(jié)在體內(nèi)消亡的時(shí)間。實(shí) 施例3詳述了該方法。
[0042] 圖8是較高代次的MDCK-2B2 ( P102)細(xì)胞注射裸鼠一周后剝離的結(jié)節(jié)（12個(gè)標(biāo) 本）所做的石蠟包塊和切片圖。
[0043] 圖9是MDCK-2B2細(xì)胞建立主庫和工作庫后外源因子的檢測(cè)情況。實(shí)施例4詳述 了該方法。
[0044] 圖10是顯示MDCK-2B2細(xì)胞的亞克隆接種不同滴度（m. 〇. i分別為0. 01和0. 001) 的H1N1病毒后，HA滴度的檢測(cè)情況。
[0045] 圖11是顯示MDCK-2B2細(xì)胞的亞克隆的生長情況。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無 特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途 徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室 手冊(cè)（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。
[0047] 實(shí)施例1、具有非致瘤性MDCK-2B2細(xì)胞系的獲得 一、MDCK單克隆細(xì)胞的獲得 1、細(xì)胞的消化與記數(shù) 將ATCC CCL-34 MDCK P55在含血清的培養(yǎng)基中（Minimum essential medium + 10%胎 牛血清（FBS)+ 2mM谷氨酰胺)傳代有限次數(shù)，MDCK P63代細(xì)胞，選取一瓶T-25細(xì)胞進(jìn)行消 化與記數(shù)。
[0048] 取MDCK Ρ63 -瓶Τ-25細(xì)胞，棄培養(yǎng)上清，采用lmL胰酶(購自Gibco公司）洗滌 兩遍，然后加入lmL胰酶，放入C02培養(yǎng)箱孵育，15min后鏡下觀察細(xì)胞變圓，加入9mL培養(yǎng) 基終止消化，混勻細(xì)胞懸液，取10 μ L滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0049] 2、細(xì)胞密度的調(diào)整與鋪板 為了保證96孔細(xì)胞板中無單孔多克隆的存在，鋪板時(shí)減少細(xì)胞總數(shù)，每塊96孔板的細(xì) 胞總數(shù)為50,每孔的加液量為200μ?或lOOyL，經(jīng)過比較，加入lOOyL的液體量，更易觀 察96孔板中的細(xì)胞，即細(xì)胞密度調(diào)整為50〇6118/10(^1^\96~5〇6118/1^。將鋪好的細(xì) 胞板及時(shí)在鏡下觀察(這點(diǎn)極為重要，細(xì)胞沉降后無法觀察到細(xì)胞板孔內(nèi)的情況，從而無法 確定后期擴(kuò)增的細(xì)胞是源自于單克隆還是多克隆)，對(duì)于單個(gè)細(xì)胞的孔做好標(biāo)記，放入co2 培養(yǎng)箱孵育，為了減少液體的揮發(fā)，同時(shí)放入濕盒或?qū)?6孔細(xì)胞板定期補(bǔ)液。
[0050] 3、單克隆細(xì)胞的篩選 定期觀察鋪好的細(xì)胞板，一周后，細(xì)胞的生長狀態(tài)存在顯著差異，有的發(fā)生凋亡，存活 單克隆多數(shù)匯合率達(dá)80%以上，消化后轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。剩下極少數(shù)的生長相對(duì) 緩慢的細(xì)胞在96孔細(xì)胞板上繼續(xù)生長。
[0051] 二、MDCK單克隆細(xì)胞的起始生長速率、細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞致瘤性相關(guān) 1、起始生長速率與致瘤性呈負(fù)相關(guān) 采用"實(shí)施例1 MDCK單克隆細(xì)胞的獲得"的方法，將篩選得到的多株細(xì)胞株擴(kuò)增后注 射裸鼠，從裸鼠致瘤性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，只有極少數(shù)在96孔細(xì)胞板中生長較為緩慢的細(xì)胞 能在較短時(shí)間內(nèi)消褪注射細(xì)胞所形成的結(jié)節(jié)，圖3也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，MDCK-2B2的起始生長 速率較MDCK慢。
[0052] 2、細(xì)胞的形態(tài)與致瘤性相關(guān) 對(duì)于多株細(xì)胞展開實(shí)驗(yàn)，從裸鼠致瘤性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，相同的細(xì)胞株在代次較低時(shí) 能在較短時(shí)間內(nèi)消褪注射細(xì)胞所形成的結(jié)節(jié)，而傳代幾次后，在觀察期內(nèi)無法消除形成的 結(jié)節(jié)，有的結(jié)節(jié)甚至持續(xù)變大、發(fā)生轉(zhuǎn)移即二次誘發(fā)腫瘤的形成。仔細(xì)觀察相同的細(xì)胞株代 次較低時(shí)，形態(tài)規(guī)則，無巨型細(xì)胞形態(tài)的存在，而傳代幾次后則有巨型細(xì)胞的存在，這些不 規(guī)則的細(xì)胞體演變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。
[0053] 傳統(tǒng)篩選方法中，通過有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株后，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，注射 裸鼠，部分裸鼠結(jié)節(jié)消褪前進(jìn)行切片分析，剩余部分裸鼠繼續(xù)觀察，6個(gè)月內(nèi)瘤體消亡的為 非致瘤性細(xì)胞株。
[0054] 本發(fā)明細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞的形態(tài)變化來輔助致瘤性的判斷，定期觀察鋪好的 細(xì)胞板，一周后，細(xì)胞的生長狀態(tài)存在顯著差異，有的發(fā)生凋亡，存活單克隆多數(shù)匯合率達(dá) 80%以上，消化后轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。剩下極少數(shù)的生長相對(duì)緩慢的細(xì)胞在96孔細(xì) 胞板上繼續(xù)生長。經(jīng)過多次注射裸鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總發(fā)現(xiàn)，剩下的生長相對(duì)緩慢的細(xì)胞致 瘤性顯著降低，在注射裸鼠時(shí)可以挑選生長緩慢的細(xì)胞，這無疑縮減了篩選非致瘤性細(xì)胞 株的時(shí)間與成本。篩選出的非致瘤性細(xì)胞株在傳代后，隨著代次的增加，致瘤性的概率會(huì)增 力口，我們篩選出的非致瘤性細(xì)胞株有的傳代25代后還是保持非致瘤性，有的傳代2代后就 具有非致瘤性，在傳代穩(wěn)定性測(cè)試過程中我們發(fā)現(xiàn)，傳代后，巨型細(xì)胞較多的細(xì)胞株致瘤性 會(huì)顯著增加，這為我們判斷是否篩選到了穩(wěn)定的非致瘤性細(xì)胞株節(jié)省了時(shí)間。
[0055] 實(shí)施例2、MDCK-2B2細(xì)胞的生長形態(tài)和生化指標(biāo) 一、MDCK-2B2細(xì)胞具有上皮樣形態(tài) 取P85 MDCK-2B2進(jìn)行鏡下（40X )觀察，發(fā)現(xiàn)呈邊緣規(guī)則的梭形，貼壁細(xì)胞，具上皮樣 形態(tài)。
[0056] 二、MDCK-2B2具有較高的生長密度 接種相同其始密度（2. 5 X 105cel ls/5mL)的MDCK-2B2及MDCK于T-25的細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中，各7瓶，間隔24小時(shí)各抽取其中一瓶進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7天，MDCK-2B2在7 天中的細(xì)胞總數(shù)分別為：1. 8X105cells，2. 9X105cells，ll. 6X105cells，22X 105cells， 20X 105cells，20. 8X 105cells 和 10. 5X105cells ;MDCK 在 7 天中的細(xì)胞總數(shù)分別 為：2. 3X 105cells，4. 8X 105cells，19. IX 105cells，21X 105cells，23. 5X 105cells， 24.87X 105cells和14.5X105cells。如圖3所示，MDCK-2B2細(xì)胞具有約2天的潛伏期，然 后是指數(shù)生長期，接種后第四天進(jìn)入穩(wěn)定期，第四天達(dá)到約22X 105個(gè)細(xì)胞的最高密度，經(jīng) 歷過平臺(tái)期后，于第七天進(jìn)入衰退期；MDCK細(xì)胞具有約1天的潛伏期，然后是指數(shù)生長期， 接種后第三天進(jìn)入穩(wěn)定期，第六天達(dá)到約24. 7X 105個(gè)細(xì)胞的最高密度，經(jīng)歷過平臺(tái)期后， 于第七天進(jìn)入衰退期。
[0057] 從潛伏期來講，MDCK-2B2經(jīng)歷2天的潛伏期后進(jìn)入指數(shù)生長期，而MDCK則在經(jīng)歷 1天潛伏期后就進(jìn)入指數(shù)生長期，這也驗(yàn)證了實(shí)施例1中起始生長速率與致瘤性呈負(fù)相關(guān)。
[0058] MDCK-2B2第四天達(dá)到的最高密度為22X 105,接著維持三天的平臺(tái)期；MDCK第三 天進(jìn)入平臺(tái)期，密度為19. 1 X 105cells，維持四天的平臺(tái)期，第六天達(dá)到約24. 7X 105個(gè)細(xì) 胞的最高密度。對(duì)比平臺(tái)期的細(xì)胞密度，MDCK-2B2略低于MDCK。
[0059] 三、MDCK-2B2細(xì)胞生化指標(biāo) 接種相同起始密度（2. OX 106cells/40mL)的MDCK-2B2及MDCK于T-225的細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中，各1瓶，間隔24小時(shí)吸取lmL細(xì)胞上清于EP管中，放入Nova BioProfile 400生化 分析儀進(jìn)行分析，記錄葡萄糖（Glue)消耗、乳酸（Lac)產(chǎn)生；谷氨酰胺（Gin)消耗和谷氨酸 (Glu)及氨（NH4+)產(chǎn)生的情況。
[0060] 實(shí)施例3、MDCK-2B2細(xì)胞染色體的鑒定 1、 收獲細(xì)胞，〇. 85% NaCl溶液沖洗細(xì)胞壁兩遍； 2、 0.25% Trypsin-EDTA消化10-15分鐘，待細(xì)胞面出現(xiàn)肉眼可見皺形改變時(shí)即用 吸管吹打下細(xì)胞453g (1500rpm/min，eppendorf 5810R)室溫離心10分鐘，去上清，約留 0.5ml; 3、 低滲：加入37°C 0.075MKC1 4-6ml，吸管吹打，37°C水浴3-5分鐘 4、 預(yù)固定：加入1.5ml± (甲醇：冰醋酸=3:1)固定劑，輕混勻37°C水浴5分鐘453g (1500rpm/min, eppendorf 5810R)室溫離心 10 分鐘。去上清約留 0· 5ml ; 5、 固定：加入固定劑8ml ±，輕混勻，37°C水浴10分鐘，453g( 1500rpm/min, eppendorf 5810R)室溫離心10分鐘。去上清，約留0. 5ml ; 6、 重復(fù)固定：同上。453g(1500rpm/min，eppendorf 5810R)室溫離心10分鐘，去上清， 視管底細(xì)胞量加入適當(dāng)幾滴固定劑； 7、 滴片：每片1-2滴； 8、 烤片：75°C烤箱烘烤3小時(shí)； 9、 第二天行染色處理，并對(duì)染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0061] 實(shí)施例4、MDCK-2B2細(xì)胞產(chǎn)毒能力的檢定 1、細(xì)胞計(jì)數(shù) 傳代MDCK、MDCK-2B2 T-25各三瓶，三瓶的細(xì)胞密度與體積完全一致，2天后，觀察細(xì)胞 基本已長滿，拿出MDCK、MDCK-2B2 T-25各一瓶消化、計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。
[0062] 2、病毒接種 將剩下的四瓶細(xì)胞分別用PBS洗滌兩遍，加入無血清的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（*牛血清中含 有流感病毒的非特異性抑制素，會(huì)影響流感病毒的復(fù)制）+ TPCK-胰酶（*加適量的胰酶目 的是為了提高流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制能力，胰酶的工作濃度為2.5 μ g/mL)+病毒（按照 m. o. i值分別為1/100和1/1000,來計(jì)算病毒的接種量）。
[0063] 3、病毒的收毒和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 從病毒感染細(xì)胞24h小時(shí)開始收集細(xì)胞上清液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，向96孔血凝板孔 中加入50 μ L生理鹽水，然后加入50 μ L細(xì)胞上清液，每個(gè)樣品做兩個(gè)復(fù)孔，混勻，倍比稀釋 后，每孔加入1%紅細(xì)胞懸液50 μ L，30min后觀察血凝結(jié)果。每隔24h小時(shí)取樣一次，即分 別在24h、48h、72h和96h取樣。如圖6所示，當(dāng)24h取樣時(shí)，HA的滴度均為0,在48h、72h 和96h，m. 〇· i值為1/100時(shí)，MDCK產(chǎn)生的HA滴度比MDCK-2B2產(chǎn)生的HA滴度略高；m. 〇· i 值為1/1000時(shí)，48h時(shí)MDCK產(chǎn)生的HA滴度顯著高于與MDCK-2B2產(chǎn)生的HA滴度，72h時(shí) 兩者產(chǎn)生的HA滴度相當(dāng)，96h時(shí)MDCK產(chǎn)生的HA滴度略高。
[0064] 4、1%紅細(xì)胞懸液的制備 將雞血用生理鹽水洗漆3次，頭兩次1 500r/min離心5 min,最后1次同速離心lOmin， 棄上清，用無菌生理鹽水配成1%懸液，置4°C待用。一般置4°C能保存7天左右，一旦溶血 應(yīng)棄掉。
[0065] 實(shí)施例5、MDCK-2B2細(xì)胞非致瘤性的檢定 消化MDCK-2B2細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)基懸浮，將細(xì)胞密度調(diào)整為 5X 107cells/mL，注射：T4weeks SPF級(jí)成年裸鼠，每只裸鼠從皮下肩胛骨處注射200 μ L細(xì) 胞懸浮液，即每只裸鼠的細(xì)胞注射量為l〇7cells。
[0066] 一、MDCK-2B2連續(xù)傳代的非致瘤性的檢定 對(duì)于擴(kuò)增的MDCK克隆，按照107cells /200 μ L /mice的注射量注射裸鼠，定期測(cè)量結(jié) 節(jié)的形成與消褪情況。觀察期設(shè)定為6個(gè)月，各細(xì)胞株結(jié)節(jié)的形成與消褪情況存在顯著差 異。大部分細(xì)胞株在觀察期內(nèi)結(jié)節(jié)變大，即誘發(fā)二次腫瘤，有的甚至存在腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；少 部分細(xì)胞在2-eks時(shí)，形成的結(jié)節(jié)最大，隨后結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)逐漸消褪。經(jīng)過注射多株細(xì) 胞發(fā)現(xiàn)，在相同代次的情況下，注射MDCK-2B2后，消褪結(jié)節(jié)所需的時(shí)間最短。連續(xù)傳代后， 多數(shù)細(xì)胞有較低代次的非致瘤性轉(zhuǎn)變?yōu)檩^高代次的致瘤性，而MDCK-2B2在較高代次時(shí)仍 然在為期六個(gè)月的觀察期內(nèi)消褪結(jié)節(jié)，即能保持非致瘤性。如圖7所示，MDCK-2B2 P77注 射裸鼠后在注射部位形成的結(jié)節(jié)，在第23天發(fā)生消褪，MDCK-2B2 P79在注射第31天結(jié)節(jié) 消褪，P89在注射第109天結(jié)節(jié)消褪致瘤性，P100在注射第153天結(jié)節(jié)消褪。
[0067] 二、MDCK-2B2較高代次的非致瘤性的檢定 對(duì)MDCK-2B2連續(xù)傳代至P102,按照107cells /200 μ L /mice的注射量注射3?4weeks 成年裸鼠，注射一周后將結(jié)節(jié)剝離，保存在4%的福爾馬林溶液(市售37%的甲醛溶液10倍 稀釋）中，送復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系進(jìn)行切片鑒定。
[0068] 病理切片結(jié)果顯示(如圖8所示)，結(jié)節(jié)內(nèi)無腫瘤細(xì)胞的存在，故我們認(rèn)為MDCK-2B2 P102代無致瘤性。
[0069] 實(shí)施例6、MDCK-2B2細(xì)胞主庫與工作庫的建立 對(duì)于MDCK-2B2建立主庫和工作庫。對(duì)主庫進(jìn)行細(xì)胞鑒別定、致瘤性檢測(cè)及如圖9所示 進(jìn)行外源因子檢測(cè)；工作庫則進(jìn)行細(xì)胞鑒別和外源因子的檢測(cè)。
[0070] 細(xì)胞的鑒別實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞形態(tài)和染色體分析，對(duì)細(xì)胞連續(xù)傳代后觀察細(xì)胞形態(tài)， 細(xì)胞形態(tài)正常，無顯著變化。對(duì)于MDCK-2B2不同代次的細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，發(fā)現(xiàn)染色體 數(shù)目與ATCC購買的MDCK細(xì)胞一致。
[0071] 外源因子的檢測(cè)，包括無菌試驗(yàn)、細(xì)胞法檢測(cè)病毒外源因子及用動(dòng)物和雞胚檢測(cè) 病毒因子。
[0072] -、無菌試驗(yàn)(無菌試驗(yàn)包括細(xì)菌、真菌和支原體） 1、細(xì)菌、真菌檢測(cè) a、將MDCK-2B2細(xì)胞懸液接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂斜 面各兩支（同時(shí)接種MEM培養(yǎng)基作為對(duì)照）;b.將接種后的培養(yǎng)基分成兩份，一份置30°C? 35°C培養(yǎng)14天；另一份置20°C?25°C培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生 長，結(jié)果顯示無細(xì)菌與真菌污染。
[0073] 2、支原體檢查 支原體半流體培養(yǎng)基在使用前應(yīng)煮沸10?15分鐘，冷卻至56°C左右，然后加入滅能新 生牛血清(培養(yǎng)基與血清體積比為8:2)，充分搖勻。支原體肉湯培養(yǎng)基無需煮沸，但使用前 亦應(yīng)同樣補(bǔ)加新生牛血清。接種供試品（MDCK-2B2細(xì)胞懸液），各接種4支，置36±1°C培 養(yǎng)21天。于接種后的第7天從4支中取2支進(jìn)行次代培養(yǎng)，每1支培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種支原體半 流體培養(yǎng)基及支原體肉湯培養(yǎng)基各2支，置36± 1°C培養(yǎng)21天，每隔3天觀察1次，結(jié)果顯 示無支原體污染。
[0074] 二、細(xì)胞法檢測(cè)病毒外源因子 1、細(xì)胞培養(yǎng)法直接觀察及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) 取MDCK主庫細(xì)胞混合瓶細(xì)胞樣品接種小方瓶6個(gè)，成片后觀察兩周。觀察末期取細(xì)胞 上清，加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液，置2?8°C 30分鐘，鏡檢細(xì)胞，再置20?25°C 30分鐘，血 吸附試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
[0075] 2、不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)檢查 取MDCK主庫細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清混合樣品接種MRC-5、VER0及不同代次的MDCK細(xì)胞(每 瓶細(xì)胞接種l〇7cells MDCK-2B2)，觀察末期取細(xì)胞上清，加入0. 5%雞紅細(xì)胞懸液，置2? 8°C 30分鐘，鏡檢細(xì)胞，再置20?25°C 30分鐘，鏡檢細(xì)胞；在培養(yǎng)第7天時(shí)，分別取每種接 種的單層細(xì)胞上清液各一瓶，分別接種于新鮮制備的相應(yīng)的單層細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)7天，觀 察細(xì)胞病變并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)。每種接種的單層細(xì)胞不得出現(xiàn)細(xì)胞病變， 血吸附試驗(yàn)應(yīng)均為陰性。
[0076] 三、用動(dòng)物和雞胚檢測(cè)病毒因子 1、注射乳鼠(工作庫不需檢測(cè)） 消化MDCK-2B2細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為107cells/mL，注射24h內(nèi)的乳鼠，腦內(nèi)注射一 窩，接種量為〇. 01 mL /只，定期觀察，累計(jì)觀察21天，發(fā)現(xiàn)全部存活；腹腔注射一窩，接種 量為0. 1 mL/只，定期觀察，累計(jì)觀察21天，發(fā)現(xiàn)全部存活。
[0077] 2、注射成鼠(工作庫不需檢測(cè)） 消化MDCK-2B2細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2X106 cells/mL，注射:Γ4 weeks的成鼠，腦 內(nèi)注射一窩，接種量為〇. 03 mL /只，定期觀察，累計(jì)觀察21天，發(fā)現(xiàn)全部存活；腹腔注射 一窩，接種量為〇. 5 mL/只，定期觀察，累計(jì)觀察21天，發(fā)現(xiàn)全部存活。
[0078] 3、注射雞胚(尿囊腔） 孵育雞胚至11日齡，在暗室內(nèi)用照蛋器照射，觀察氣室，標(biāo)記血管稀疏的部位，用打孔 器打孔，沿氣室垂直線向尿囊腔注射密度為5X106的MDCK-2B2 0.2 mL /只，共注射10只 雞胚，放孵蛋箱孵育，4天后，將雞胚取出，放4°C過夜(防止取尿囊液是戳破血管)，于第二天 從各個(gè)雞胚的注射處吸取澄清的尿囊液1〇〇 μ L。
[0079] 在96孔血凝板上每孔加入50 μ L生理鹽水，對(duì)應(yīng)孔加入50 μ L吸取的尿囊液，倍 比稀釋后，每孔加入50 μ L紅細(xì)胞懸液，結(jié)果顯示：尿液血凝試驗(yàn)為陰性。
[0080] 4、注射雞胚(卵黃囊） 孵育雞胚至6日齡，在暗室內(nèi)用照蛋器照射，觀察氣室，標(biāo)記血管稀疏的部位，用打孔 器打孔，沿氣室垂直線向尿囊腔相反的部位注射密度為2Χ106的MDCK-2B2 0. 5 mL/只(注 射后反抽發(fā)現(xiàn)有卵黃液，表明注射成功)，共注射10只雞胚，5天后，用照蛋器照射觀察，發(fā) 現(xiàn)雞胚全部存活。
[0081] 實(shí)施例7、MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞的鑒定 MDCK-2B2連續(xù)傳代至P102,無致瘤性，我們參照實(shí)施例一的方法，對(duì)其鋪板，以其選出 更優(yōu)的細(xì)胞株。
[0082] 一、MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞的非致瘤性的檢定 對(duì)于鋪板MDCK-2B2后形成的單克?。ㄒ韵潞喎Q為MDCK-2B2亞克?。┻M(jìn)行致瘤性檢定。 致瘤性檢定參照實(shí)施例5。
[0083] MDCK-2B2-2G5 P91 在注射后 43 天，結(jié)節(jié)消褪；MDCK-2B2-2G6 P92 在注射后 34 天，結(jié)節(jié)消褪；MDCK-2B2 P89在注射第109天結(jié)節(jié)消褪。相比而言，在代次相近的情況下， MDCK-2B2亞克隆消褪結(jié)節(jié)的時(shí)間明顯縮短。
[0084] 二、MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞的產(chǎn)毒能力的檢定 參照實(shí)施例4進(jìn)行MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞的產(chǎn)毒能力的檢定，如圖10所示， MDCK-2B2-2G6的產(chǎn)毒能力與MDCK-2B2相近。
[0085] 三、MDCK-2B2亞克隆細(xì)胞的生長密度的監(jiān)測(cè) 參照實(shí)施例2的第二部分，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，如圖11所示，MDCK-2B2-2G5及 MDCK-2B2-2G6的最高密度與MDCK-2B2相近。
[〇〇86] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為 MDCK-2B2,保藏編號(hào)為 CCTCC C201323。
2. 權(quán)利要求1所述用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK細(xì)胞系的篩選方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 改進(jìn)的有限稀釋法，對(duì)ATCC CCL-34 MDCK進(jìn)行傳代保存后，采用有限稀釋法進(jìn)行單 克隆的篩選，為了保證每個(gè)96孔板中，細(xì)胞數(shù)< 1,鋪板時(shí)的細(xì)胞數(shù)設(shè)定為< 50,且在鋪板 完畢后立即進(jìn)行單孔的檢查，確定細(xì)胞數(shù)為1的單孔，作上相應(yīng)標(biāo)記，對(duì)標(biāo)記好的單孔細(xì)胞 適當(dāng)補(bǔ)液； (2) 篩選非致瘤性細(xì)胞株，觀察步驟（1)獲得的單孔細(xì)胞，通過細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞 的形態(tài)變化來輔助致瘤性的判斷，挑選生長相對(duì)緩慢的細(xì)胞，且形態(tài)正常、無巨大細(xì)胞的單 克隆細(xì)胞株對(duì)SPF級(jí)的裸鼠進(jìn)行注射，篩選出瘤體消亡的細(xì)胞株，對(duì)于非致瘤性細(xì)胞株進(jìn) 行病理切片的進(jìn)一步確認(rèn)； (3) 建立細(xì)胞庫。
3. 權(quán)利要求1所述用于擴(kuò)增流感病毒的非致瘤性MDCK細(xì)胞系在擴(kuò)增流感病毒中的應(yīng) 用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的在擴(kuò)增流感病毒中的應(yīng)用，其特征在于，所述流感病毒是甲 型流感病毒。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104059873SQ201310089164
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月20日
【發(fā)明者】陳則, 楊梅 申請(qǐng)人:上海生物制品研究所有限責(zé)任公司